一、Creation of a Gene Knockout Population of Cotton（论文文献综述）
梁栋[1]（2021）在《扑草净降解菌Pseudomonas sp. DY-1的降解机制及其在污染土壤修复中的应用研究》文中研究指明扑草净（Prometryn）作为一种典型的三嗪类除草剂,因其杀草谱广、高效且药效持久等特点,在农业生产中被广泛应用。然而,农田中即便是微量的扑草净残留也会对后茬作物产生不同程度的药害,抑制作物生长,最终导致减产,严重时可造成绝收。因此,扑草净的过量施用会对农业生产产生一定的负面影响,其程度取决于后茬作物对扑草净的敏感程度。此外,农田土壤中残留的扑草净也会对生态系统和人类健康造成严重的威胁。这一系列由扑草净残留引起的问题己成为近年来的研究热点。生物强化是以微生物的生长代谢活动为核心的一项技术,该技术因其高效、无污染、低耗能等优点而逐渐成为治理环境污染的重要手段之一。目前已有部分研究报道了自然界中存在的能够降解扑草净的微生物,然而这些研究主要集中于降解菌株的筛选与降解途径的分析,关于微生物中与扑草净降解相关的功能基因仅有三嗪水解酶（TrzN）的编码基因被报道,可见对于该方面的研究仍存在一定局限性。此外,全基因组测序技术以及生物强化技术尚未被用于扑草净降解菌株的研究。因此,阐明扑草净的微生物代谢机制、鉴定降解过程中的中间产物、挖掘降解菌株基因组中的功能基因以及分析在生物强化过程中土着微生物群落结构的变化可为扑草净污染场地的生物修复提供理论支撑,同时也可为研究其它三嗪类除草剂降解机理提供参考依据,具有较大的理论意义和实际的应用价值。本研究以实验室前期分离的一株高效扑草净降解菌株Pseudomonas sp.DY-1为材料,利用单因素试验结合响应面法研究了菌株DY-1的最适降解条件,结果表明,菌株DY-1的最适降解条件为32.6℃,pH 7.9,接种量为5.8%。在该优化条件下,菌株DY-1在40 h内可将浓度为50 mg/L的扑草净降解完全。此外,对菌株DY-1降解特性的研究表明,该菌株不仅可耐受并降解浓度高达500 mg/L的扑草净,同时其在NaCl浓度为1000 mg/L的高盐浓度下仍然具备降解活性。在菌株DY-1以其它三嗪类除草剂为底物的降解谱实验中,观察到菌株DY-1对西草净（Simetryn）、敌草净（Desmetryn）、莠灭净（Ametryn）和嗪草酮（Metribuzin）均具有良好的降解效果。采用高效液相色谱与质谱联用技术（High-performance liquid chromatography/mass spectrometry,HPLC/MS）,对菌株DY-1降解扑草净过程中的中间产物进行鉴定。检测到3个保留时间分别为8.07 min、12.93 min和8.4 min,质荷比分别为258 m/z、274 m/z和212m/z的产物峰。根据扑草净的分子结构特征,结合各化合物的特征碎片离子峰,将这3个产物分别鉴定为扑草净的亚砜、砜和羟基衍生物,并由此推测了菌株DY-1降解扑草净的主要途径。在降解过程中,扑草净首先被氧化生成亚砜扑草净,再经由第二步氧化作用生成砜扑草净,最后水解生成终产物2-羟基扑草净。采用PacBio RS II测序平台对菌株DY-1的全基因组进行测序,将所得数据进行相应处理后对该菌株的全基因组序列进行了注释分析。菌株DY-1的基因组大小约为5.89 M,包含1个环状染色体和1个质粒。该基因组的总GC含量为62.94%,共含有5543个基因,平均长度为942 bp;含有71个tRNA,16个rRNA以及4个ncRNA。采用全基因组挖掘技术分析了菌株DY-1的应用潜力。结果表明,菌株DY-1的染色体中包含多种参与环境胁迫响应和有毒物质抗性等有利于菌株适应外界环境的基因,这些基因对细菌在恶劣环境中的生存起着至关重要的作用。以菌株DY-1全基因组注释信息为基础预测了可能的扑草净降解基因。