正常肾上腺和嗜铬细胞瘤中一个新的全长基因的克隆和功能分析

一、正常肾上腺和嗜铬细胞瘤新全长基因的克隆及功能分析（论文文献综述）

尹绪龙^[1]（2020）在《嗜铬细胞瘤/副神经节瘤2017版WHO肾上腺肿瘤分类标准下临床病理再评价的单中心研究》文中研究表明目的:在2017版WHO肾上腺肿瘤新分类标准下比较嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma,PHEO）/副神经节瘤（paraganglioma,PGL）的临床表现、病理特点、实验室检查等方面的差异,以期提高PHEO患者与PGL患者的诊治水平,进一步评价新版分类标准下GAPP评分系统的临床应用价值。方法:研究对象为青岛大学附属医院泌尿外科收治（2008年7月至2018年12月）PHEO/PGL患者,所有患者均行手术治疗并经术后病理确诊,回顾性分析患者临床资料及病理检查、实验室检查等结果。最终共纳入306例PHEO/PGL患者,将306例PHEO/PGL患者按照2017版WHO肾上腺肿瘤新分类标准进行重新分类,比较嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma,PHEO）/副神经节瘤（paraganglioma,PGL）的临床表现、病理特点、实验室检查等方面的差异。同时按照日本学者新提出的评分系统（GAPP评分）重新分类为高、中、低分化组,比较不同分组患者的临床、病理情况。采用Spearman秩相关分析PNMT免疫组化染色定性结果与GAPP评分之间的相关性。结果:本研究最终纳入306例PHEO/PGL患者,其中PHEO患者232例,PGL患者74例。PHEO/PGL患者中出现高血压症状的有244例（占79.74%）,具有典型三联征（头痛、心悸、多汗）表现者76例（占24.84%）。对两组患者的临床特征进行比较,发现PHEO患者持续性高血压症状的比例明显低于PGL患者（37.1%vs 63.5%,P<0.001）;PGL患者中体重减轻比例高于PHEO患者（25.7%vs 13.8%,P=0.017）。对两组患者的实验室检查结果进行比较,PHEO患者的去甲肾上腺素（NE）水平低于PGL患者（274.7 vs 173.0ug/24h,P<0.05）。对306例PHEO/PGL患者进行GAPP评分,结果显示306例患者的GAPP评分为（3.3±1.8）分,PHEO患者GAPP评分低于PGL患者的[（3.0±1.9分）vs（3.5±1.7）分]（P<0.05）;对两组患者病理结果进行比较,发现PHEO患者的血管/包膜侵犯率、分泌NE的比例明显低于PGL患者,分泌肾上腺素（E）的比例高于PGL患者,差异有统计学意义（均P<0.05）。PNMT免疫组化定性评分与GAPP评分之间存在负相关关系。按照GAPP评分标准进行分级,306例患者被分为高分化组（74例,占24.18%）、中分化组（189例,61.76%）、低分化组（43例,14.05%）。将三组的临床症状进行比较,发现三组患者的高血压症状、三联征症状、体重减轻、视物模糊、糖耐量异常、心肌损伤、脑梗死、肾功能不全比例差异有统计学意义（P均<0.05）;对三组的实验室检查结果进行比较,发现低分化组的肾上腺素水平、去甲肾上腺素水平、多巴胺水平均高于高、中分化组,低分化组的尿肌酐浓度也高于其他两组（P均<0.05）,其他实验室指标差异无统计学意义（P均>0.05）。结论:1.PHEO患者与PGL患者的临床表现、病理特点、实验室检查结果存在一定的差异,PGL患者中出现持续性高血压的比例更大,且PGL患者的去甲肾上腺素（NE）水平高于PHEO患者。2.PNMT免疫组化定性评分与GAPP评分之间存在负相关关系。GAPP分级与患者的临床症状、实验室检查结果有关,提示GAPP分级对临床有一定的指导意义。

