一、应用新技术对急性髓系白血病骨髓基质细胞粘附分子ICAM-1表达的初步研究（论文文献综述）
阮迎春[1]（2021）在《OCT4基于ZO-1重塑细胞骨架在促进hHFMSC自我更新中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理人毛囊间充质干细胞（Human hair follicle mesenchymal stem cell,hHFMSC）来源于毛囊并具有多向分化潜能。转导多潜能因子OCT4后,hHFMSC的细胞形态和粘附性发生变化,出现贴壁和悬浮两种亚群,其中悬浮亚群经过一系列造血因子诱导能向红细胞转分化。目的:检测贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4的过表达水平,观察细胞形态、骨架、粘附性以及增殖能力的改变,转录组测序分析两种亚群的去分化差异,验证OCT4通过ZO-1调控骨架蛋白、粘附分子及增殖相关基因的表达,从而初步揭示OCT4通过ZO-1/Actin/β-catenin分子途径重塑细胞骨架并促进自我更新的分子机制,为体外获得可大量扩增的造血前体细胞奠定实验基础。方法:在前期建立的OCT4转导hHFMSC的细胞模型基础上,进行如下研究:（1）免疫荧光染色检测贴壁和悬浮亚群中OCT4的表达与定位,qPCR和Western blot进一步检测两种亚群中OCT4的表达量差异。（2）利用Wright-Giemsa染色观察贴壁和悬浮亚群的细胞形态变化,考马斯亮蓝染色观察细胞骨架结构,鬼笔环肽染色观察丝状肌动蛋白F-actin的形态与分布;细胞粘附实验和细胞分离实验比较粘附性变化。（3）转录组测序分析两种亚群中组织特异性基因表达谱以及增殖相关基因表达谱并进行GO功能富集分析。（4）CCK8实验检测细胞的增殖能力;二维克隆形成实验检测细胞的克隆形成率;免疫细胞化学检测Ki67增殖指数;qPCR检测增殖细胞核抗原PCNA的表达。（5）qPCR和Western blot检测ZO-1、ACTN2、E-cadherin和β-catenin的表达,qPCR检测Cyclin D1的表达。（6）si RNA敲低ZO-1反证上述实验结果。结果:（1）OCT4表达定位于贴壁和悬浮亚群的细胞核,两种亚群中OCT4显着过表达且悬浮亚群中OCT4的过表达量较高;（2）转导OCT4后hHFMSC形态和细胞骨架均显着改变,由长梭形变为短梭形或多边形的贴壁亚群和小而圆的悬浮亚群,细胞骨架微丝由相对平行的纤维状转变为不规则网状,丝状肌动蛋白F-actin形态由平行束状变为凝结块状;转导OCT4后hHFMSC粘附性减弱,且悬浮细胞与贴壁细胞相比粘附性更低。（3）贴壁亚群和悬浮亚群中下调基因显着富集于毛囊及皮肤发育相关GO条目,包括表皮发育及角化相关基因KRT15、基底膜形成相关基因COL17A1以及毛囊发育相关基因FZD3、FOXQ1、FGF7以及ALX4等;贴壁亚群和悬浮亚群中上调基因显着富集于增殖相关生物过程,包括有丝分裂细胞周期的调节、细胞周期阻滞的负调控、细胞生长调节、细胞周期G1/S转换以及干细胞增殖调控等。（4）转导OCT4后细胞的自我更新能力和克隆形成率显着提高,且贴壁亚群的增殖能力、克隆形成率显着高于悬浮亚群;但贴壁亚群Ki67的阳性百分比低于悬浮亚群,增殖细胞核抗原PCNA的m RNA表达水平也低于悬浮亚群。（5）转导OCT4后悬浮亚群中ZO-1、ACTN2、β-catenin和Cyclin D1的m RNA表达水平均显着高于贴壁亚群,而E-cadherin表达无显着差异。（6）ZO-1沉默后悬浮细胞中ZO-1、ACTN2和β-catenin的m RNA和蛋白表达水平均显着下调,而E-cadherin及Cyclin D1的表达水平未见显着改变;ZO-1沉默后悬浮细胞骨架略舒展,F-actin交织呈类似于环形的网格状且向细胞核周围聚集趋势更加明显。结论:OCT4可能通过ZO-1/Actin/β-catenin分子途径重塑细胞骨架及粘附性,并可能进一步调控Cyclin D1表达而影响hHFMSC的自我更新,且不同的OCT4过表达量对hHFMSC自我更新的影响不同。意义:本研究旨在探索OCT4可能通过ZO-1/Actin/β-catenin分子途径调节hHFMSC细胞骨架及粘附的作用,并进一步促进hHFMSC自我更新及重编程,为后期深入研究OCT4通过重塑细胞骨架与粘附来调节多潜能与造血转分化之间平衡的分子机制奠定重要的实验基础,为体外获得可大量扩增的造血前体种子细胞提供新的研究策略。
周岳[2]（2021）在《基于非标记定量的蛋白质组学和糖蛋白质组学方法优化及应用》文中研究指明基于质谱的非标记定量技术LFQ（label free quantification）因其样品前处理简单、分析通量高、定量准确等优势在生物学、临床研究中起着越来越重要的作用。定量蛋白质组学可以发现蛋白质水平的变化;糖基化是非常重要的蛋白质翻译后修饰,定量糖蛋白质组学和定量糖组学从蛋白质上糖基化水平的变化以及整个糖谱的变化两个角度阐释糖基化的重要生物学作用。基于对深度覆盖、高通量定量蛋白质组学技术的需求,数据非依赖采集DIA（dataindependent acquisition）的非标记定量非常有应用前景。本文首先对DIA定量方法进行了系统地优化,建立了高通量、深度覆盖的细胞蛋白质组和血浆蛋白质组学流程。以此为基础,综合运用定量蛋白质组学、糖蛋白质组和糖组学技术,解析了乳腺癌细胞紫杉醇（PTX）耐药株（MCF7-PTX）及敏感株MCF7,在蛋白质、糖蛋白质和聚糖层次上的分子变化,并初步分析了特异糖蛋白在乳腺癌细胞耐药中的作用。主要结论如下:（1）系统地评估和比较了基于Orbitrap的DIA三种不同的策略的七个谱图库,发现将多个细胞酶切肽段进行混合,通过液相色谱的高p H反相分离成18个组分,然后进行数据依赖采集DDA（data-dependent acquisition）鉴定是在较短质谱机时的条件下建立深度覆盖谱图库的的有效方法。该谱图库包含>150 000个肽和>9 900个蛋白质。运用该谱图库,三次技术重复的DIA可以定量7 047种蛋白质,涵盖许多信号转导通路蛋白、低丰度激酶和转录因子。与DDA结果的比较,DIA定量的蛋白质组覆盖度、数据完整性以及定量精密度优于DDA。（2）系统优化血浆蛋白质谱图库、LC（liquid chromatrography）和DIA实验参数,开发了用于深度、高通量和估计绝对定量血浆蛋白质组学流程。通过构建深度覆盖的血浆蛋白质组谱图库（包含55 157个肽和5 328个蛋白质）、使用50 cm色谱柱、90 min梯度和26个内标蛋白质标准曲线辅助的估计绝对定量,每个样品定量分析近600个血浆蛋白,动态范围>6个数量级,单次DIA分析中LOQ为13.8 ng/m L。（3）首次评价了Q Exactive Plus、Q Exactive HF-X和Orbitrap Fusion Lumos DIA定量分析的性能。首先针对不同的仪器性能建立了相应的DIA定量分析方法,应用于商品化Hela QC样品、去除高丰度蛋白质的血浆样品以及已知比例的混合样品。结果说明DIA定量分析中,使用高覆盖度的谱图库,二级谱图17.5 K的分辨率和45 ms的最大离子注入时间提供DIA分析所需要的的分辨率和灵敏度,使Q Exactive Plus与Q Exactive HF-X和Orbitrap Fusion Lumos高端质谱的DIA定量分析性能相当,包括相当的蛋白质和多肽定量分析数目以及定量分析精密度、准确性和差异蛋白质发现能力。蛋白质强度归一化方法可以消除仪器间响应不一致导致的批次效应,整合分析三台质谱的DIA数据,可以获得与单独使用单台质谱相当的定量分析性能。（4）利用转录组学、蛋白质组学、糖组学和糖蛋白组学的综合策略,系统地表征了MCF7-PTX的耐药特征。通过定量蛋白质组学,在药物敏感细胞MCF7和耐药细胞MCF7-PTX两种细胞系中共定量到7 006种蛋白质,发现了2 848个差异表达的蛋白质;通过定量糖蛋白质组学,一共定量1 358个糖肽,覆盖了848个糖蛋白,其中150个差异表达的糖肽;通过定量糖组学鉴定到27种N-聚糖结构,其中20种N-聚糖发生变化,大多数为多天线分支结构和岩藻糖基化的复杂N-聚糖。整合分析多组学数据,发现糖基转移酶MGAT4A及其负责合成的多天线分支N-聚糖结构在MCF7-PTX中显着下调;糖蛋白MTUS1被鉴定到具有多天线分支N-聚糖结构,在MCF7-PTX细胞中多天线分支N-聚糖结构修饰显着降低,与MTUS1相关的ERK信号通路也显着受到抑制。因此,可以推断多天线分支结构通过调节靶蛋白功能和相关的信号通路来调节细胞化学耐药。
孙维龙[3]（2021）在《补肾解毒通络方阻止急性白血病复发机制的靶点研究》文中研究说明目的:通过网络药理学的方法分析筛选补肾解毒通络方（BSJDTLF）作用间充质干细胞（MSC）从而阻止急性白血病复发的潜在靶点,为更深层次的研究BSJDTLF调控骨髓微环境的机制提供明确的方向及科学的预测。方法:利用质谱、蛋白质组学等生物信息学方法分析BSJDTLF水煎剂成分及BSJDTLF作用MSC产生的蛋白质表达量变化,在数据库中收集与白血病相关的基因。将这些结果在数据库工具中进行分析比对,使用网络药理学的分析方法筛选BSJDTLF的潜在靶点,并进行验证。研究一:经文献及数据库收集BSJDTLF中药物成分,构建化合物数据库。按比例制备BSJDLTF水煎剂,经浓缩冻干后在超高效液相色谱质谱联用仪上完成液相质质谱分析。将分析结果在化合物数据库中比对,明确水煎剂中的具体成分。使用CTD及TCMSP等数据库收集这些成分的对应靶点,并对靶点进行初步的富集分析,验证与白血病的关联性。研究二:采用健康小鼠,随机分组,分别给予BSJDTLF与生理盐水（NS）灌胃,持续28天后,扩增MSC并提取蛋白。定量检测合格后将样品蛋白酶解及i TRAQ标记,随后在高p H条件下进行反相色谱分离,最后通过纳升级反相色谱Orbitrap Fusion进行蛋白质分析。将分析结果参照Uniprot＿MOUSE（20190420 download）数据库进行匹配,查找出两组小鼠MSC中产生差异的基因。研究三:通过NCBI与GENE CARD数据库搜索与白血病（关键词“leukemia”）相关的基因靶点。将白血病相关基因、研究一中化合物对应靶点及研究二中差异蛋白这3个部分数据统一格式。将3个部分的数据整合分析,选取交集,筛选潜在靶点。利用网络药理学分析方法及STRING数据库对潜在靶点进行PPI网络构建、功能富集分析、通路富集分析、K-core等分析。筛选BSJDTLF潜在作用靶点的核心网络。研究四:使用7周龄BALB/c小鼠12只,随机分为BSJDTL组与对照组,经5 Gyγ射线照射后经尾静脉移植L1210细胞,构建急性淋巴细胞白血病（ALL）小鼠模型。经骨髓涂片确认成模后,两组均给予COP化疗方案。此外,BSJDTLF组从移植后第2天给予中药水煎剂灌胃,持续28天。移植后第29天统一处死小鼠,提取骨髓纯化培养MSC。