该基因全长1530bp,编码509个氨基酸。经多序列比对,表明该基因的表达产物为一种Ⅰ型Baeyer–Villiger单加氧酶（Baeyer-Villiger monooxygenases,BVMO）,与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37Rv中的乙硫异烟胺单加氧酶Eth A具有52.67%的同源性。以菌株DY-1基因组为模板,设计特异性引物扩增全长目的基因,构建表达载体并转化至Escherichia coli BL21（DE3）。重组菌经IPTG诱导和Ni-NTA柱纯化后,SDS-PAGE显示所得特异性条带大小约为60 k Da,与预计结果相符。使用纯化蛋白与300μM扑草净溶液配置反应体系进行反应,通过高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）验证,结果显示反应进行1 h后该蛋白的扑草净降解率可达80%左右。借助λ-Red重组酶系统进行的基因敲除实验表明,敲除株在反应开始的10 h内几乎无法检测到降解活性,表明该基因在菌株DY-1降解扑草净的过程中发挥着重要的作用,该基因可被鉴定为新的扑草净氧化酶编码基因。将菌株DY-1投加到含有50 mg/kg扑草净的土壤中以构建扑草净污染土壤的生物强化系统,21 d后检测到土壤中扑草净的降解率为78.1%。该菌株应用特性的研究结果表明土壤中扑草净降解效果受土壤温度、土壤含水量和菌株接种量等因素的影响,菌株DY-1在温度为30℃,土壤含水量为20-30%,接种量为1×108 CFU/m L的条件下可达到其最佳降解效果。此外,外源营养物质的添加也能够促进土壤中扑草净的降解。使用菌株DY-1的培养液对受扑草净药害的玉米幼苗植株进行灌根试验,处理10 d后观察到玉米植株长势恢复至正常水平,表明该菌株对扑草净的药害具有明显的解除作用。利用Miseq高通量测序技术对生物强化系统中微生物群落结构进行动态监测,建立了微生物群落结构与功能的关系。结果表明,投加菌株DY-1促进了扑草净污染土壤中微生物群落的演替,投加菌株所属的假单胞菌属（Pseudomonas）成为体系中的优势种群,增加了土壤微生物对扑草净的耐受与降解能力。
张小雪[2]（2021）在《黄萎病菌VdxyL3和VdITP1基因对棉花的抗病性影响》文中进行了进一步梳理
曹玲[3]（2021）在《Hox基因介导的毒死蜱对热带爪蟾胚胎致畸的分子机制初探》文中指出
冯丹丹,邓蕾,汪祖鹏,潘慧,李文艺,钟彩虹,李黎[4]（2021）在《寄主诱导的基因沉默在增强植物真菌病害抗性方面的研究进展》文中研究说明寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术以RNAi技术为基础,可从反向遗传学角度研究基因功能,同时可创制具有持久抗性且稳定遗传的抗病品种,为增强植物抗病性提供了新的视角。本文阐明了HIGS技术的原理,总结了近年来该技术在增强植物真菌病害抗性方面最新的研究进展,分析了HIGS技术的优、缺点,并对HIGS技术的应用前景进行了展望。
孙琳[5]（2021）在《CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建》文中提出棉花既是一种重要的纤维作物,也是重要的油料作物。由于棉花生育期较长,从播种到收获期间生长发育的各个时期都会受到多种虫害的影响,因此虫害已经成为影响棉花产量和纤维品质的重要因素之一。棉花作为世界上四大转基因作物之一,Bt棉的应用在一定程度上控制了鳞翅目害虫带来的影响,但导致刺吸式等非Bt基因靶标害虫危害的日益加重逐步成为危害棉花的主要害虫,迫使杀虫剂大量喷施,造成多种害虫对农药的抗性随之进化,这不仅增加了棉花种植成本而且破坏生态环境。