李敏^[2]（2017）在《二甲双胍新机制研究 ——二甲双胍抑制肾上腺嗜铬细胞瘤生长的作用及机制研究》文中提出研究背景:嗜铬细胞瘤（Pheochromocytoma,PHEO）是一种起源于神经外胚层嗜铬组织的神经内分泌肿瘤,主要合成和分泌大量儿茶酚胺,引起高血压、头痛、心悸等一系列临床症候群,并可损害心、脑、肾等重要脏器的功能。肿瘤位于肾上腺称为嗜铬细胞瘤,位于肾上腺外则称为副神经节瘤。目前,在治疗上,手术切除仍然是根治肾上腺嗜铬细胞瘤的主要方法,肾上腺嗜铬细胞瘤切除术后,大约90%以上的患者能够获得5年无病生存。然而,由于目前仍缺乏有效手段鉴别嗜铬细胞瘤的良恶性程度,而转移性肾上腺嗜铬细胞瘤患者的预后非常差,5年生存率低于35%。因此,其临床治疗仍是临床面临的一项重大挑战。近年来,人群数据分析结果发现,一线降糖药物二甲双胍可以明显降低2型糖尿病患者的肿瘤发生风险及肿瘤相关死亡率。因此,二甲双胍的抗肿瘤效应受到越来越多的关注,并且认为其潜在的抗肿瘤作用是独立于其降血糖作用。此外,细胞学和动物实验的结果亦证实,二甲双胍可显着抑制包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤细胞的生长和增殖。鉴于目前肾上腺嗜铬细胞瘤的治疗局限性,二甲双胍作为一种相对价廉、安全的临床药物,探索其对肾上腺嗜铬细胞瘤生长的可能作用,对这类疾病的预防和治疗均具有重要的科学意义和现实意义。研究目的1.以体外培养的嗜铬细胞瘤细胞株为模型,探讨二甲双胍对嗜铬细胞瘤生长的影响;2.以裸鼠成瘤为动物模型,探讨二甲双胍对嗜铬细胞瘤生长的抑制作用;3.从分子水平探讨二甲双胍抑制嗜铬细胞瘤生长的可能机制。研究方法1.体外细胞实验:采用CCK-8法检测不同浓度的二甲双胍对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）活力以及生长曲线的影响;利用EDU染色检测不同浓度的二甲双胍对PC12细胞增殖的影响;采用Annexin V-FITC/PI染色进而在荧光显微镜下观察,并结合流式细胞仪分析,检测不同浓度的二甲双胍对PC12细胞凋亡的影响;采用PI染色,检测不同浓度的二甲双胍对PC12细胞周期的影响;2.体内动物实验:饲养裸鼠,给予皮下注射PC12细胞,以构建肾上腺嗜铬细胞瘤的裸鼠皮下肿瘤种植模型,进而分别给予裸鼠二甲双胍和对照溶剂处理,检测二甲双胍对肿瘤生长的影响;3.机制初步探讨:利用蛋白免疫印迹（Western Blot）和荧光实时定量PCR（Realtime PCR）等方法,检测细胞内信号通路的激活或抑制,检测与细胞周期相关基因的表达,探讨二甲双胍抑制肾上腺嗜铬细胞瘤生长的分子机制。研究结果1.二甲双胍能够抑制体外培养的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的活力和增殖:CCK-8结果显示,二甲双胍能够显着抑制PC12细胞的活力,且具有浓度依赖性和时间依赖性,即在浓度上,二甲双胍抑制增殖的最佳作用浓度为5m M;在时间上,二甲双胍的最佳作用时间为48小时;EDU染色后流式细胞仪检测结果显示,二甲双胍能够显着抑制PC12细胞的增殖,且具有浓度依赖性。2.二甲双胍能够促进体外培养的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的凋亡:Annexin VFITC/PI染色,进而在荧光显微镜下观察并结合流式细胞仪分析表明,二甲双胍能够促进PC12细胞的凋亡,且具有浓度依赖性,即:其促进PC12细胞早期凋亡的最有效浓度为5m M,早期凋亡率约为55%。3.二甲双胍抑制肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的细胞周期:流式细胞仪检测发现二甲双胍能够显着抑制PC12细胞从G0/G1期进入S期、阻止其细胞周期的进行。4.二甲双胍能够抑制肾上腺嗜铬细胞瘤移植瘤的生长:PC12细胞接种于裸鼠皮下以形成瘤块;构建嗜铬细胞瘤裸鼠移植瘤模型。二甲双胍给药裸鼠后,其皮下肿瘤生长速度减缓,表现在:14天后,瘤块体积较对照组明显减小。5.荧光实时定量Real-time PCR检测示,二甲双胍处理PC12细胞后,Ccna2,Ccnb2等基因的表达量显着降低,提示二甲双胍抑制肾上腺嗜铬细胞瘤细胞增殖的机制可能与Ccna2,Ccnb2的表达下调、阻止细胞从G0/G1期进入S期密切相关。6.二甲双胍影响肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞中AMPK/m TOR信号通路:免疫印迹检测发现二甲双胍处理PC12细胞后,显着促进AMPK的磷酸化水平,降低ERK1/2、m TORC1的磷酸化水平。研究结论本研究首次报道了二甲双胍对肾上腺嗜铬细胞瘤生长的抑制作用,即:体外细胞实验证实二甲双胍能够抑制肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的增殖和细胞周期,促进其凋亡;体内动物实验发现二甲双胍能够抑制肾上腺嗜铬细胞瘤裸鼠移植瘤的生长,从整体水平证实了二甲双胍对肾上腺嗜铬细胞瘤生长的抑制作用。进一步,通过分子水平的研究,我们发现二甲双胍抑制肾上腺嗜铬细胞瘤生长的主要机制可能包括:下调肾上腺嗜铬细胞瘤细胞中Ccna2、Ccnb2等细胞周期蛋白的表达,从而抑制肾上腺嗜铬细胞瘤细胞G0/G1期进入S期;此外,二甲双胍抑制肾上腺嗜铬细胞瘤生长的机制还与其激活AMPK信号通路、抑制m TORC1及ERK1/2信号通路有关。综上所述,我们的研究结果表明,二甲双胍具有潜在抑制肾上腺嗜铬细胞瘤生长的作用,将有可能成为肾上腺嗜铬细胞瘤药物治疗的新选择。因此,本研究为二甲双胍的抗肿瘤效应提供了新的证据,为内分泌相关肿瘤的临床治疗提供新的思路和理论依据。