通过q RT-PCR技术,对MSC中潜在靶点ICAM-1及下游基因PTPN11/SHP2的m RNA表达量进行分析。结果:研究一:通过质谱分析,在BSJDTLF水煎剂中确定了182个主要化合物,并在CTD和TCMSP数据库中检索到了其中100种化合物及其对应的1969个靶点。这些靶点包含与细胞周期、细胞凋亡、炎症相关等功能富集,P53、铂耐药、细胞凋亡、HIF-1等通路富集。研究二:提取2组MSC样本中蛋白质并采用Bradford法测定提取的蛋白浓度,验证浓度满足实验要求。使用纳升级反相色谱Orbitrap Fusion对蛋白质分析后,共鉴定到49346个肽段,这些肽段在Uniprot＿MOUSE（20190420 download）数据库中匹配到5951个蛋白质。在这些蛋白质中,BSJDTLF组与对照组存在表达差异的共有728个靶点。研究三:在NCBI GENE与GENE CARDS数据库中检索白血病相关基因,去除重复项后,共得到了2864个共有靶点。将这2864个靶点与研究一中1969个基因进行比对,筛选到了623个共靶点。623个共靶点经过蛋白质组学验证,确定了50个共表达的基因,这些共表达基因被作为BSJDTLF的潜在靶点进行分析。其中K核分析确定了Mmp2、Stmn1、Icam1、Creb1、App、Alb、Cdk1、Dnmt1、Fth1、Rela在内的核心网络。功能富集和通路富集分析结果中均发现与白血病发病、复发相关的条目。研究四:成功构建了小鼠ALL模型,选取网络药理学分析结果中潜在靶点进行PCR验证,证明了BSJDTLF对ALL模型小鼠MSC中ICAM-1的表达存在影响。验证了网络药理学分析结果的可靠性。结论:通过质谱分析明确了BSJDTLF水煎剂中的主要化合物:γ-氨基丁酸、苯甲醛、L-脯氨酸、苏氨酸等,这些化合物可能通过影响MSC中Mmp2、Stmn1、Icam1、Creb1、App、Alb、Cdk1、Dnmt1、Fth1、Rela等潜在靶点进而阻止急性白血病复发。构建了中药复方化合物-靶点-疾病的关系网络,为深层次研究其机制提供了明确的方向与科学的依据。
胡梦佳[4]（2021）在《SRC-3在造血干细胞稳态调控与骨髓放射损伤中的作用与机制研究》文中提出随着核能与核相关技术在工农业生产、医疗、军事等多个领域的广泛应用,由电离辐射（ionizing radiation,IR）引起的放射损伤也越发常见。骨髓（bone marrow,BM）对射线极度敏感,短时间内受照剂量超过1.0 Gy就足以产生明显的造血系统损伤。中高剂量的电离辐射还会严重扰乱造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）的稳态,导致其数量急剧减少,最终引起骨髓造血功能衰竭,但其中的机制仍未阐明,目前也无有效的救治措施。因此,进一步揭示骨髓造血干细胞稳态调节的关键因素,以及放射损伤后造血干细胞枯竭和造血功能衰竭的发生机理,对寻找新的救治策略以及研制相关新药具有重要的指导意义。成熟的血细胞寿命有限,必须由造血干细胞通过增殖、分化进行补充。造血干细胞具有自我更新和向各系造血细胞分化的能力。根据存活时间长短和自我更新能力强弱,造血干细胞又分为长期造血干细胞（long-term HSC,LT-HSC）、短期造血干细胞（short-term HSC,ST-HSC）和多能祖细胞（multipotent progenitor,MPP）。成体造血干细胞主要处在氧分压较低的骨髓龛（niche）中,其具有独特的代谢特点,即主要依赖无氧的糖酵解为其生命活动提供能量,有氧代谢则处于相对抑制的状态。而在各种应激（如辐照、感染和化疗）条件下,它原有的代谢模式会发生转变,逐渐向线粒体代谢倾斜,以满足能量增加的需求。在正常情况下,骨髓组织中的大部分造血干细胞都处于静止或者静息状态,尤其是LT-HSC基本上处于休眠状态,这是维持其稳态并防止电离辐射和细胞毒性物质损伤的关键。虽然在过去的50多年中,国内外的研究人员已经发现了多种关键的造血调节因子,但造血干细胞稳态的精确调控机制尚未完全阐明,亟待深入地探索和研究。类固醇受体活化辅激活因子3（steroid receptor coactivator 3,SRC-3）,是SRC家族（包括了SRC-1、SRC-2和SRC-3三个同源性蛋白）中的一个成员。作为核受体和其他转录因子的辅助活化因子,SRC-3可以招募转录所必需的组蛋白乙酰化酶以及其他一些转录共激活分子,调控靶基因的转录,从而在机体生长发育、性器官成熟、能量代谢等多个方面发挥着重要的生物学功能。由于SRC-3在多种肿瘤细胞（包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、白血病等）中高表达,因此之前的研究主要聚焦于它与肿瘤发生和发展之间的关系,而对它在造血系统中的作用知之甚少。但有文献报道,SRC-3敲除后小鼠外周血中白细胞显着增多,血小板显着减少。我们前期研究也发现,SRC-3基因敲除小鼠(SRC-3-/-)骨髓巨核细胞多倍体明显减少,并且其对辐照的敏感性明显增加,然而潜在的机制并不清楚,这种缺陷很可能来自于造血干/祖细胞层面。同时,我们也发现普通C57小鼠辐照后骨髓造血干细胞中SRC-3表达显着降低,提示SRC-3的下降很可能是辐照后造血干细胞稳态失衡的重要原因。最近还有研究指出,SRC-3是胚胎干细胞和肿瘤干细胞多能性网络的关键分子。据此,我们推测SRC-3可能对造血干细胞的稳态和功能具有潜在的调控作用。此外,以SRC-3为靶点,有望为骨髓放射损后造血干细胞稳态的失衡探寻新的救治方法。因此,本研究首先通过定量PCR、流式细胞术、免疫荧光和Western blot检测了SRC-3在小鼠骨髓造血干细胞中的表达水平;然后主要利用流式细胞术对野生型（wild-type,WT）和SRC-3-/-小鼠骨髓造血干细胞的比例、数量、细胞周期、增殖、凋亡、分化以及动员等情况进行了全面的对比和分析,以明确SRC-3对造血干细胞稳态的调控作用;在此基础上,我们利用小鼠急性放射损伤模型,观察了SRC-3对造血干细胞的辐射保护作用,并通过非竞争性骨髓移植、竞争性骨髓移植等实验研究了SRC-3缺失对造血干细胞长期造血重建能力的影响;最后,通过全转录组芯片、流式细胞术、免疫沉淀、Seahorse分析、慢病毒转染等技术对SRC-3调控造血干细胞稳态的机制进行深入的分析和探讨。主要研究结果及结论如下:1、定量PCR、流式细胞术、免疫荧光和Western blot结果显示,SRC-3在小鼠骨髓造血干细胞中的表达显着高于造血祖细胞以及分化成熟的细胞,这种特殊的表达模式提示SRC-3对造血干细胞可能具有潜在的调控作用。2、流式细胞术检测发现,SRC-3敲除后小鼠骨髓中造血干细胞的总数显着增加;在造血干细胞亚群中,LT-HSC的比例升高,MPP的比例降低,ST-HSC的比例没有显着变化;在造血祖细胞中,髓系共同祖细胞（common myeloid progenitor,CMP）的比例显着降低,但是粒单系祖细胞（granulocyte monocyte progenitor,GMP）、巨核系-红系祖细胞（megakaryocyte erythroid progenitor,MEP）和淋巴系共同祖细胞（common lymphoid progenitor,CLP）的比例并没有发生显着变化。这些结果表明SRC-3的存在有助于维持骨髓中造血干/祖细胞比例和数量的平衡。3、Ki67和Brd U染色结果显示,SRC-3敲除后小鼠骨髓造血干细胞的静止状态受到扰乱,导致其过度增殖和活化;另外,定量PCR结果也显示,SRC-3敲除后造血干细胞中细胞周期蛋白Cyclin E1和Cyclin E2显着上调,细胞周期抑制因子P21和P27显着下调。这表明SRC-3参与了造血干细胞静止状态的维持。4、SRC-3敲除后小鼠脾脏和外周血中造血干细胞的比例显着增加,说明SRC-3缺失促进了造血干细胞从骨髓向外周的动员。5、利用小鼠急性放射损伤模型,我们发现与野生型小鼠相比,SRC-3敲除小鼠在辐照之后骨髓造血干细胞的恢复明显减慢,DNA损伤和凋亡也显着增加,说明SRC-3对造血干细胞具有辐射保护作用;此外,SRC-3敲除也增加了造血干细胞对5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）的敏感性。这些可能是由于SRC-3敲除后造血干细胞失去静止、异常增殖所致。6、非竞争性骨髓移植、竞争性骨髓移植、反向骨髓移植等实验证实SRC-3缺失损伤了造血干细胞的长期造血重建能力,并且SRC-3主要是通过内在性的机制调控了造血干细胞的稳态。7、全转录组芯片提示,SRC-3敲除后小鼠骨髓造血干细胞中线粒体相关成分显着上调,氧化磷酸化通路显着活化;进一步的实验证实,SRC-3缺失增加造血干细胞中线粒体的数量、膜电位以及代谢活性。8、SRC-3敲除后小鼠骨髓造血干细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平显着增加,并且这些活性氧主要来源于线粒体,因此抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）的处理可部分逆转SRC-3缺乏后造血干细胞的异常表型和功能。9、SRC-3缺失导致造血干细胞中乙酰化酶GCN5的表达显着下调,从而降低了过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活蛋白1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivators 1α,PGC-1α）的乙酰化水平并导致其活化,最终促进了线粒体的能量代谢。因此通过慢病毒转染过表达GCN5可明显改善SRC-3缺失诱导的造血干细胞表型和功能的缺陷。总之,通过本研究,我们首次揭示了SRC-3是一个参与造血干细胞稳态调控的关键因子,同时明确了SRC-3对造血干细胞的辐射保护以及功能维持作用,也进一步阐明了SRC-3调节造血干细胞稳态和功能的分子机制,为放射损伤条件下造血干细胞稳态失衡的防治提供了一定的指导。