另一方面随着Bt棉种植区域的扩大和种植时间的不断延长,害虫对Bt棉的抗性也随之增强,其带来的风险也不容忽视。因此目前需要开发新的策略应用于棉花抗虫研究。鉴定棉花内源抗虫基因用于抗虫育种,可以有效补充Bt棉在抗虫应用中的不足。而开发一种高效、可靠的基因功能分析策略是进行棉花功能基因组学研究的重要方向。CRISPR/Cas9系统现已成为一种强大而有效的基因编辑工具。本课题组已经在棉花中成功构建的高效、精确的适用于棉花的CRISPR/Cas9基因组编辑系统使得大规模构建基因编辑突变体材料成为可能。本研究介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统的高效筛选棉花内源抗虫相关基因突变体库构建的方法,为棉花功能基因组学和育种方向研究提供了高效的新策略。主要取得了以下研究结果:1.sgRNA设计与载体文库构建本研究从之前的转录组和代谢组学分析中选择了528个差异基因,通过全基因组比对筛选到968个高特异性的sgRNA靶向502个基因。通过混合引物池的方法经一次引物设计、PCR扩增和载体克隆,只需花费构建一个载体的时间就可以快速构建大规模载体文库。2.棉花基因组编辑突变体库创建及目的基因识别利用农杆菌介导的遗传转化和组织培养过程,共获得达5000多个独立的胚性愈伤组织,获得2000多独立的基因编辑T0棉花植株。本研究使用基于条形码的高通量测序技术对T0植株的目的基因进行测序分析。我们对1380个T0植株和576份愈伤组织检测了sgRNAs并鉴定了其序列,共鉴定出555条靶向412个基因的不同sgRNA序列,已检测突变体材料的基因覆盖率达82.07%。3.高效的编辑率和遗传率通过高通量测序,软件分析和人工筛选,共获得369个有效T0代基因组编辑数据。结果显示T0代发生有效编辑比例达97.29%,其中,75.61%材料表现出高效的突变率,编辑率超过80%,编辑类型以短片的插入缺失为主。棉花基因组编辑位点平均遗传力高达84.78%。4.低脱靶风险通过高通量测序对9个潜在的脱靶位点进行了检测,结果中没有发现有任何脱靶效应产生,进一步证实CRISPR/Cas9系统在棉花基因组编辑中发生脱靶概率低,具有很高的特异性。5.高效的表型鉴定率在对200个株系的T1和T2代昆虫生物测定中发现有超过10%的基因突变体材料表现出对虫害的抗性改变。表明针对特定性状（本研究是针对抗虫性状）构建高通量突变体库进行特定性状表型筛选是一种高效的候选基因筛选策略。6.抗虫相关候选基因通过抗虫鉴定发现GhMLP423、GhDML1、GhZAT10等基因的突变材料表现出一致的抗性改变表型。本研究所鉴定得到的候选基因在植物抵抗生物和非生物胁迫方面都发挥了十分重要的作用。通过初步验证发现GhMLP423可能参与棉花抗虫相关JA信号路径传导。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了一个同时使用近千个sgRNA针对植物基因组上数百个基因的混合载体文库,并快速生成一个用于表型筛选的高覆盖度的突变库,并鉴定到一些抗虫相关候选基因。该技术为棉花功能基因组学研究提供了坚实的基础。本研究方法也适用于其他基因组复杂的多倍体植物,对其他作物研究具有一定的参考价值。
任飞荣[6]（2021）在《烟粉虱水平转移基因合成生物素和泛酸的作用研究》文中进行了进一步梳理烟粉虱（Bemisia tabaci）是一个包括至少36个隐种的复合种,其中隐种MEAM1是世界性重大入侵农业害虫,其含菌细胞内定殖原生共生菌Porteria和次生共生菌Hamiltonella。在长期的进化过程中,烟粉虱共生菌的基因组丢失了很多必需基因。有研究发现,多个细菌源水平转移基因在烟粉虱隐种MEAM1的含菌细胞中高表达,可补充共生菌缺失的基因,然而这些基因的功能尚不清楚。