张德才^[3]（2013）在《SDHB在结直肠癌中的表达及功能研究》文中指出研究背景与目的：结直肠癌是世界上第三大常见的恶性肿瘤,全球每年新发病例约120万例,死亡人数达60万。在我国,结直肠癌位居恶性肿瘤死亡率第四位。近年来,我国结直肠癌的发病和死亡呈明显上升趋势。结直肠癌的发生、发展是一个涉及多基因、多步骤、多阶段的复杂过程。80%以上的结直肠癌是从腺瘤癌变而来,而从腺瘤的发生至癌变的发生、发展,主要涉及癌基因、抑癌基因、错配修复基因等三类基因的变化。其中抑癌基因的异常在结直肠癌的发生发展中起关键作用,其失活或缺失可导致细胞去调节性生长,克隆性扩张。因此,在结直肠癌病因学研究中,有必要寻找与其发生、发展相关的抑癌基因,探讨其在疾病发生发展中的作用,进一步从分子水平阐明结直肠癌的发病机制,为疾病的早发现、早诊断和早治疗提供重要的理论基础。本课题组前期研究采用荧光差异双向电泳技术构建了不同临床分期结直肠癌蛋白质差异表达谱,发现琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase, SDH）是结直肠癌发病过程中一个差异表达蛋白质分子,可能具有潜在的抑癌功能。SDH也称为线粒体复合物Ⅱ,定位于线粒体内膜,是由A、B、C、D四个亚基组成的异源四聚体,分别由相应的核基因编码。SDH是三羧酸循环和线粒体呼吸链的组成部分,其在细胞能量代谢中起到重要的作用。SDH作为一个抑癌基因,其基因缺陷或表达异常与多种疾病的发生有关,如副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、肾癌、胃肠道间质瘤、Leigh综合征等。前期研究中我们利用免疫组化技术检测了包含103例病例的结直肠组织芯片中SDH的表达情况,发现SDHB蛋白在结直肠癌组织的表达较正常结直肠粘膜明显下调,且SDHB在低分化结直肠癌组织中表达较中、高分化癌组织明显减弱。目前对SDH基因在结直肠癌发生发展中的作用及机制国内外尚未见报道。本课题在前期工作的基础上,扩大样本量检测SDHB在低分化结肠癌组织中的表达以进一步证实SDHB的表达与结肠癌分化程度的关系。为了进一步深入研究SDHB基因在结直肠癌发生发展中的作用,我们构建了SDHB过表达稳定转染细胞系以明确SDHB基因对结肠癌细胞SW620生物学行为的影响。同时研究了SDHB基因对SW620细胞基因表达谱的影响。此外,我们从SDHB基因突变和启动子甲基化两个方面对SDHB在结直肠癌中表达下调的机制进行了探讨。方法：本研究在包含32个点阵的低分化结肠癌组织芯片中应用免疫组化技术检测了SDHB蛋白的表达。而后采用真核表达载体pIRESneo3构建了SDHB基因稳定表达载体pIRES-SDHB,利用脂质体转染的方法将其导入SW620细胞,建立了SDHB稳定转染结肠癌细胞系。通过细胞生长曲线、平板集落形成、裸鼠移植瘤形成试验等明确SDHB对结肠癌细胞生长与增殖的作用。通过流式细胞仪检测SDHB对SW620细胞周期的影响,同时采用Western blot及免疫细胞化学法分别检测细胞周期相关分子cyclin D1和PCNA的表达。通过构建人全基因组表达谱芯片探究了SDHB基因过表达对SW620细胞基因表达谱的影响。此外,提取了40对结直肠癌及配对的癌旁正常结直肠粘膜组织gDNA,一方面采用PCR扩增了SDHB基因各外显子片段,产物纯化后进行双向测序检测各外显子突变情况；另一方面将gDNA经亚硫酸氢盐修饰后,采用甲基化特异性PCR检测SDHB基因启动子甲基化状态。结果：（1） SDHB在结直肠癌组织中的表达①免疫组织化学检测SDHB蛋白在结直肠癌组织芯片中的表达,发现SDHB在结直肠癌组织的表达较正常结直肠粘膜明显下调,且其在低分化结直肠癌组织中表达较中、高分化明显减弱。②Western blot检测SDHB蛋白在结直肠癌组织中的表达,发现SDHB在结直肠癌组织中表达正常粘膜组织明显减弱。（2） SDHB基因转染对结肠癌SW620细胞生物学功能的影响①细胞生长曲线显示转染SDHB基因显着抑制了SW620细胞的生长。②平板集落形成试验显示转染SDHB基因显着抑制SW620细胞的集落形成能力。③裸鼠移植瘤形成实验表明SDHB抑制结肠癌SW620细胞致瘤性。④流式细胞仪检测发现稳定转染SDHB基因导致SW620细胞周期发生G1-S期阻滞。⑤Western blot及免疫细胞化学法检测发现SDHB下调SW620细胞中cyclin D1及PCNA的表达。（3） SDHB对结肠癌细胞基因表达谱的影响①采用Illumina公司的人全基因组表达谱芯片（Human HT-12v4）共筛选出受SDHB基因调控结肠癌SW620细胞中差异表达的基因共1653个,其中上调基因1382个,下调基因271个。②采用real-time PCR验证了部分差异表达基因,结果与芯片检测结果一致,说明芯片数据可靠。③GO分析发现差异表达基因主要参与细胞周期及其调控、细胞增殖调控、转录调控、细胞信号传导等过程。④KEGG数据库分析发现差异表达基因主要参与p53、MAPK、 Toll样受体、ErbB、Jak-STAT、T细胞受体、Notch、Wnt、TGF-β、 VEGF、细胞因子相互作用等信号传导途径。（4） SDHB在结直肠癌组织中表达下调的机制①PCR扩增SDHB基因各外显子片段,测序后发现在40例结直肠癌和与配对的正常结直肠粘膜组织标本中SDHB基因第一外显子第18个碱基处存在一个SNP位点,碱基由C颠换成A,致第6位密码子由GCC变为GCA,两个密码子均编码丙氨酸,为一同义突变；未发现致病性突变。结果提示SDHB基因外显子突变可能不是单纯性结直肠癌的致病原因。②MSP法未能在上述40对组织中检测出SDHB基因启动子区CpG岛甲基化,推测SDHB在结肠癌组织中表达下调可能不是由启动子区甲基化引起的。结论：（1） SDHB在结直肠癌组织中表达下调,且表达水平与结直肠癌组织分化程度相关,在低分化癌组织中表达较中、高分化癌组织明显减弱。（2）SDHB可抑制体外SW620细胞的生长与增殖,诱导细胞G1-S期阻滞；抑制SW620细胞裸鼠皮下移植瘤的形成。（3） SDHB基因外显子点突变和启动子区甲基化可能不是SDHB在结直肠癌组织中表达下调的机制。