葛洋洋[5]（2020）在《CXCR4拮抗多肽及其与化疗药共载纳米胶束对难治性急性髓系白血病的治疗作用及机制研究》文中指出急性髓系白血病（Acute Myeloid leukemia,AML）占成年人急性白血病的80%左右。现行AML治疗多采用以阿糖胞苷为基础的联合化疗方案,完全缓解率在70%左右。但是,化疗药物的攻击会使AML细胞上调某些耐药相关蛋白的表达,降低细胞对化疗药物的敏感性,同时还引导细胞向骨髓、脾脏等基质细胞丰富的组织器官趋化归巢,在其中形成微小残留病灶,导致患者易耐药和复发,三年内的复发率高达50%-60%。化疗药物普遍缺乏靶向性,会带来严重的毒副作用,老年患者对于化疗的耐受尤其差;而复发或难治性AML患者对化疗不再敏感,也难以再从化疗中受益。此外,AML细胞遗传学异常复杂,涉及数千种基因突变,针对基因突变的靶向药物的研发充满挑战,迄今进入临床的数量极为有限。目前国际上AML的五年总生存率仅为25%左右,因此,迫切需要研发更为有效的新技术和新治疗手段。已有研究表明,多种类型的AML细胞表面会表达某些共同的耐药相关抗原,成为AML治疗和药物研发的靶标蛋白,趋化因子受体CXCR4是其中一种。CXCR4高表达的AML细胞可通过与配体CXCL12相互作用,归巢到骨髓微环境中,从中获得增殖和耐药信号;同时,在CXCL12的招募下,向脾脏和肝脏等器官中浸润。临床上已明确CXCR4高表达与AML患者的不良预后密切相关。目前有若干CXCR4拮抗剂在临床Ⅰ期或Ⅱ期研究阶段,尚未获批用于AML治疗。我们实验室前期根据CXCR4的序列特征自主研发了一种新的化学合成CXCR4拮抗多肽（E5）,可有效干扰多种人源AML细胞系的CXCR4/CXCL12生物轴,抑制细胞的迁移和粘附,并在急性早幼粒白血病异种移植瘤小鼠模型中表现出良好的抗肿瘤效果。基于以上背景,本课题的研究思路与目标是将CXCR4拮抗多肽E5与两亲性磷脂大分子培化磷脂酸乙醇胺（Distearoyl phosphoethanolamine-PEG,简称DSPE）组装成负载E5的胶束（命名为M-E5）,一方面提高其在溶液中的稳定性,以期在难治性白血病小鼠模型上获得更好的拮抗治疗效果;同时,将其作为靶向CXCR4的药物递送平台,将化疗药盐酸阿霉素（Doxorubicin hydrochloride,简称Dox）负载到M-E5中,提高难治性AML小鼠的化疗效果。本文制备了两种胶束:首先,利用涡旋混合、超声和55℃加热等,制备得到了负载CXCR4拮抗多肽E5的胶束（M-E5）。在此基础上,将Dox引入到M-E5中,制备出负载E5和Dox且载药比例可调的胶束（M-E5-Dox）。采用透射电子显微镜、原子力显微镜及动态光散射等方法对上述两种胶束的粒径、表面电势及形貌进行了表征。结果表明,E5可单独或与Dox共同负载到DSPE胶束上。M-E5和M-E5-Dox两种胶束均呈尺寸均一的球形,在5%的葡萄糖溶液或生理缓冲液中稳定分散。用半致死剂量的X射线辐照C57小鼠4h后,通过尾静脉注射来自濒死AML1-ETO（AE）&C-KITD816V小鼠的脾脏细胞,建立了难治性AML小鼠模型。抗体竞争性结合性实验的结果表明,M-E5可与CXCR4的胞外N端结合;迁移实验结果表明,M-E5有效阻止了 CXCL12介导的脾脏和骨髓AML细胞的迁移。体内定植实验的结果显示,M-E5皮下给药24 h后,脾脏和骨髓中AML细胞的比例显着降低。此外,M-E5能动员AML细胞进入外周血循环,在皮下给药后2 h达到最佳效果。免疫原性实验结果表明,M-E5免疫原性较低,长时间多次皮下注射未诱导机体产生IgG和IgA抗体。对AML小鼠给予皮下注射M-E5治疗后,小鼠外周血、脾脏及骨髓中的AML细胞比例均显着降低;与此同时,外周血中的白细胞数也显着减少。转录组测序分析结果显示,经M-E5治疗后,小鼠AML细胞中上调的基因显着富集到与凋亡和分化相关的生物学过程,而下调的基因显着富集到增殖和粘附相关的生物学过程。通过荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）、免疫组化和流式细胞术对测序分析的结果予以验证,结果显示,脾脏和骨髓AML细胞中与凋亡相关的基因Caspase8和Endog、凋亡蛋白Cleaved-Caspase3以及分化标志物CD11b和Gr-1的表达显着升高,表明M-E5主要通过诱导AML细胞发生分化和凋亡产生抗肿瘤效果。给予皮下注射10mg/kg M-E5治疗后,AML小鼠的中位生存期显着延长。此外,当M-E5与化疗药组合高三尖杉酯碱和盐酸阿霉素联合应用时,可显着提高化疗的效果。此外,M-E5-Dox能够将更多的Dox递送到对盐酸阿霉素耐药的HL60细胞（HL60/A）中,有效增加Dox在该耐药株内的积累,产生了更强的细胞毒性。在难治性AML小鼠模型上,连续4天腹腔注射M-E5-Dox后,在停药第6天,AML小鼠外周血、脾脏、骨髓及肝脏中的AML细胞比例显着降低。与此同时,与各对照治疗组相比,M-E5-Dox组小鼠的中位生存期显着延长。Western blot的分析结果表明,M-E5-Dox使脾脏组织中CXCR4/CXCL12轴下游信号蛋白Erk和p-38的磷酸化水平以及抗凋亡蛋白Mcl-1和CXCR4的表达水平显着降低,因而抗AML的效果显着增强。综上所述,M-E5作为单药可通过拮抗CXCR4/CXCL12生物轴,有效抑制AML细胞在脾脏和骨髓中的定植、动员AML细胞到外周血循环,显着降低外周血、脾脏及骨髓中AML细胞的负荷,延长难治性AE&C-KITD816V小鼠的生存期;也可与化疗药组合（柔红霉素和高三尖杉酯碱）联合应用,增强化疗效果。此外,共载药纳米胶束M-E5-Dox同时具有CXCR4靶向性、CXCR4拮抗功能和Dox的杀伤作用,三者联合作用,有效增强了对AE&C-KITD816V小鼠的治疗效果。
孙伊娜[6]（2019）在《MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究》文中研究表明随着诊断及治疗方法的不断改进,目前国内外儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）治愈率已经比较高,但仍有一些儿童难治或复发,其中混合谱系白血病（MLL）基因重排儿童ALL是公认的预后不良类型之一。不同年龄、伙伴基因、治疗策略和早期治疗反应对MLL基因重排白血病预后有很大差异。随着二代测序技术的日益成熟,RNA-seq技术逐步应用于白血病的基因诊断,对于精准的鉴定不良预后基因,显得极为重要。本研究从临床特征、治疗反应及差异表达基因几个方面分析和研究MLL重排阳性儿童ALL预后不良因素,为进一步分层及个体化治疗奠定基础。第一部分 MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后因素分析目的:探讨MLL基因重排儿童ALL接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后相关因素。方法:2008年4月至2015年10月共227例ALL患儿接受CCLG-ALL2008高危组方案治疗,其中MLL阳性30例,BCR/ABL阳性24例,MLL和BCR/ABL双阴性173例,MLL阴性197例。MLL阳性组分别与BCR/ABL 阳性组、MLL及BCR/ABL双阴性组和MLL阴性组比较临床特征和治疗反应,并长期随访,对组间及组内进行生存分析。结果:1、MLL阳性组与其它组比较:年龄<2岁比例较其他组明显增高;第15天骨髓非M1（原始+幼稚细胞<5%）比例明显低于阴性组和双阴性组;第33天完全缓解（CR）患儿较BCR/ABL 阳性组明显增高;第33天骨髓MRD≥1×10-2比例较BCR/ABL 阳性组明显低。10年总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）MLL阳性组比BCR/ABL 阳性组高。2、MLL阳性组内比较:年龄<2岁患儿10年OS和RFS显着低于年龄≥2岁患儿。强的松不敏感患儿10年OS和RFS显着低于强的松敏感患儿。第33天未缓解（NR）组10年OS和RFS显着低于CR组。多变量COX回归分析发现:年龄、基因重排形式、强的松反应对患儿生存期有影响。结论:CCLG-ALL2008高危组方案对于年龄<2岁、MLL/AF4重排、强的松反应不敏感和第33天未缓解患儿治疗效果不佳;年龄<2岁、MLL/AF4重排、强的松不敏感以及第33天未缓解与MLL重排儿童ALL预后不良相关。第二部分 应用RNA-seq初步研究MLL重排儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因与预后的相关性目的:应用RNA-seq技术鉴定MLL基因及伙伴基因,通过分析差异表达基因,推测预后不良基因。方法:1、2014年4月至2018年4月在苏州大学附属儿童医院接受正规治疗的15例MLL重排阳性及5例阴性儿童ALL病例,用RNA-seq测定基因表达及鉴定伙伴基因。2、差异表达基因（DEGs）通过Cuffdiff算法来分析,并对DEGs进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,通过分析前20个差异最显着DEGs富集到有意义的GO功能和KEGG信号通路,筛选出预后相关基因。结果:1、通过RNA-seq 15例ALL病例全部鉴定出MLL基因及伙伴基因。2、差异表达基因分析发现,MLL重排阳性组对阴性组,复发组对未复发组,泼尼松耐药组对敏感组,存在明显的差异表达基因;前20上调DEGs富集到有意义的GO功能和 KEGG 信号通路,MLL 阳性组有:CCNA1、LAMP5、CXCL8、MAP7、IL1RL1、NTRK1、PROM1;复发组中有:IL1RL1、GATA2、IL5RA、CXCL8、CXCR2、CXCR1。结论:1、RNA-seq鉴定融合基因非常精准,有望成为白血病分子生物学诊断新方法。2、CXCL8、IL1RL1、CCNA1、LAMP5、PROM1、GATA2、CXCR2 以及 CXCR1高表达可能与MLL重排阳性儿童ALL预后不良相关。
李海鹰[7]（2019）在《甲状旁腺激素调控骨髓微环境影响白血病发病及多药耐药的研究》文中研究表明目的:骨髓间充质干细胞,是构成骨髓微环境的基本细胞成分,参与骨髓微环境细胞因子网络的形成。在白血病患者体内,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的形态和功能会发生变化,与正常骨髓微环境向白血病骨髓微环境的转化相关。而甲状旁腺激素可以通过骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）通路促进间充质干细胞向成骨细胞的转化。同时,该通路与结缔组织细胞生长因子（Connective tissue cell growth factor,CTGF）存在相互作用,可以介导肿瘤的粘附、迁移和耐药。基于上述原因,本研究想证实,骨髓微环境的转变对白血病耐药的影响以及利用甲状旁腺激素对骨髓间充质干细胞的作用,能否改变其构建的骨髓微环境,达到调控白血病发生、进展和耐药的目的。并且对参与调控的通路进行初步研究,以期发现白血病治疗的新靶点,为白血病的治疗提供新的理论依据。方法:1、细胞实验:收集急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）患者骨髓进行原代培养,获得的急性髓系白血病来源的间充质干细胞（AML-MSCs）分别与K562及K562-ADM共同培养。形态学检测,过氧化物酶染色,实时荧光定量聚合酶链反应和荧光原位杂交技术对共培养后的细胞变化进行鉴定。流式细胞仪检测共培养前后K562及K562-ADM的细胞周期与凋亡。ELISA检测共培养前后细胞因子IL-6/IL-32的含量。在共培养的细胞中加入不同浓度梯度的甲状旁腺激素,流式细胞仪检测加药后不同时间点K562/K562-ADM的细胞周期与凋亡。ELISA检测加药后细胞因子IL-6/IL-32的变化。