前期研究发现,烟粉虱隐种MEAM1基因组携带细菌源水平转移基因bioA、bioD、bioB和panBC,推测它们可能参与维生素B7（生物素）和B5（泛酸）的合成。本论文系统研究了这些基因在烟粉虱体内生物素和泛酸合成中的作用,主要研究结果如下:1.微生物法检测小型昆虫生物素比较营养缺陷型植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum ATCC No.8014）不同继代次数,不同培养方式,不同培养时间拟合的生物素测定曲线,建立了一套小型昆虫生物素含量的测定方法:微氧条件下,使用5代以内菌株,培养19 h以上,测定菌液630 nm的吸光度,可拟合具有良好线性的标准曲线,并依此测定了烟粉虱、温室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）和褐飞虱（Nilaparvata lugens）的生物素含量。该法的生物素加标回收率达94%以上,证明此法能高效精准地测定小型昆虫的生物素含量。2.共生菌影响宿主昆虫B族维生素的合成抗生素处理去除了烟粉虱隐种MEAM1的次生共生菌Hamiltonella和温室白粉虱的次生共生菌Arsenophonus,可显着降低粉虱中维生素B2、B3、B6和B7的含量,表明这两种次生共生菌能合成维生素B2、B3、B6和B7。去除烟粉虱隐种MEAM1的原生共生菌Portiera,可显着降低泛酸含量,表明Portiera参与维生素B5的合成。3.粉虱水平转移基因bioA、bioD、bioB和panBC的进化起源烟粉虱基因组内,基因bioA和bioD有两个拷贝,其中一个为短片段,推测为假基因;基因bioB和panBC均有内含子。多个烟粉虱隐种携带bioA、bioD、bioB和panBC基因,且编码的蛋白序列高度一致。烟粉虱共生菌Hamiltonella和Arsenophonus携带基因bioA、bioD和bioB,蚜虫原生共生菌Buchnera基因组携带panB和panC。但这4个粉虱水平转移基因编码的氨基酸序列与共生菌Hamiltonella、Buchnera和大肠杆菌（Escherichia coli）编码的氨基酸序列相似度较低。系统发育分析显示,烟粉虱水平转移基因bioA、bioD和bioB与床虱和飞虱携带的共生菌Wolbachia以及粉虱寄生蜂恩蚜小蜂携带的共生菌Cardinium具有相同的进化起源。系统发育分析表明烟粉虱水平转移基因panBC来源于Pseudomonas。4.水平转移基因bioA、bioD、bioB和panBC可功能补偿营养缺陷型大肠杆菌大肠杆菌（E.coli）基因（bioA、bioD、bioB、panB和panC）突变后,突变菌株的生长量显着降低,回补烟粉虱相应基因（bioA、bioD、bioB和panBC）的突变菌株在缺乏生物素或泛酸的培养基中生长量恢复。据此,推测烟粉虱基因bioA、bioD、bioB和panBC具有合成生物素和泛酸的功能,且烟粉虱基因panBC兼具panB和panC两个基因的功能。5.水平转移基因bioA、bioD和bioB能为烟粉虱合成生物素,并影响其适合度缺失Hamiltonella的烟粉虱,bioA、bioD和bioB基因表达显着上调。烟粉虱基因bioA、bioD和bioB原核表达产生重组蛋白BioA、BioD和BioB。利用免疫荧光标记烟粉虱的含菌细胞和中肠发现,BioA和BioD主要分布于含菌细胞膜周围的细胞质中,BioB除分布于含菌细胞膜周围,在细胞质其他位置也有分布,三个蛋白与Hamiltonella在含菌细胞内的分布位置不同,在烟粉虱中肠未标记到这三个蛋白。缺失Hamiltonella的烟粉虱含菌细胞内BioA、BioD和BioB免疫荧光信号未发生显着变化,表明BioA、BioD和BioB表达不受共生菌Hamiltonella的影响。