邓建华^[4]（2011）在《SDHB和EPAS1与嗜铬细胞瘤/副神经节瘤浸润转移的微阵列研究》文中提出目的：嗜铬细胞瘤（PHEO）和副神经节瘤（PGL）是肾上腺髓质和腹部、胸部、头和颈部神经节来源的肿瘤。功能（分泌儿茶酚胺）和非功能的病例中基因突变者约占30%。除RET、VHL和NF-1外,编码琥珀酸脱氢酶复合体亚单位的核基因SDHB、SDHC、SDHD和SDHAF2也认为是PHEO/PGL的易感基因。约15%的PHEO/PGL患者通过SDHB、SDHC和SDHD基因的突变,引起遗传性嗜铬细胞瘤/副神经节瘤综合征（HPPS）,但基因突变引起相关蛋白表达与嗜铬细胞瘤副神经节瘤浸润转移的机制不明确。本研究旨在探讨SDHB突变和EPAS1的过度表达与PHEO/PGL浸润和转移的关系,并确定基因突变、EPAS1、IGF-1和MIB-1作为预测临床上恶性病变的指标的意义。材料和方法：1.对43例PHEO/PGL患者进行了SDH, VHL和RET等胚系突变基因的分析。与临床特点包括性别、年龄、肿瘤部位和多发病变等结果行相关分析。对SDHB基因（1q36.1-1q35,外显子1-8）,SDHC基因（1q21,外显子1-5）,SDHD基因（11q23,外显子1～4）, SDHAF2基因（11q12.2,外显子1-4）,RET原癌基因（10q11.2,外显子10,11,13,14及15和16）,和VHL基因（3p25.3,外显子1-3）等直接进行DNA的序列分析,同时检测PHEO/PGL的外周血样本琥珀酸脱氢酶B启动子区的甲基化程度。2.对64例PHEO/PGL组织标本的石蜡切片行SDHB、EPAS1、VEGF-1R、CgA和MIB-1的免疫组化染色。将阳性确定为颗粒状细胞质染色,计数5个高倍视野,200个细胞/视野,共计1000个,>50%为强阳性（+++）,11%-50%为中度阳性（++）,弱阳性为细胞质弥漫轻染且缺乏明确的阳性颗粒,阴性则是与已知的阳性内参比较,完全没有染色。3.既往研究中显示活化的胰岛素样生长因子Ⅰ受体（IGF-IR）可产生很强的神经保护作用的,我们研究了IGF-Ⅰ诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞分化和增殖的能力,将PC12细胞置于重组人IGF-1环境中,观察IGF-1对PC12细胞增殖和分化的刺激和儿茶酚胺释放的调节。结果：1.基因突变17例（17.5%,17/97）。最常见的是RET原癌基因突变（8.24%,8/97）,7名患者SDHB基因突变（7.2%,7/97）,有2例VHL基因突变（2.06%,2/97）。有或无突变两个组的临床特点比较有统计学显着性差异。2. EPAS1在正常肾上腺髓质呈阴性染色,在良性嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中度阳性表达,在恶性副神经节瘤中高表达。17例已知VHL、RET和SDHB突变的肿瘤15例呈阳性染色。一例VHL病相关嗜铬细胞瘤染色呈弱阳性。无胚系基因突变的46个肿瘤标本,13例阳性。一个临床特征符合家族性副神经节瘤但没有SDH基因突变的标本,免疫组化为阴性,另外1例呈微弱弥漫染色。此外通过相关性分析,EPAS1阳性表达与CgA、MIB-1、VEGF-1R以及CD34密切相关。3.IGF-1影响PC-12细胞增殖分化的实验结果显示：与添加去甲肾上腺素（NE）相比,重组人IGF-1通过激活不同的信号通路,协同增加大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞增殖生长效率,且与所给的剂量和时间长短相关。结论：我们的研究表明：（1）基因遗传易感性在嗜铬组织肿瘤中频率较高,约7.2%的副神经节瘤与SDHB的胚系基因突变相关,而且SDHB的突变多见于腹膜后的副神经节瘤和恶变的副神经节瘤；（2） SDHB基因突变引起副神经节瘤EPAS1的过度表达,进而使得下游元件CD34、VEGF-1R、IGF和TGF等激活,可能是恶性侵袭和转移的机制之一；（3） IGF与PHEO/PGL肿瘤细胞分化和增殖的调控网络有关。但是其复杂的调节涉及众多因子以及多步的合成和／或降解,仍需要进一步研究。