RT-PCR和蛋白印迹法检测共培养组和加药共培养组BMP4基因/下游磷酸化蛋白Smad1/5、CTGF基因/蛋白、以及多药耐药基因（ATP-binding cassette sub-family B member 1,ABCB1）/多药耐药蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的变化。2、临床实验:收集2015-2017年在兰州大学第一医院就诊的急性髓系白血病初诊患者骨髓样本56例。根据NCCN指南进行诊断和分类,分为预后良好组、预后中等组、预后不良组以及复发耐药组。选取10例无骨髓病变的非恶性血液病患者骨髓样本及10例正常人的骨髓样本作为对照组。RT-PCR检测BMP4、CTGF和ABCB1的表达水平,ELISA检测骨髓浆及血浆中BMP4和CTGF蛋白含量。结果:1、AML-MSCs会促使K562-ADM发生梭形转化,这种转化在K562共培养组罕见发生。2、AML-MSCs促进K562-ADM的增殖,抑制凋亡。AML-MSCs抑制K562的增殖,促进凋亡。3、可溶性细胞因子IL-6和IL-32在K562共培养组中含量下降,但是在K562-ADM共培养组中明显增加。4、在共培养组中,加入甲状旁腺激素,可以促进AML-MSCs的分化、抑制增殖,抑制IL-6/IL-32的产生,促进K562/K562-ADM的凋亡,抑制增殖。甲状旁腺激素对K562-ADM的上述作用强于K562,在24小时作用最为明显。5、AML-MSCs与K562-ADM共培养,BMP4基因/p-Smad1/5蛋白表达下降,而与K562共培养,BMP4基因/p-Smad1/5蛋白表达升高。6、AML-MSCs与K562/K562-ADM共培养,CTGF和ABCB1/P-gp表达均升高,K562-ADM共培养组升高明显。7、甲状旁腺激素上调AML-MSCs上BMP4基因/p-Smad1/5蛋白的表达,下调CTGF的表达,抑制K562/K562-ADM上ABCB1/P-gp的表达。8、BMP4表达下降,CTGF表达升高,与急性髓系白血病患者的不良预后密切相关（p<0.05）。CTGF的表达与ABCB1表达呈正相关（r=0.907,r>1）;而BMP4的表达与ABCB1呈负相关（r=-0.827,r<1）。BMP4的含量变化在骨髓浆与血浆中的表达具有一致性;CTGF的含量变化在骨髓浆和血浆中的表达不一致。结论:1、骨髓微环境转变所诱导的K562-ADM梭形转化与白血病化疗耐药密切相关。2、甲状旁腺激素可以通过抑制AML-MSCs的增殖,促进K562及K562-ADM的凋亡,且对K562-ADM的作用强于K562。3、甲状旁腺激素可能是通过对BMP、CTGF的调控,下调K562及K562-ADM的多药耐药基因和蛋白的表达,参与白血病发病与多药耐药的发生。4、BMP-4表达减低,CTGF表达增高,与急性髓系白血病的多药耐药和不良预后相关。
刘思恒[8]（2018）在《骨髓病理在判断BMSC功能异常导致allo-HSCT后继发性植入不良中的作用》文中认为背景和目的:异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗恶性血液系统疾病的重要方法,目前已广泛应用于临床。移植术后可能出现感染、疾病复发、移植物抗宿主病（GVHD）等多种并发症,随着对疾病认识的加深和提前干预,allo-HSCT后继发性植入不良（secondary poor graft function,sPGF）成为主要并发症之一,主要表现为allo-HSCT造血重建后再度发生严重血红蛋白、白细胞、血小板减少,导致度贫血、严重感染及出血,是一种致死性的严重并发症,其发病机制、病情演变和预后转归仍不明确。Allo-HSCT后sPGF已受到较多关注,但目前国内外尚无统一定义,许多专家学者根据人群不同及自身临床经验对其进行了定义,根据诊断标准的不同,sPGF发生率波动于5%27%。骨髓造血微环境又被称作造血干细胞龛（niche）,通常认为可以分为成骨龛（osteoblastic niche）和血管龛（vascular niche）,两者在HSC的增殖、分化、归巢及动员过程中扮演着不同的角色,即成骨龛有利于HSC的静息,而血管龛为HSC提供了增殖、分化的场所。骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）是造血微环境的重要组成部分,可以通过分泌细胞因子、趋化因子及粘附分子等实现对HSC的调节。近期有学者通过血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）/造血干细胞、间充质干细胞（MSC）/造血干细胞共移植的方式试图预防allo-HSCT后sPGF并取得了一定成效。因此,我们推测allo-HSCT后sPGF的发生机制可能与骨髓基质细胞分布紊乱、粘附及分泌能力下降有关。目前对allo-HSCT后sPGF患者基质细胞的研究方法主要有直接或细胞培养后应用流式细胞术、PCR技术等检测相关指标和动物实验等,这些方法的优点在于通量高,可检测指标多,但是不能直接反映基质细胞在人骨髓中的真实状态。骨髓病理检查可通过观察allo-HSCT后发生sPGF患者骨髓病理切片常规HE染色及免疫组化染色,了解到其骨髓增生状态、细胞分布、免疫组化抗体标记细胞的多少、表达强度、分布状态等。因此骨髓病理检查在研究allo-HSCT后sPGF患者基质细胞方面具有一定优势。本研究试图通过对临床资料的回顾分析建立本中心allo-HSCT后sPGF的临床标准,并通过检测allo-HSCT患者移植前末次骨髓病理活检标本中参与细胞粘附、HSC归巢的分子CD29、CD44、ICAM-1、VCAM-1,血管内皮细胞标记CD34、CD105,间隙连接蛋白43等指标,揭示骨髓造血微环境在sPGF上的作用及相关机制,为临床预防allo-HSCT后sPGF寻找的新靶点。方法:1.回顾性分析我科2016年度行allo-HSCT 118例患者临床资料,根据患者造血重建后是否再次出现外周血血细胞减少,将患者分为继发性植入不良（sPGF）组与植入良好（good graft function,GGF）组,对两组患者间年龄、性别、原发病、干细胞来源、HLA配型、性别匹配、ABO血型匹配、移植后是否CMV感染、移植前是否缓解、移植前骨髓增生程度、移植后外周血血细胞减少系列数量等方面进行比较,经统计学分析后建立本科allo-HSCT后sPGF的临床标准。2.根据前述标准选取其中28例移植后植入不良患者作为实验组,植入良好患者27例作为对照组,提取其行移植术前骨髓活检标本做免疫组织化学染色,抗体选择CD29、CD44、ICAM-1、VCAM-1、CD105、Cx43,比较上述免疫标记的累积光密度值（IOD值）3.根据前述IOD值比较结果进一步对前述两组患者加做CD34免疫组化染色,比较CD34、CD105染色的IOD值,并分别观察两者的微血管密度（microvascular density,MVD）及微血管形态。结果:1.Allo-HSCT后sPGF组与GGF组患者比较年龄、性别、原发病、干细胞来源、HLA配型、性别匹配、ABO血型匹配、移植前是否缓解、移植前骨髓增生程度,差异无统计学意义（P>0.05）;两组患者比较移植后是否CMV感染,差异有统计学意义（P<0.05）;移植后GGF组复发率低于sPGF组,差异有统计学意义（P<0.05）,出现1系、2系、3系血细胞减少患者间复发率比较无统计学意义（P>0.05）;移植后GGF组死亡率低于sPGF组,差异有统计学差异（P<0.05）,而1系、2系、3系血细胞减少患者之间死亡率比较没有统计学意义（P>0.05）。2.实验组与对照组免疫组化染色结果显示,CD105 IOD值[M（Q）]试验组32 569.7（26 824.9）,对照组14 091.1（5 694.1）,试验组高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关性分析显示CD105 IOD值与分组成负相关（r=-0.349,P=0.009）。Cx43 IOD值[M（Q）]试验组29085.2（39361.9）,对照组69069.6（118486.45）,实验组低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关性分析显示Cx43 IOD值与分组成正相关（r=0.314,P=0.000）。试验组与对照组CD44、CD29、ICAM-1、VCAM-1IOD值[M（Q）]分别为11 476.2（4770.5）对6 499.0（3 276.1）、9 450.5（6 666.8）对7 284.8（4 159.5）、1 061.6（1014.2）对469.7（372.9）、69 258.3（46 892.7）对51 024.7（38621.5）,差异均无统计学意义（P>0.05）。3.CD34 IOD值[M（Q）]为实验组4155.6（3986.1）,对照组4146.85（5964.53）,二者比较没有统计学意义（P>0.05）。CD105 MVD值实验组26.6±15.8,对照组12.9±11.7,实验组高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关性分析显示CD105MVD值与分组成负相关（r=-0.446,P=0.001）。CD34 MVD值实验组7.2±2.7,对照组5.6±2.3,实验组与对照组比较无统计学意义（P>0.05）。形态观察示CD105阳性部位位于梭形细胞细胞浆及细胞膜,实验组阳性细胞较多,多单独分布,较少形成管腔样结构,对照组CD105阳性细胞分布亦较为紊乱,但数量较前者少;血管内皮细胞上CD105呈不表达或弱表达。CD34免疫组化染色阳性部位位于内皮细胞细胞浆及细胞膜,实验组与对照组均可见较多管腔样结构,分布正常,血管内皮细胞上CD34阳性表达清晰。结论:1.患者allo-HSCT后出现sPGF是影响其生存率的独立危险因素,患者出现至少1系血细胞减少即可认为发生sPGF;2.移植后植入不良患者移植前骨髓基质细胞CD105表达水平升高、Cx43表达水平下降;3.移植后植入不良的发生可能和移植前骨髓内肿瘤相关血管内皮细胞增多相关。