烟粉虱的bioA、bioD和bioB基因沉默后,蛋白BioA、BioD和BioB在含菌细胞内的表达水平降低,生物素含量降低,死亡率提高、产卵量下降,但共生菌Hamiltonella的滴度未明显变化,表明Hamiltonella合成的生物素不足以补偿烟粉虱bioA、bioD和bioB基因沉默所降低的生物素。基因bioA沉默后回补生物素,烟粉虱死亡率降低,产卵量增加。这些结果表明水平转移基因bioA、bioD和bioB可以合成生物素,并提高烟粉虱的适合度。6.水平转移基因panBC和Portiera协作合成泛酸,调控烟粉虱和共生菌的适合度烟粉虱基因panBC经过原核表达产生重组蛋白PanBC。利用免疫荧光标记烟粉虱的含菌细胞和中肠发现,PanBC和Portiera都分布于含菌细胞的细胞质内。缺失Portiera的烟粉虱含菌细胞PanBC蛋白表达水平降低。显微注射ds RNA能抑制panBC编码的蛋白PanBC在含菌细胞中表达,降低烟粉虱泛酸含量和Portiera滴度,同时发现烟粉虱死亡率提高、产卵量下降。基因panBC沉默后回补泛酸,烟粉虱的死亡率降低,产卵量增加,Portiera滴度恢复,PanBC表达量也随之恢复。以上结果证明基因panBC能与Portiera协作合成泛酸,并调控烟粉虱和共生菌的适合度。本研究证明了取食植物韧皮部汁液的粉虱携带的共生菌Hamiltonella和Arsenophonus可合成4种B族维生素,并证明了烟粉虱基因bioA、bioD和bioB也能合成生物素,并能提高烟粉虱的适合度;烟粉虱基因panBC与Portiera可协作合成泛酸,泛酸介导烟粉虱和Portiera适合度的共调控。因此,本研究提出了昆虫合成B族维生素的新模式,即昆虫的细菌源水平转移基因可以独自或者与共生菌协作合成B族维生素。本论文证明了真核生物编码的细菌源水平转移基因获得功能需要多拷贝或获得内含子的假说,推测具有功能的水平转移基因将加速共生菌（如Hamiltonella）基因组的退化,并促进烟粉虱-共生菌的互惠共生。以上研究结果不仅深化了我们对昆虫-共生菌协同进化关系及其互作机理的认识,也为烟粉虱的精准防控提供了新的靶标基因。
刘佳[7]（2020）在《嗜线虫致病杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白的特性和功能》文中提出嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdus nematophila）属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）,是一类与小卷蛾斯氏线虫（Steinernema carpocapsae）互惠共生的革兰氏阴性细菌,具有广谱的杀虫和抑菌活性,其分泌的杀虫毒素以及抑菌活性物质中包括几丁质酶和几丁质结合蛋白。为了明确嗜线虫致病杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白的特性和功能,本研究对其基因组中的几丁质酶基因和几丁质结合蛋白基因进行了生物信息学分析,通过原核表达获得了重组几丁质酶和几丁质结合蛋白,随后测定了重组几丁质酶和几丁质结合蛋白的生理生化特征以及生物活性,最后通过敲除几丁质酶基因Xn-chi60和Xn-chi70来了解这两种几丁质酶与Xn-Tc毒素的关系。现将主要结果总结如下:1.嗜线虫致病杆菌基因组中含有4个几丁质酶基因和1个几丁质结合蛋白基因,其编码的几丁质酶分别属于18家族几丁质酶和20家族几丁质酶。通过对GenBank中嗜线虫致病杆菌基因组进行分析,从中找到了 2个18家族几丁质酶基因 Xn-chi60和Xn-chi70（登录号:KC701470 和 KC701471）、2 个 20家族几丁质酶基因Xn-chi1 01和Xn-chi25（登录号:MT199128和MT219905）和1个几丁质结合蛋白基因Xn-cbp（登录号:KY817118）。