张楚龙^[5]（2011）在《IGF-Ⅱ及bFGF在肾上腺疾病组织中的表达及意义》文中研究表明研究目的：通过免疫组化方法检测IGF-Ⅱ（insulin-like growth factorⅡ）及bFGF （basic fibroblast growth factor）在肾上腺嗜铬细胞瘤瘤组织、肾上腺皮髓质增生组织、肾上腺皮质腺瘤组织中的分布。初步探讨在肾上腺疾病发生过程中所起的作用及临床意义。方法：1、选取广州军区总医院2003年1月至2010年5月泌尿外科住院患者手术切除肿瘤,经病理科确诊后提供的常规石蜡包埋组织块,其中肾上腺皮髓质增生、皮质腺瘤、嗜铬细胞瘤和正常肾上腺组织各15例。病例组患者年龄范围21-56岁,男22例,女23例。临床资料显示皆无并发其他疾病。2、用病理确诊的为结肠腺癌的石蜡切片,分别以1：100及1：300,1：100及1：200稀释一抗试剂,做IGF-Ⅱ和bFGF免疫组化染色。IGF-Ⅱ及bFGF免疫组化分别选取阳性细胞染色清晰、背景干扰小的1：300和1：200的一抗稀释浓度做为一抗稀释浓度。并选取上述阳性颗粒表达清晰的切片作阳性对照。连续切片厚5μm,1张作HE染色,其余以1：300的一抗稀释浓度做IGF-Ⅱ免疫组化染色和1：200的一抗稀释浓度做bFGF免疫组化染色。PBS代替一抗作为阴性对照。3、静息后坐位水银血压计测量血压3次,取平均值。4、IGF-Ⅱ及bFGF在各组细胞质或细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,在切片左上、左下、右上、右下、中心随机取一个视野应用‘’Image-Pro Plus 6.3"软件计算阳性细胞百分比取平均值。5、应用SPSS13.0统计学软件进行分析。采用单向方差分析比较四组阳性细胞面积百分比,采用LSD法进行多重比较。每组中IGF-Ⅱ、bFGF阳性细胞面积的相关性及他们分别与血压的相关性采用Peason积矩相关分析进行。P<0.05差异有统计学意义。结果：IGF-Ⅱ及bFGF蛋白表达水平在四组中表达有显着统计学差异（p<0.05）,表达率从高到低依次为人肾上腺嗜铬细胞瘤组、肾上腺皮髓质增生组、肾上腺皮质腺瘤组（组间比较分别是F=138.657、P=0.000和F=158.103、P=0.000）,而正常肾上腺组皆低表达或不表达（7.79±1.52和12.72±1.68,各组间比较p<0.05）。病例组中IGF-Ⅱ及bFGF蛋白表达呈正相关（p<0.05）。同时三组病例组IGF-Ⅱ及bFGF蛋白阳性细胞面积与血压存在正相关关系（r分别是0.734和0.736,0.776和0.728,0.796和0.740）。结论：1、高表达的IGF-Ⅱ及bFGF蛋白在人肾上腺皮髓质增生症、皮质腺瘤、特别是嗜铬细胞瘤的发生发展中可能起重要作用,二者之间可能存在协同作用。2、IGF-Ⅱ及bFGF对上述疾病高血压的形成起一定作用。