向茜茜[9]（2017）在《骨髓基质细胞分泌CCL2和VEGF在急性髓系白血病中的作用》文中研究表明急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是造血系统的一种恶性肿瘤,占成人急性白血病的60%70%。随着医学技术进步,目前对AML的治疗方案得到不断的发展,但其5年生存率在年轻人中约40%,而对于老年人甚至不足5%[1,2]。因此深入研究其发生发展机制,寻找新的治疗靶点,为AML的精准治疗提供新的途径实属必要。骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）是骨髓造血微环境的主要组成细胞,对各类造血细胞及造血干/祖细胞的支持和调节发挥了重要作用。BMSCs通过分泌细胞因子、生长因子、基质蛋白等,参与了白血病的发生、发展[3]。已有一些研究显示,BMSCs相关的一些分子在AML不同阶段的不同表达水平可能与AML的发生、发展及治疗反应和预后有关联[4]。至今哪些BMSCs相关分子起到了关键的调控作用,其对AML细胞的生物学作用是如何发挥的,目前尚不十分清楚。因此深入研究BMSCs相关分子在AML发生、发展中的表达变化规律并阐明其机制,可望为AML患者的诊断和治疗提供新的途径。目的:筛查BMSCs相关分子在AML患者不同疾病阶段中的表达水平及其临床价值;在细胞水平研究BMSCs相关的重要分子对AML细胞的作用。方法:第一部分:通过检索Pubmed、CNKI等数据库,检索到与AML有联系的BMSCs相关分子38个（VCAM1、ICAM-1、CD44、MMP-2、Cx43、IL-6、IL-10、TNF-α、SDF-1、VEGF、HGF、HIF-1α、CCL2等）。收集我中心69例AML患者在初诊、完全缓解（CR）、复发、难治性AML这4个疾病阶段的骨髓样本共151份,非恶性血液病（并除外再生障碍性贫血）患者骨髓样本7例作为对照组,各取EDTA抗凝的骨髓标本2-4ml;分离、培养、收集BMSCs;用Trizol试剂提取BMSCs的RNA。用PCR芯片检测所有样本的38个分子的m RNA表达水平,筛选出与AML发生发展可能有高度特异性的BMSCs相关分子。统计分析筛选出的趋化因子2（chemokine（C-C motif）ligand 2,CCL2）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factors,VEGF）在AML患者不同疾病阶段中的表达差异性。第二部分:在体外细胞水平进行进一步验证CCL2、VEGF与AML的关系。对骨髓基质细胞HS-5转染CCL2和VEGF的对照空质粒和过表达质粒;构建转染后HS-5和白血病细胞MOLM13、HL60的共培养体系;检测CCL2、VEGF的不同表达水平对MOLM13和HL60的生物行为学影响;CCK8实验检测共培养体系中白血病细胞的活力、增殖能力;Transwell检测MOLM13、HL60的侵袭能力。结果:1.通过对PCR芯片检测结果的聚类分析,发现在所检测的38个BMSCs相关分子中,CCL2和VEGF在AML不同疾病阶段的骨髓中表达具有最大的差异性,变化具有一致性。初诊时CCL2和VEGF的表达均高于对照组（p<0.05）;在CR时其表达水平比初诊时明显降低（p<0.05）,与对照组比较均无统计学意义（P=1.000）;两者在复发时的表达水平与CR时比较均明显增高（p<0.05）;难治性AML患者中CCL2和VEGF的m RNA水平和CR时相比,均明显增高（p<0.05）。2.分别转染CCL2、VEGF的过表达质粒,电泳灰度比及Q-PCR结果均证实转染成功。成功构建体外转染后的HS-5和MOLM13、HL60的共培养体系。HS-5分别过表达CCL2、VEGF时,生长曲线显示共培养体系中MOLM13、HL60的细胞活力均明显增高（p<0.05）;Q-PCR结果显示72h共培养体系中MOLM13、HL60细胞增殖为对照组的5.3倍和5.8倍（p=0.005,p=0.002）。当同时过表达HS-5细胞中CCL2和VEGF时,MOLM13、HL60的细胞活力比单独过表达两者时明显升高（p<0.05）;MOLM13、HL60细胞增殖为对照组的7.3倍和6.1倍（p<0.001,p=0.008）。Transwell检测共培养体系中HS-5过表达CCL2或VEGF时,MOLM13、HL60的细胞数量增多,侵袭能力增强;HS-5同时过表达CCL2和VEGF时,两者的细胞数量比单独过表达时更多,侵袭能力也更强。结论:1.BMSCs分泌的CCL2、VEGF与AML疾病发展进程关系密切,其在AML的初诊（增高）、治疗后缓解（降低）、复发和难治（再次增高）不同阶段表达具有规律性,对评判疗效和复发难治有一定的参考价值;2.通过体外实验在细胞水平证实BMSCs通过分泌CCL2、VEG能够分别和共同促进AML细胞生长且可能有协同作用。霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma,HL）是一种淋巴系统的恶性肿瘤,好发于男性,多以颈部淋巴结无痛性进行性肿大为主要临床表现,约50%的患者有纵膈包块,约25%的患者有全身症状[1]。HL按病理特点分为经典型霍奇金淋巴瘤（Classical Hodgkin lymphoma,CHL）和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤（Nodular lymphocytic predominance Hodgkin lymphoma,NLPHL）,后者较罕见[2]。随着诊断技术及治疗方案的改进,目前CHL已成为治愈率较高的恶性肿瘤。ABVD方案、Standford V、BEACOPP等方案已在临床治疗CHL中取得了较好的效果。大多数CHL患者经一线治疗可以取得病情的长期缓解甚至治愈。但是目前仍有20%左右的CHL经一线方案治疗失败,或在治疗缓解后出现复发。目前对于复发、难治性CHL（Relapsed or refractory Classical Hodgkin lymphoma,RR-CHL）的治疗仍是临床工作中的难题。如何提高RR-CHL患者的长期生存是需要我们迫切需要解决的问题。目前对于RR-CHL的治疗尚无标准方案,前期一些临床研究显示在大剂量化疗后序贯自体造血干细胞移植（ASCT）,对RR-CHL患者的治疗取得了较好的效果[3]。自体造血干细胞移植具有采集过程安全、可重复采集、采集物被肿瘤细胞污染几率较小、移植后造血功能恢复快、患者痛苦小、移植后住院时间缩短、住院费用减少等优点。相比异基因造血干细胞移植,ASCT的并发症及毒副反应相对较小,在淋巴瘤的治疗上有优势。我科也对一些RR-CHL患者实施了ASCT,进一步探索ASCT对RR-CHL的治疗疗效。目的:观察自体造血干细胞移植对复发、难治性的经典型霍奇金淋巴瘤治疗疗效。方法:收集我中心2000年1月至2012年12月期间住院治疗的RR-CHL患者89例,其中45例患者接受了ASCT;而其余44例患者因相关原因未行ASCT,而继续采用化疗或化疗联合受累野放疗（Involved-field Radiotherapy,IFRT）。根据是否进行ASCT,分为ASCT组（n=45）和未移植组（n=44）。ASCT组患者均采用MOED+G-CSF方案动员自体外周血造血干细胞,采用CEAC方案作为预处理大剂量化疗方案。回顾性分析两组患者的治疗疗效。结果:ASCT组所有患者移植后均造血重建,无移植相关死亡病例。两组患者相比较,ASCT组出现消化道反应、Ⅳ级骨髓抑制、粒细胞缺乏伴发热的发生率明显高于未移植组（P<0.05）,两组患者在感染及出血症状的发生率无差异（P>0.05）,其余并发症的发生率也无明显统计学差异。中位随访54个月（12156个月）,ASCT组复发6例,死亡6例,死亡率13.3%;3年无进展生存率（PFS）为80.0%±6.0%,总生存率（OS）为91.1%±4.2%。未移植组复发8例,中位生存时间:114.00（50.25176.75）月,中位复发时间:36.00（12.17959.821）月,死亡21例,死亡率47.7%;3年PFS为59.1%±7.4%,OS为68.2%±7.0%。ASCT组三年OS及PFS均明显优于未移植组（P<0.01）。移植前PET检查评价为完全缓解（CR）的患者,其3年OS为100%,PFS为100%;移植前PET检查未达到CR的患者OS为87.5%PFS为71.9%,移植前PET评价为CR的患者OS及PFS均高于未达CR的患者（P<0.05）。采用Cox逐步回归对预后因素进行分析,显示未采用ASCT、LDH数值高于正常、有结外浸润、有骨髓侵犯是影响DFS的危险因素;而未ASCT、晚期病变以及有骨髓侵犯是影响OS的危险因素。结论:RR-CHL患者进行ASCT后,其3年OS及PFS均明显优于未移植患者,表明ASCT在治疗RR-CHL方案的疗效较好。ASCT治疗RR-CHL所出现的并发症未明显增多,相对安全。在移植前PET检查对疾病缓解情况的评判,对于移植后的长期生存有密切关系。ASCT对于RR-CHL疗效肯定,安全性好,可以作为这类患者的治疗推荐,值得在临床工作中进一步推广。
文钦[10]（2017）在《CX43修饰hUCSCs输注对自体造血干细胞移植后残留白血病的净化效应及机制》文中提出背景:造血干细胞移植是治疗急性白血病的有效手段,自体造血干细胞移植具有适用范围广、费用较少、安全性高等优点,但是移植后患者的复发率较高。微小残留病（Minimal Residual Disease,MRD）清除不彻底是其根源。造血微环境对白血病的生长、支持、庇护是白血病残留的重要因素。基质细胞是造血微环境的主要成分,具有调控白血病细胞生长、浸润,介导白血病的残留及耐药的作用。间隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication,GJIC）是相邻细胞间普遍存在的直接通讯方式。间隙连接蛋白43（connexin43,CX43）介导的GJIC广泛存在于骨髓基质细胞、基质细胞与造血细胞之间,是骨髓基质参与造血调控的必要条件。GJIC减弱或缺失在实体肿瘤的发生发展中起着重要作用。我们前期对急性白血病患者的骨髓基质细胞进行检测发现,其CX43表达明显降低,GJIC功能也明显减弱,对白血病的阻抑作用减弱;临床研究发现,自体造血干细胞移植后患者的GJIC功能长时间处于较低水平,导致骨髓微环境对白血病的阻抑作用减弱,可能是残留白血病易复发的因素。人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCSCs）在体外对白血病细胞株具有抑制增殖及促进凋亡的作用,体内能归巢至骨髓修复造血微环境。能否利用人脐血源基质细胞这一基因载体和对白血病细胞具有阻抑作用的特性,将Cx43基因转染新型人脐血源基质细胞与自体造血干细胞联合移植给预处理后的微小残留病小鼠模型,起到重建移植后GJIC功能以净化小鼠微小残留病的作用,从而降低自体移植后白血病的复发是值得验证的科学设想。本课题为国家自然科学基金项目（No.81070388）“CX43修饰人脐血源基质细胞移植对自体造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation,AHSCT）后残留白血病净化效应及机制研究”的研究内容。试图从改造白血病造血微环境功能GJIC角度去影响白血病细胞的增殖、分化过程,从而达到去恶化的目的,为探寻白血病治疗的新方法,积累理论和实验依据奠定基础。目的:观察Cx43修饰的新型人脐血源基质细胞移植在造血干细胞移植后的微小残留白血病小鼠骨髓微环境的定植和对异常骨髓微环境的修复作用,通过修复和增强移植后小鼠骨髓基质GJIC功能,改善骨髓微环境造血调控功能,实现对小鼠残留白血病体内净化。