通过生物信息学分析可知Xn-chi60基因序列全长为1608bp,编码535个氨基酸,蛋白质理论分子量为59.3kDa,等电点为4.51;Xn-chi70基因序列全长为1947bp,编码648个氨基酸,蛋白质理论分子量为72.4kDa,等电点为4.89;Xn-chi101基因序列全长为2700bp,编码899个氨基酸,蛋白质理论分子量为101.43kDa,等电点为6.94;Xn-chi25基因序列全长为678bp,编码225个氨基酸,蛋白质理论分子量为25.31kDa,等电点为10.21;Xn-cbp基因序列全长为600bp,编码199个氨基酸,蛋白质理论分子量为22.08kDa,等电点为8.00。这五种蛋白均为水溶性蛋白,都不含跨膜结构域,除Xn-Chi60和Xn-Chi70外,其余三种蛋白均含有信号肽。二级结构预测显示Xn-Chi60蛋白含有19个α螺旋和14个β折叠;Xn-Chi70蛋白含有24个α螺旋和20个β折叠;Xn-Chi101蛋白含有25个α螺旋和36个β折叠;Xn-Chi25蛋白含有8个α螺旋和6个β折叠;Xn-CBP蛋白含有4个α螺旋和7个β折叠。三级结构预测显示,Xn-Chi60和Xn-Chi70蛋白具有典型的（β/α）8双桶结构,属于18家族几丁质酶;Xn-Chi101和Xn-Chi25蛋白具有α/β桶形折叠,属于20家族几丁质酶。从进化图谱中可以看出18家族几丁质酶Xn-Chi60和Xn-Chi70来自于同一分支,20家族几丁质酶Xn-Chi101和Xn-Chi25来自于同一分支,Xn-CBP与致病杆菌属和发光杆菌属细菌的几丁质结合蛋白来自于一个分支。2.嗜线虫致病杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白基因的表达及重组蛋白的纯化。构建了Xn-chi101基因和Xn-cbp基因的原核表达载体pET-28a-chi101和pET-28a-cbp,分别将其转入到大肠杆菌（Es cherichi coli）Transetta（DE3）和 Trans BL21（DE3）中,成功表达出了重组蛋白Xn-Chi1 01和Xn-CBP。重组蛋白均以包涵体的形式存在,在诱导温度为28℃,IPTG浓度为0.5mmol/L时,包涵体表达量最高。经过对包涵体的变复性后,均得到了条带单一的可溶性蛋白。底物结合性试验结果表明,Xn-CBP对胶体几丁质的结合能力最强。3.明确了嗜线虫致病杆菌几丁质酶的酶学特性。利用DNS法对重组几丁质酶Xn-Chi60、Xn-Chi70和Xn-Chi101的酶学性质进行了检测。结果表明,Xn-Chi60的最适pH为6.0,最适温度为50℃,Ca2+、Cu2+、Fe3+、DTT、SDS和EDTA对该酶有抑制作用,Zn2+和Mn2+对该酶有促进作用;Xn-Chi70 的最适 pH 为 6.0,最适温度为 50℃,Ca2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、DTT、SDS和EDTA对该酶有抑制作用,Zn2+和Mn2+对该酶有促进作用;Xn-Chi101的最适pH为7.0,最适温度为40℃,Ca2+、Cu2+、Fe3+、DTT和SDS对该酶有抑制作用,Mg2+对该酶有促进作用。底物特异性以及酶动力学试验结果表明,三种几丁质酶均能特异性的结合胶体几丁质,且Xn-Chi70的结合能力高于Xn-Chi60和Xn-Chi101。4.重组几丁质酶和几丁质结合蛋白的杀虫和抑菌活性。杀虫活性结果表明,浓度为1mg/mL时,几丁质酶和几丁质结合蛋白对棉铃虫2龄幼虫的体重抑制率均达到80%以上。其中Xn-Chi70对棉铃虫的生长抑制作用最强,与Bt-Chi73类似,体重抑制率超过90%。