薛翀^[6]（2010）在《嗜铬细胞瘤全基因组拷贝数变化分析和相关基因的研究》文中研究指明研究目的：1.对散发型嗜铬细胞瘤细胞的全基因组DNA拷贝数异常（Copy number variations CNVs）和杂合性缺失（Loss of heterozygosity LOH）的系统分析,发现与肿瘤相关的拷贝数变化和杂合性缺失的所在染色体区位,筛选所涉及嗜铬细胞瘤肿瘤相关基因或者分子标志物,为嗜铬细胞瘤的诊断与治疗提供新的参考资料。2.分析所筛选基因m-RNA的表达水平在良性与恶性嗜铬细胞瘤中的分布差异,寻找鉴别良恶性嗜铬细胞瘤的分子遗传学标记物,并证明应用SNP芯片是筛选肿瘤相关基因有效性方法。材料与方法：1.应用Affymetrix公司GeneChip SNP 6.0芯片检测5例嗜铬细胞瘤（包括肿瘤组织和自身白细胞）全基因组的DNA拷贝数异常（包括扩增和缺失）和LoH。2.分析SNP 6.0芯片检测结果；筛选DNA发生缺失、扩增区域或LoH区域内含基因为嗜铬细胞瘤肿瘤相关基因。3.入选北京协和医院2000年至2008年明确诊断的嗜铬细胞瘤29例,其中良性组19例,恶性组10例。另取12例正常肾上腺髓质组织为正常对照组。提取各组细胞DNA。应用实时定量PCR （real-time PCR）方法检测各组候选基因的m-RNA表达情况。4.统计分析候选基因m-RNA的表达水平在不同病理类型（良／恶性）嗜铬瘤中的的分布差异,分析候选基因与嗜铬细胞瘤临床病理类型及预后之间的关系。结果：1.5例嗜铬细胞瘤组织与配对的正常细胞相比,5例均发生缺失的染色体是1p21.1—1p21.2;4例或4例以上嗜铬细胞瘤发生缺失的染色体主要是1p、3q和11p。2.5例嗜铬细胞瘤组织细胞与配对的正常细胞相比,4例或4例以上嗜铬细胞瘤发生扩增的染色体主要是5q。3.5例嗜铬细胞瘤组织与配对的正常细胞相比,5例嗜铬细胞瘤,都发生LOH。其中4例发生染色体1 p、11 p、11q的LOH；共同区域和基因为：11p15.13和SOX6;3例发生染色体5q的LOH,共同区域和基因为：5q31.3和NRG2；2例发生染色体3p、6q的LOH。4.在3例共同发生缺失的染色体5q31.3含基因NRG2以及其同源基因NRG1为候选基因。5. NRG2-mRNA在良性嗜铬细胞瘤、恶性嗜铬细胞瘤和正常肾上腺髓质组织内均有表达,在嗜铬细胞瘤中表达显着低于正常肾上腺髓质（P<0.01）;而在良恶性嗜铬细胞瘤组之间无显着性差异（P>0.05）。NRG1-mRNA在恶性嗜铬细胞瘤中表达显着高于良性嗜铬细胞瘤（P<0.05）。结论：1. SNP6.0芯片能够有效发现和精确定位嗜铬细胞流全基因组DNA拷贝数的微小变化和LoH区域,可以发现新的染色体CNV区域。2.DNA发生扩增或缺失可能与肿瘤的发生发展有关,可能是肿瘤的发病基础。检测结果为进一步定位筛选和克隆与嗜铬细胞瘤相关基因提供了重要的线索和理论信息。3. NRG2 m-RNA的表达下调的基础可能与嗜铬细胞瘤染色体NRG2存在LoH有关,可能是参与嗜铬细胞瘤发生发展的分子机制；NRG1-mRNA在恶性嗜铬细胞流中的表达良明显高于良性嗜铬细胞瘤,可作为鉴别良恶性嗜铬细胞瘤的标记物,作为嗜铬细胞预后的判断因素。4.SNP芯片是筛选嗜铬细胞瘤肿瘤相关基因有效的方法。

赵志强^[7]（2010）在《散发嗜铬细胞瘤中VHL基因及VHL蛋白表达的研究》文中提出目的VHL基因定位于染色体3p25-26,是一个抑癌基因,其功能和表达的变化与嗜铬细胞瘤的发生有一定关系,且已证实散发嗜铬细胞瘤中存在VHL基因的突变。本实验的目的是通过对散发嗜铬细胞瘤及正常肾上腺髓质中VHLmRNA及pVHL的研究,探索VHLmRNA和pVHL表达的变化与嗜铬细胞瘤发病的相关性；同时探讨pVHL与下游调控基因表达的关系,进而探讨其临床意义。方法收集兰州军区兰州总医院全军泌尿外科中心2007年7月至2009年6月间手术治疗的散发嗜铬细胞瘤标本40例,所有肿瘤组织标本均为手术中无菌采集的新鲜标本,术前均未行放疗和化疗。另外收集意外死亡的健康成人正常肾上腺髓质标本20例作为对照。所有标本均经病理证实。（1）应用免疫组织化学方法分析散发嗜铬细胞瘤及正常肾上腺髓质中pVHL的表达；（2）通过原位杂交方法,检测散发嗜铬细胞瘤及正常肾上腺髓质中VHL基因mRNA的表达；（3）对比不同组织固定液对组织抗原保护的效果。结果（1）pVHL在散发性嗜铬细胞瘤中的表达和正常肾上腺髓质中的表达（P=0.502>0.05）, pVHL在二者中的表达无明显差异；HIF-1α和HIF-2α在散发性嗜铬细胞瘤中的表达明显高于正常肾上腺髓质中的表达（P=0.012<0.05）；嗜铬细胞瘤组织中pVHL与HIF-1α和HIF-2α表达程度呈呈负相关。HIF-1α和HIF-2α表达的相关性分析结果提示二者无明显相关。（2） VHLmRNA在散发性嗜铬细胞瘤中的表达和正常肾上腺髓质中的表达（P=0.007<0.05）, VHLmRNA在二者中表达差异显着；散发嗜铬细胞瘤组织中pVHL与VHLmRNA （rVHLmRNA=0.752, P<0.01）表达程度呈正相关；正常肾上腺髓质中组织中pVHL与VHLmRNA （rVHLmRNA=0.752, P<0.01）表达程度呈正相关,差异均有统计学意义。（3）4%多聚甲醛的抗原保护效果与10%甲醛的抗原保护效果相比,P＜0.05,差异有统计学意义。结论（1）散发嗜铬细胞瘤中pVHL与HIF-α存在相关性,这在嗜铬细胞瘤发生发展中有重要意义；（2）正常肾上腺及散发嗜铬细胞瘤中pVHL与VHLmRNA表达程度正相关；（3）4%多聚甲醛的抗原保护效果明显优于10%甲醛的抗原保护效果。