方法:1.CX43重组腺病毒载体（Ad-Cx43-GFP）转染人脐血源基质细胞按本科室已经建立的方法对健康产妇脐带血进行细胞分离并贴壁培养,获得人脐血源基质细胞。按我科常规方法构建Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞。分别用免疫荧光法、PCR、Western-Blot、光脱色荧光恢复技术（fluorescence recovery after photo bleaching,FRAP）检测转染后Cx43表达。2.构建人脐血源基质细胞及L615细胞共培养体系,体外观察CX43转染前后人脐血源基质细胞对L615白血病细胞的调节作用实验分三组:1)阴性对照组:L615细胞单独培养;2)hUCSCs/L615组:人脐血源基质细胞与L615细胞共培养组3)Ad-Cx43-hUCSCs/L615组:Ad-Cx43-GFP转染的人脐血源基质细胞与L615细胞共培养组CCK8法检测共培养后L615细胞的生长曲线,对比各组间L615细胞增殖率;流式细胞术检测共培养后L615细胞的凋亡率及细胞周期;Western-Blot检测共培养后L615细胞caspase3、6、7表达情况。3.构建L615白血病MRD小鼠模型,进行人脐血源基质细胞联合自体造血干细胞移植,观察转染后人脐血源基质细胞对自体造血干细胞移植小鼠残留白血病的抑制效应将L615细胞经尾静脉注入L615同系小鼠,3天后经腹腔注射环磷酰胺200mg/kg,从而获得L615白血病MRD小鼠模型。实验分为两组:1)BM组:骨髓造血干细胞移植组2)Ad-Cx43-hUCSCs+BM组:Ad-Cx43-GFP转染的人脐血源基质细胞联合骨髓造血干细胞移植组以残留白血病L615为受体鼠,以正常L615为供鼠,受鼠在第0天接受6.0 Gy 60Coγ射线TBI;照射后6 h,经尾静脉注射来自供鼠的骨髓造血干细胞细胞以及CM-Dil标记的Cx43修饰的人脐血源基质细胞,其中,BM组输注骨髓细胞为2×106个/只、Ad-Cx43-hUCSCs+BM组输注骨髓细胞及人脐血源基质细胞各1×106个/只。对不同组小鼠移植后尾静脉血行血常规检查以观察造血重建情况;对不同组小鼠移植后的骨髓进行涂片及骨髓病理切片检查;利用荧光标记追踪Ad-Cx43-hUCSCs移植后体内分布情况;对移植后小鼠的骨髓基质细胞进行GJIC功能检测,于移植后不同时间点分别取肝脏、脾脏、肺、肾脏进行病理切片及HE染色;观察各组小鼠移植后的生存率。结果:1.成功构建Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞:转染后24h可见绿色荧光表达,48h荧光表达达到峰值,转染效率（89.30±3.12）%。免疫荧光、RT-PCR以及Western-Blot证实CX43基因修饰后的hUCSCs Cx43表达水平较未转染组显着升高（CX43mRNA升高2倍,CX43蛋白表达升高3倍）（p<0.05）。进一步检测GJIC功能,结果显示:Ad-Cx43-GFP组细胞在漂白后40s时的荧光与淬灭前水平基本相当,而对照组无法恢复。2.CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对L615细胞的影响:1)以含20%胎牛血清的DMEM+PRMI1640混合培养基作为培养液,成功建立了两种细胞的体外接触共培养体系,共培养72h后,显微镜下可见基质细胞与L615细胞直接接触,电镜下能清晰的看到基质细胞粘附、包裹L615细胞。2)CCK8法检测细胞增殖:共培养48h,转染Cx43组L615细胞增殖受到明显抑制,直接测得OD值,Cx43转染组明显小于其余各组,两两间比较,Cx43转染组与另外两组差异均有统计学意义（p<0.05）。提示自共培养48h起,转染Cx43组L615细胞活力明显降低,存活率明显降低（p<0.05）。3)流式细胞仪检测细胞凋亡:转染CX43组L615细胞凋亡率为9.70±0.83%,明显高于未转染组（7.33±0.74%）和阴性对照组（2.50±0.85%）,差异有显着性（p<0.05）。4)流式细胞仪检测细胞周期:Cx43转染组G0/G1期细胞比例约为80.43%,较阴性对照组（84.43%）降低（P<0.05）;Cx43转染组S期细胞比例为10.42%,较阴性对照组（6.38%）升高（P<0.05）。G2/M期细胞比例Cx43转染组（8.52%）与单独培养组（8.15%）相似（P>0.05）。未转染组各细胞周期的比例与单独培养组无统计学差异。5)Western-Blot检测共培养后L615细胞caspase3、6、7表达:Cx43转染组caspase3表达较对照组升高1.8倍（P<0.05）。Cx43转染组caspase7表达较对照组升高7倍（P<0.05）。caspase6表达各组间无明显差异（P>0.05）。3.Ad-Cx43-hUCSCs对自体造血干细胞移植小鼠残留白血病的抑制效应:第0天以L615细胞经尾静脉注射L615同系小鼠致白血病,细胞量2×106个/只,于接种+5天即在外周血中查见白血病细胞,接种+8天骨髓、肝脏、脾脏均查见大量白血病细胞浸润,平均存活时间:11±1.71天。第3天经腹腔注射环磷酰胺,200mg/kg,化疗后+5天白细胞明显降低,化疗后+7天白细胞数开始回升,+17天接近正常,此时骨髓、肝脏、脾脏均未查见白血病细胞,于+23天疾病复发,平均存活时间27.33±2.49天。提示治疗后L615模型小鼠能达到完全缓解,存活时间延长,但体内仍有白血病残留,最后复发。1)Ad-Cx43-hUCSCs体内分布情况:移植后24小时即在小鼠骨髓、肝脏、脾脏、肺脏均能检测到Ad-Cx43-hUCSCs,移植+7天,骨髓、肝脏、脾脏中红色荧光细胞数量增加,荧光强度减弱,肺脏中红色荧光标记细胞减少。移植+14天,骨髓及其他脏器均不能查见红色荧光标记的细胞。2)移植小鼠血象变化情况:移植后,Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠白细胞从+8天开始、血小板从+11天开始回升速度明显快于BM组（P<0.05）比较差异具有统计学意义（P<0.05）。3)FRAP检测两组小鼠骨髓基质细胞的GJIC功能:BM+Ad-Cx43-hUCSCs联合移植组,骨髓基质细胞的荧光强度在淬灭后5min内恢复69.33±1.25%,较BM单独移植组（51.67±1.7%）明显增高,有统计学意义（P<0.05）。4)人脐血源基质细胞移植骨髓涂片和病理切片的变化:移植+17天,骨髓涂片显示,Cx43+hUCBDSCs+BM组未查见白血病细胞浸润（p<0.05）,BM组有大量白血病细胞浸润（图11）。骨髓活检显示:Cx43+hUCBDSCs+BM组未见白血病细胞,BM组骨小梁减少,细胞形态偏幼稚,成簇、成团分布（图12）。5)各组小鼠移植后28天内的生存率:Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠平均生存时间为26.9±1.52天,较BM组（23.70±1.99天）延长（p<0.05）Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠死亡率20%,较BM组35%降低（p<0.05）。结论:1.CX43基因腺病毒可成功转染hUCSCs,Ad-Cx43-hUCSCs的CX43表达水平上调,GJCI功能增加;2.成功建立人脐血源基质细胞及L615细胞共培养体系:Ad-Cx43-hUCSCs与L615细胞株共培养可抑制L615细胞增殖,上调L615细胞caspase3、7表达水平,促进其凋亡;3.Ad-Cx43-hUCSCs联合自体造血干细胞移植后,可归巢至骨髓、脾脏、肝脏、肺等器官;联合移植可促进小鼠造血重建;使骨髓基质细胞GJIC功能增强,有助于清除残留白血病,延长移植小鼠生存。
二、应用新技术对急性髓系白血病骨髓基质细胞粘附分子ICAM-1表达的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用新技术对急性髓系白血病骨髓基质细胞粘附分子ICAM-1表达的初步研究（论文提纲范文）
（1）OCT4基于ZO-1重塑细胞骨架在促进hHFMSC自我更新中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料与试剂 |
| 1.1 细胞样本 |
| 1.2 主要实验仪器及设备 |
| 1.3 主要试剂和耗材 |
| 1.4 培养基及实验试剂的配制 |
| 1.5 qPCR所用引物信息 |
| 1.6 所用抗体及稀释倍数 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 包被培养皿 |
| 2.1.2 细胞复苏 |
| 2.1.3 细胞传代 |
| 2.1.4 细胞冻存 |
| 2.2 OCT4 在贴壁亚群和悬浮亚群中的定位和表达 |
| 2.2.1 细胞免疫荧光染色观察OCT4 在贴壁亚群和悬浮亚群中的定位 |
| 2.2.2 qPCR检测贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4在m RNA水平的表达 |
| 2.3 Wright-Giemsa染色观察贴壁亚群和悬浮亚群的形态、直径及核质比 |
| 2.4 考马斯亮蓝染色观察贴壁亚群和悬浮亚群的骨架微丝形态 |
| 2.5 鬼笔环肽染色观察贴壁亚群和悬浮亚群中的丝状肌动蛋白F-actin的表达与分布 |
| 2.6 细胞粘附/分离实验检测贴壁亚群和悬浮亚群的粘附性差异 |
| 2.6.1 细胞粘附实验检测细胞-细胞外基质的粘附 |
| 2.6.2 细胞分离实验检测细胞-细胞的粘附 |
| 2.7 转录组测序分析组织特异性基因和增殖相关基因表达谱 |
| 2.8 Cell Counting Kit(CCK-8)检测贴壁亚群和悬浮亚群的增殖能力 |
| 2.9 二维克隆形成实验检测贴壁亚群和悬浮亚群的克隆形成能力 |
| 2.10 免疫细胞化学检测贴壁亚群和悬浮亚群中Ki67 增殖指数 |
| 2.11 qPCR检测贴壁亚群和悬浮亚群中增殖细胞核抗原PCNA的表达 |
| 2.12 qPCR检测贴壁亚群和悬浮亚群中ZO-1、ACTN2、E-cadherin、β-catenin以及Cyclin D1 的表达 |
| 2.13 免疫荧光检测β-catenin的入核情况 |
| 2.14 siRNA技术沉默悬浮亚群中ZO-1 基因表达 |
| 2.14.1 siRNA技术沉默悬浮亚群中ZO-1 基因表达 |
| 2.14.2 悬浮亚群中ZO-1 沉默效果验证 |
| 2.15 qPCR检测ZO-1 沉默后悬浮亚群中ACTN2、E-cadherin和 β-catenin以及Cyclin D1的表达 |
| 2.16 Western blot检测ZO-1沉默后悬浮亚群中Actin、E-cadherin和β-catenin的表达 |
| 3.统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1.贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4 的定位及过表达水平 |
| 1.1 OCT4 转导hHFMSC后产生贴壁亚群和悬浮亚群 |
| 1.2 贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4 的定位 |
| 1.3 贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4 的表达水平 |
| 2.不同的OCT4 过表达量对hHFMSC形态、骨架及粘附性的影响 |
| 2.1 Wright-Giemsa染色观察贴壁亚群和悬浮亚群的形态、直径以及核质比变化 |
| 2.2 考马斯亮蓝染色观察贴壁亚群和悬浮亚群的骨架微丝 |
| 2.3 鬼笔环肽染色观察贴壁亚群和悬浮亚群中丝状肌动蛋白F-actin的分布 |
| 2.4 贴壁亚群和悬浮亚群的粘附性差异分析 |
| 3.转录组测序分析贴壁亚群和悬浮亚群的去分化差异 |
| 3.1 组织特异性基因表达谱的分析 |
| 3.1.1 差异表达基因的筛选 |
| 3.1.2 组织特异性基因的富集分析 |
| 3.1.3 毛囊、表皮及皮肤附属器等组织特异性基因的表达情况 |
| 3.2 增殖相关基因的GO富集分析 |
| 4.不同OCT4 过表达量对贴壁亚群和悬浮亚群自我更新能力的影响 |
| 4.1 Cell Counting Kit(CCK8)检测贴壁亚群和悬浮亚群的增殖能力 |
| 4.2 二维克隆形成实验检测贴壁亚群和悬浮亚群的克隆形成率 |
| 4.3 免疫细胞化学检测贴壁亚群和悬浮亚群的Ki67 增殖指数 |
| 4.4 qPCR检测贴壁亚群和悬浮亚群中PCNA的表达 |
| 5.OCT4 通过ZO-1/Actin/β-catenin分子途径影响细胞骨架及自我更新的机制探索 |
| 5.1 贴壁亚群和悬浮亚群中ZO-1、ACTN2、E-cadherin、β-catenin以及Cyclin D1 的表达情况 |
| 5.2 免疫荧光观察OCT4 转导后β-catenin入核表达情况 |
| 5.3 沉默ZO-1对ACTN2、E-cadherin、β-catenin和 Cyclin D1 表达的影响 |
| 5.3.1 siRNA技术沉默悬浮亚群中ZO-1 基因 |
| 5.3.2 沉默ZO-1 对细胞骨架分子、粘附分子和增殖相关基因表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 OCT4重编程的成体干细胞自我更新的分子机制和研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）基于非标记定量的蛋白质组学和糖蛋白质组学方法优化及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 蛋白质翻译后修饰 |
| 1.3 定量蛋白质组学 |
| 1.4 定量糖蛋白质组学 |
| 1.5 定量糖组学 |
| 1.6 乳腺癌耐药机理的多组学整合分析进展 |
| 1.7 本课题的立项依据及主要研究任务 |
| 1.7.1 立项依据与研究意义 |
| 1.7.2 主要研究内容 |
| 第二章 非标记定量方法优化以及在人细胞系蛋白质组中的应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 细胞培养和蛋白质酶切 |
| 2.2.3 高p H反相多肽预分级 |
| 2.2.4 Oasis HLB SPE(solid phase extraction)多肽预分级 |
| 2.2.5 DDA的 LC-MS/ MS分析 |
| 2.2.6 DIA的 LC-MS/ MS分析 |
| 2.2.7 谱图库的建立 |
| 2.2.8 DIA数据分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DIA谱图库的建立策略 |
| 2.3.2 七个谱图库蛋白质覆盖度的比较 |
| 2.3.3 七个谱图库碎片离子的比较 |
| 2.3.4 使用七个谱图库DIA鉴定多肽和蛋白质比较 |
| 2.3.5 使用七个谱图库DIA鉴定多肽和蛋白质的数据完整性比较 |
| 2.3.6 使用七个谱图库DIA定量精密度比较 |
| 2.3.7 使用七个谱图库DIA定量准确度比较 |
| 2.3.8 DIA蛋白鉴定结果对信号转导通路、激酶和转录因子的覆盖 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于DIA的高通量、深度和估计绝对定量的血浆蛋白质组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.0 试剂和仪器 |
| 3.2.1 血浆收集 |
| 3.2.2 血浆中12 种高丰度蛋白质的去除和酶切 |
| 3.2.3 血浆蛋白质的酶切 |
| 3.2.4 高pH反相肽段分离 |
| 3.2.5 DDA的 LC-MS/MS分析 |
| 3.2.6 DIA的 LC-MS/ MS分析 |
| 3.2.7 谱图库的建立 |
| 3.2.8 DIA数据分析 |
| 3.2.9 统计分析和功能注释 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 基于HIAP-DIA的血浆蛋白质组学流程 |
| 3.3.2 超深度覆盖血浆谱图库、LC和DIA方法的优化 |
| 3.3.3 HIAP-DIA的绝对定量准确性比较 |
| 3.3.4 HIAP-DIA在 MDS血浆生物标志物发现中的应用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 三种不同Orbitrap DIA定量蛋白质组学性能评价 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 样品制备 |
| 4.2.3 DDA分析 |
| 4.2.4 DIA分析 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Plus,HF-X和 Lumos DIA定量性能实验流程和方法建立 |
| 4.3.2 Plus、HF-X和 Lumos对 QC样品DIA定量分析性能评价 |
| 4.3.3 Plus、HF-X和 Lumos对血浆样品DIA定量分析性能评价 |
| 4.3.4 Plus、HF-X和 Lumos对已知混合比例样品DIA定量性能评价 |
| 4.3.5 批次效应归一化方法整合分析Plus、HF-X和 Lumos DIA数据 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 整合转录组学、蛋白质组学、糖蛋白质组学和糖组学的乳腺癌细胞紫杉醇耐药机制研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 细胞培养 |
| 5.2.3 免疫印迹和凝集素印迹 |
| 5.2.4 流式细胞仪分析 |
| 5.2.5 凝集素微阵列分析 |
| 5.2.6 N-聚糖分析 |
| 5.2.7 蛋白质提取和酶切 |
| 5.2.8 DIA定量蛋白质组学分析 |
| 5.2.9 糖肽富集和LC-MS/ MS分析 |
| 5.2.10 GEO数据分析 |
| 5.2.11 磷酸激酶阵列测定 |
| 5.2.12 数据分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 经PTX处理的BC细胞中聚糖相关基因表达 |
| 5.3.2 MCF7-PTX和 MCF7 细胞的蛋白质组学分析 |
| 5.3.3 MCF7-PTX和 MCF7 细胞的N-聚糖谱 |
| 5.3.4 MCF7-PTX和 MCF7 细胞中糖结构含量的变化 |
| 5.3.5 MCF7-PTX和 MCF7 细胞的位点特异性N-糖肽分析 |
| 5.3.6 MCF7-PTX和 MCF7 细胞信号转导通路的变化 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 课题展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 I:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录 II:附表 |
（3）补肾解毒通络方阻止急性白血病复发机制的靶点研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究技术路线图 |
| 研究一补肾解毒通络方液相色谱质谱分析 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法及步骤 |
| 3.结果 |
| 4 小结 |
| 研究二补肾解毒通络方作用间充质干细胞的蛋白质组学分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验步骤 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 研究三补肾解毒通络方阻止白血病复发的网络药理学分析 |
| 1 实验数据 |
| 2 分析方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 研究四补肾解毒通络方潜在靶点的初步验证 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法及步骤 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 补肾解毒通络方质谱分析结果 |
| 2 补肾解毒通络方的潜在靶点 |
| 3 与补肾解毒通络方潜在靶点相关化合物 |
| 综述 网络药理学在中药研究中应用现状 |
| 1 概论 |
| 2 起源与发展 |
| 3 在中药研究中的发展 |
| 4 在中药抗癌研究中的现状 |
| 5 在中药抗癌研究中的模式 |
| 6 常用中药数据库 |
| 7 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）SRC-3在造血干细胞稳态调控与骨髓放射损伤中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 选题缘由 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.3 研究目标 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究方法 |