张少玲,翁育,严励,姜晓华,黎锋,陈黎红,李焱,程桦^[8]（2008）在《一个多发性内分泌腺瘤病2A型家系新的RET原癌基因突变方式》文中指出目的探讨一个多发性内分泌腺瘤病2A型（MEN2A）家系的临床表现和RET原癌基因突变方式。方法对一个MEN2A家系成员进行临床调查,提取其中3例具有典型临床表现的患者及15个家庭成员的外周血淋巴细胞DNA,对REI原癌基因的第8、10、11、13～16外显子进行DNA测序分析,并对发现突变的PCR产物进行亚克隆测序。结果该家系先证者系30岁起先后确诊为嗜铬细胞瘤和甲状腺髓样癌的男性,其一姐患有嗜铬细胞瘤、一弟患有甲状腺髓样癌。在这3例患者及另外2例未发病的家庭成员中,发现了RET原癌基因第11号外显子存在相同的杂合突变,即1893-1895delCGA,系一种新的突变类型。结论RET原癌基因第11号外显子1893-1895delCGA杂合突变,是一种新突变,可能为该MEN2A家系的致病基因。

杨燕丽^[9]（2008）在《实时定量PCR法研究嗜铬细胞瘤的基因表达》文中认为嗜铬细胞瘤是引起继发性高血压的重要原因,其发病机制目前还不完全清楚,临床上早期鉴别良恶性肿瘤尚有困难。我们选取4例正常肾上腺髓质组织、8例良性和10例恶性嗜铬细胞瘤,应用实时定量PCR法测定LRPlB（低密度脂蛋白受体相关蛋白1b）、EPAS1（内皮PAS结合域蛋白1）、Grap-2（Grb-2相关接头蛋白2）基因的表达情况,从基因水平上为研究嗜铬细胞瘤的发病机制、早期鉴别良、恶性肿瘤及治疗提供实验室依据。研究表明,抑癌基因LRP1B在正常肾上腺髓质中的表达高于嗜铬细胞瘤组织,且与肿瘤增殖抗原Ki-67呈明显负相关,EPAS1基因在良性副神经节瘤和恶性肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达均高于恶性副神经节瘤,EPAS1和Grap-2基因的表达有一定的相关性。上述结果国内外文献未见报告。

高健刚^[10]（2008）在《嗜铬细胞瘤组织和细胞中促生长激素神经肽（galanin）及其受体的表达与相关分泌功能的实验研究》文中指出第一部分:Galanin及其受体在人嗜铬细胞瘤中的表达及其意义【目的】本部分通过159例人嗜铬细胞瘤临床资料分析,研究功能不同嗜铬细胞瘤的特点和血清galanin的差异及galanin与受体在嗜铬细胞瘤组织中表达的差异。【方法】分析功能不同嗜铬细胞瘤患者临床特点的差异,Elisa法检测血清galanin差异,用免疫组织化学法检测石蜡组织切片中galanin及其受体的表达差异。【结果】功能隐匿嗜铬细胞瘤在年龄、性别、良恶性、肾上腺内外分布上与功能性者无统计学差异,在尿24小时儿茶酚胺等有统计学差异。血清galanin水平上功能隐匿组（1.92±0.86）ng/ml[正常值:＜3.5ng/ml],功能组（1.87±0.84）ng/ml与正常健康人和高血压患者组无统计学差异。石蜡组织切片中galanin在功能隐匿组的阳性表达6例（23.1%）低于功能组123例（94.6%）;受体GALR1的阳性表达在功能隐匿组25例（96.2%）与功能组124例（95.4%）无差异;GALR2的阳性表达在功能隐匿组9例（34.6%）低于功能组113例（86.9%）。【结论】嗜铬细胞瘤中分泌儿茶酚胺功能与患者血清galanin水平不相关,而可能与肿瘤组织中的galanin水平及受体GALR2的表达有关。第二部分:人嗜铬细胞瘤细胞的原代培养及鉴定【目的】建立人的嗜铬细胞瘤细胞的原代培养方法。【方法】采用连续分次胶原酶消化法分离培养人原代嗜铬细胞瘤细胞,采用细胞培养基中儿茶酚胺水平检测及细胞嗜铬粒蛋白A（CgA）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的免疫组化染色等方法进行细胞性质和功能鉴定,并用噻唑兰（MTT）法观察原代培养的人嗜铬细胞瘤细胞的生长曲线。【结果】成功建立了人嗜铬细胞瘤细胞的原代培养方法。人嗜铬细胞瘤细胞在培养3-7天时生长较快,3-5天后细胞开始分化。经检测细胞培养基中的儿茶酚胺浓度,CgA和NSE的免疫组化阳性染色等,证明该细胞有合成和分泌儿茶酚胺的功能。初步分离后的细胞直径差别较大,可明显的分为大小两类细胞。大细胞表达CgA、galanin弱,NSE、GALR1、GALR2的表达差异则不明显。【结论】原代培养的人嗜铬细胞瘤细胞具有生长和嗜铬细胞瘤的分泌和表达功能,可为该肿瘤的体外实验研究提供基本的材料及研究手段。临床上功能隐匿的嗜铬细胞瘤细胞体外培养与有功能者的分泌儿茶酚胺的能力差异不大,体内可能存在其他影响分泌的因素。第三部分Galanin、糖皮质激素等刺激物对原代培养人嗜铬细胞瘤细胞儿茶酚胺分泌功能的影响【目的】通过采用galanin及其他刺激物对原代培养嗜铬细胞的实验研究,探讨糖皮质激素、galanin等对于嗜铬细胞瘤细胞分泌儿茶酚胺功能的影响及可能的作用机制。【方法】采用第二部分培养的人原代嗜铬细胞瘤细胞,用不同浓度地塞米松、galanin、TGF、U0126（ERK激酶抑制剂）、GF109203X（PKC激酶抑制剂）作用后检测细胞培养基中儿茶酚胺水平及galanin、GALR1和GALR2的免疫组化染色等方法进行细胞功能鉴定,并用噻唑兰（MTT）法观察嗜铬细胞瘤细胞的生长曲线变化。【结果】地塞米松可导致原代培养的人嗜铬细胞瘤细胞儿茶酚胺分泌显着增加,而且其增加是与剂量相关的,去甲肾上腺素增加2-3倍,肾上腺素增加2-3倍,而对增殖没有影响。galanin可导致原代培养的人嗜铬细胞瘤细胞儿茶酚胺分泌增加,去甲肾上腺素增加1-2倍,肾上腺素增加1-2倍,较地塞米松作用弱,同时有增强细胞增殖的作用。这种作用可以被U0126或GF109203X阻断。TGF增强细胞增殖但抑制儿茶酚胺分泌。【结论】人嗜铬细胞瘤细胞分泌儿茶酚胺功能与地塞米松、galanin水平相关,地塞米松、galanin可以刺激原代培养人嗜铬细胞瘤细胞合成、分泌儿茶酚胺,地塞米松不增强嗜铬细胞瘤细胞增殖,galanin可能通过ERK或PKC激酶途径机制参与细胞生长和儿茶酚胺分泌与释放。受体GALR2可能是galanin上述生理作用机制的主要介导途径。Galanin及受体GALR2缺乏可能是嗜铬细胞瘤功能隐匿的主要原因。