| 第二章 SRC-3 对骨髓造血干细胞稳态的调控作用分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 SRC-3 对骨髓造血干细胞的辐射保护以及功能调控作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 SRC-3 调控骨髓造血干细胞稳态和功能的机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 线粒体能量代谢参与造血干细胞稳态调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）CXCR4拮抗多肽及其与化疗药共载纳米胶束对难治性急性髓系白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 急性髓系白血病(AML)概述 |
| 1.2 AML的治疗现状与面临的挑战 |
| 1.3 CXCR4/CXCL12轴及其在AML耐药复发中的作用 |
| 1.4 CXCR4拮抗剂在AML治疗方面的研究现状 |
| 1.5 纳米药物递送系统在AML治疗方面的研究现状 |
| 1.6 前期相关基础 |
| 1.7 本课题的研究思路 |
| 第2章 材料、仪器设备和实验方法 |
| 2.1 主要材料和试剂 |
| 2.2 主要实验耗材和仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 难治性AML小鼠模型的建立 |
| 2.3.3 CXCR4拮抗多肽及其与化疗药共载胶束的制备和表征 |
| 2.3.4 AML细胞表面CXCR4表达的测定 |
| 2.3.5 竞争性结合实验 |
| 2.3.6 迁移实验 |
| 2.3.7 摄取实验 |
| 2.3.8 细胞活性实验 |
| 2.3.9 Western blot实验 |
| 2.3.10 体内定植实验 |
| 2.3.11 体内动员实验 |
| 2.3.12 体内治疗的给药方案 |
| 2.3.13 药效评价与分析实验 |
| 2.3.14 转录组测序和测序数据分析 |
| 2.3.15 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.3.16 生存实验 |
| 2.3.17 M-E5体内免疫原性检测 |
| 2.3.18 统计学方法 |
| 第3章 CXCR4拮抗多肽纳米胶束制备及其对难治性AML的治疗作用研究 |
| 3.1 CXCR4拮抗多肽纳米胶束(M-E5)的制备与表征 |
| 3.2 AML小鼠骨髓和脾脏细胞表面CXCR4的表达 |
| 3.3 M-E5抑制CXCR4抗体与AML细胞的结合 |
| 3.4 M-E5抑制CXCL12介导的AML细胞的迁移 |
| 3.5 M-E5抑制AML细胞在脾脏和骨髓中的定植 |
| 3.6 M-E5动员AML细胞到外周血循环 |
| 3.7 M-E5对AML小鼠的治疗作用与机制研究 |
| 3.7.1 对AML小鼠外周血、脾脏和骨髓中AML细胞比例的影响 |
| 3.7.2 对转录组水平基因表达量的影响 |
| 3.7.3 诱导脾脏和骨髓中AML细胞发生凋亡和分化 |
| 3.8 M-E5对AML小鼠生存期的影响 |
| 3.9 M-E5体内免疫原性研究 |
| 3.10 本章结论 |
| 第4章 CXCR4拮抗多肽与化药共载胶束构建及对难治性AML治疗作用研究 |
| 4.1 CXCR4拮抗多肽E5与盐酸阿霉素共载胶束(M-E5-Dox)的制备和表征 |
| 4.2 HL60/A细胞对M-E5-Dox的摄取 |
| 4.3 M-E5-Dox对HL60/A细胞的杀伤作用及胞内信号蛋白的影响 |
| 4.4 M-E5-Dox对AML小鼠的治疗作用与机制研究 |
| 4.5 M-E5-Dox对AML小鼠生存期的影响 |
| 4.7 讨论和本章结论 |
| 第5章 全文结论和展望 |
| 参考文献 |
| 非论文综述 免疫治疗在急性髄系白血病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录2——博士生期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后因素分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 应用RNA-seq初步研究MLL重排儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因与预后的相关性 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 MLL基因重排儿童急性白血病研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（7）甲状旁腺激素调控骨髓微环境影响白血病发病及多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 急性髓系白血病来源间充质干细胞(AML-MSCs)诱导K562-ADM形态转化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 甲状旁腺激素通过对AML-MSCs的作用调控K562/K562-ADM的 增殖与凋亡 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 甲状旁腺激素通过改变BMP4、CTGF的表达调控K562/K562-ADM的耐药 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 BMP4、CTGF表达水平与急性髓系白血病患者预后与耐药的相关性研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 英文缩写词与中英文对照 |
（8）骨髓病理在判断BMSC功能异常导致allo-HSCT后继发性植入不良中的作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 异基因造血干细胞移植后继发性植入不良对患者预后的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 骨髓基质细胞粘附分子在异基因造血干细胞移植后植入不良患者的表达差异 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 血管内皮细胞与异基因造血干细胞移植后继发性植入不良关系的研究.. |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 异基因造血干细胞移植后继发性植入不良的影响因素 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）骨髓基质细胞分泌CCL2和VEGF在急性髓系白血病中的作用（论文提纲范文）
| 中英文缩写对照表 |
| 第一部分 骨髓基质细胞分泌CCL2和VEGF在急性髓系白血病中的作用 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第一部分 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨髓基质细胞在急性髓系白血病中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 自体造血干细胞移植对复发、难治性的经典型霍奇金淋巴瘤的临床疗效分析 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 临床资料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第二部分 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 复发、难治性的经典型霍奇金淋巴瘤的治疗现状 |
| 参考文献 |
| 在职学习期间发表和撰写的文章 |
| 致谢 |
（10）CX43修饰hUCSCs输注对自体造血干细胞移植后残留白血病的净化效应及机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 CX43基因转染人脐血源基质细胞及GJIC功能的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对L615细胞调节作用的体外研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对小鼠自体造血干细胞移植后残留白血病净化作用的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞因子在急性白血病诊断、治疗、预后中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、应用新技术对急性髓系白血病骨髓基质细胞粘附分子ICAM-1表达的初步研究（论文参考文献）
- [1]OCT4基于ZO-1重塑细胞骨架在促进hHFMSC自我更新中的作用机制研究[D]. 阮迎春. 青岛大学, 2021
- [2]基于非标记定量的蛋白质组学和糖蛋白质组学方法优化及应用[D]. 周岳. 江南大学, 2021(01)
- [3]补肾解毒通络方阻止急性白血病复发机制的靶点研究[D]. 孙维龙. 天津中医药大学, 2021(01)
- [4]SRC-3在造血干细胞稳态调控与骨髓放射损伤中的作用与机制研究[D]. 胡梦佳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]CXCR4拮抗多肽及其与化疗药共载纳米胶束对难治性急性髓系白血病的治疗作用及机制研究[D]. 葛洋洋. 北京协和医学院, 2020
- [6]MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究[D]. 孙伊娜. 苏州大学, 2019(06)
- [7]甲状旁腺激素调控骨髓微环境影响白血病发病及多药耐药的研究[D]. 李海鹰. 兰州大学, 2019(02)
- [8]骨髓病理在判断BMSC功能异常导致allo-HSCT后继发性植入不良中的作用[D]. 刘思恒. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [9]骨髓基质细胞分泌CCL2和VEGF在急性髓系白血病中的作用[D]. 向茜茜. 第三军医大学, 2017(10)
- [10]CX43修饰hUCSCs输注对自体造血干细胞移植后残留白血病的净化效应及机制[D]. 文钦. 第三军医大学, 2017(12)
标签：造血干细胞论文; 白血病论文; 急性淋巴细胞白血病论文; 移植骨髓论文; 细胞增殖论文;