二、正常肾上腺和嗜铬细胞瘤新全长基因的克隆及功能分析（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、正常肾上腺和嗜铬细胞瘤新全长基因的克隆及功能分析（论文提纲范文）

（1）嗜铬细胞瘤/副神经节瘤2017版WHO肾上腺肿瘤分类标准下临床病理再评价的单中心研究（论文提纲范文）

（2）二甲双胍新机制研究 ——二甲双胍抑制肾上腺嗜铬细胞瘤生长的作用及机制研究（论文提纲范文）

（3）SDHB在结直肠癌中的表达及功能研究（论文提纲范文）

（4）SDHB和EPAS1与嗜铬细胞瘤/副神经节瘤浸润转移的微阵列研究（论文提纲范文）

（5）IGF-Ⅱ及bFGF在肾上腺疾病组织中的表达及意义（论文提纲范文）

（6）嗜铬细胞瘤全基因组拷贝数变化分析和相关基因的研究（论文提纲范文）

（7）散发嗜铬细胞瘤中VHL基因及VHL蛋白表达的研究（论文提纲范文）

（9）实时定量PCR法研究嗜铬细胞瘤的基因表达（论文提纲范文）

（10）嗜铬细胞瘤组织和细胞中促生长激素神经肽（galanin）及其受体的表达与相关分泌功能的实验研究（论文提纲范文）

四、正常肾上腺和嗜铬细胞瘤新全长基因的克隆及功能分析（论文参考文献）

• [1]嗜铬细胞瘤/副神经节瘤2017版WHO肾上腺肿瘤分类标准下临床病理再评价的单中心研究[D]. 尹绪龙. 青岛大学, 2020(01)
• [2]二甲双胍新机制研究 ——二甲双胍抑制肾上腺嗜铬细胞瘤生长的作用及机制研究[D]. 李敏. 上海交通大学, 2017(09)
• [3]SDHB在结直肠癌中的表达及功能研究[D]. 张德才. 中南大学, 2013(02)
• [4]SDHB和EPAS1与嗜铬细胞瘤/副神经节瘤浸润转移的微阵列研究[D]. 邓建华. 北京协和医学院, 2011(11)
• [5]IGF-Ⅱ及bFGF在肾上腺疾病组织中的表达及意义[D]. 张楚龙. 南方医科大学, 2011(05)
• [6]嗜铬细胞瘤全基因组拷贝数变化分析和相关基因的研究[D]. 薛翀. 中国协和医科大学, 2010(10)
• [7]散发嗜铬细胞瘤中VHL基因及VHL蛋白表达的研究[D]. 赵志强. 兰州大学, 2010(11)
• [8]一个多发性内分泌腺瘤病2A型家系新的RET原癌基因突变方式[J]. 张少玲,翁育,严励,姜晓华,黎锋,陈黎红,李焱,程桦. 中华内分泌代谢杂志, 2008(03)
• [9]实时定量PCR法研究嗜铬细胞瘤的基因表达[D]. 杨燕丽. 中国协和医科大学, 2008(03)
• [10]嗜铬细胞瘤组织和细胞中促生长激素神经肽（galanin）及其受体的表达与相关分泌功能的实验研究[D]. 高健刚. 中国协和医科大学, 2008(07)

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