不同的几丁质酶对Bt Cry1Ac毒素和Xn-Tc毒素增效作用差别较大,其中Xn-Chi70对Bt Cry1Ac毒素和Xn-Tc毒素的增效作用均最高,与Bt-Chi73类似。Xn-Chi101的增效作用不明显,Xn-Chi60和Xn-CBP无增效作用,但是Xn-CBP能提高几丁质酶对毒素的增效作用。抑菌活性结果表明,几丁质酶和几丁质结合蛋白对葡萄白腐病菌、棉花枯萎病菌、马铃薯早疫病菌和马铃薯黑痣病菌的菌丝生长和孢子萌发均有不同程度的抑制作用。总体来看,来自嗜线虫致病杆菌几丁质酶的抑菌活性明显低于来自苏云金芽孢杆菌的Bt-Chi73。5.明确了嗜线虫致病杆菌几丁质酶Xn-Chi60和Xn-Chi70与Xn-Tc毒素的关系。通过pJQ200SK自杀质粒敲除系统成功的筛选出了Xn-chi60单基因敲除株、Xn-chi70单基因敲除株以及Xn-chi60和Xn-chi70双基因敲除株。提取野生型菌株以及敲除株的Xn-Tc毒素进行杀虫活性测定,结果表明,Xn-chi60单基因敲除株、Xn-chi70单基因敲除株以及Xn-chi60和Xn-chi70双基因敲除株Xn-Tc毒素对棉铃虫的毒力较野生型菌株分别降低了 3.861倍、4.517倍和102.240倍。该结果说明这两个几丁质酶的存在对Xn-Tc毒素的毒力是不可或缺的。
徐伟芳[8]（2020）在《桑树内生枯草芽孢杆菌7PJ-16对桑椹菌核病生防作用及机理的研究》文中提出桑椹菌核病,又称白果病或白椹病,是一种侵染果桑的主要真菌性病害。根据病原菌种类以及染病桑果的病症差异,可将该病害分为肥大性桑椹菌核病、小粒性桑椹菌核病和缩小性桑椹菌核病。不同病原菌引起的桑椹菌核病侵染循环基本一致,该病在我国重庆、四川、浙江等地均有发生,染病桑果失去商品与食用价值,给果桑产业带来极大经济损失。由于该病传播速度快、蔓延范围广、危害程度大,导致其有效防控难度较大。目前对桑椹菌核病的防治仍主要依赖于化学农药,但过量使用化学药剂不仅造成环境污染,亦会威胁桑椹食用安全。利用植物内生菌进行桑椹菌核病的生物防控将有利于果桑产业的健康发展,亦可为其他桑树病害防控提供新策略。本实验室前期从健康桑树中寻获一株对桑椹菌核病具有生防潜能的内生芽孢杆菌7PJ-16（前期研究鉴定其为Bacillus tequilensis 7PJ-16）。为进一步探索该菌株的生防作用及机理,本研究首先通过动物安全性实验和侵染定植实验,评估Bacillus sp.7PJ-16的生防潜力;并在优化7PJ-16菌株产抑菌活性物质发酵条件的基础上,大量制备菌悬液和活性发酵上清液,检测其对病原菌生长、桑园土壤微生态的影响,及田间防病与温室促生效果;进而基于对7PJ-16菌株的全基因组和互作转录组分析,挖掘并验证其发挥生防作用的功能基因,最终结合对抑菌活性物质的分离鉴定与促生相关物质的检测,系统揭示Bacillus sp.7PJ-16的生防机理。本研究主要结果如下:1.内生芽孢杆菌7PJ-16生防潜力的评估利用目标菌株生物防治桑椹菌核病需确保其使用安全。本研究利用Bacillus sp.7PJ-16菌悬液与发酵上清液,通过灌胃与肌肉注射两种接种方式处理小鼠后,所有小鼠均生长良好,且与对照相比,处理组小鼠的体重变化、血液常规指标与脏器指数均无显着差异;将Bacillus sp.7PJ-16菌悬液与发酵上清液处理的桑叶饲养家蚕,均未引起家蚕中毒死亡,且各处理组家蚕的生长发育及全茧量、茧层量、茧层率等蚕茧经济指标与对照组基本一致。动物安全性实验结果显示,Bacillus sp.7PJ-16菌悬液及其发酵上清液均不影响小鼠和家蚕的正常生长,具有较高的生物安全性。在宿主植物中有效定植将有利于生防菌更好地发挥防病促生作用。Bacillus sp.7PJ-16菌株具有较好的生物膜形成能力与运动性,这使其在植物体内具有较强的定植潜能。利用pGFP22质粒电转化7PJ-16菌株,成功获得与野生型7PJ-16菌株生物学特性无明显差异、且携带绿色荧光蛋白及氯霉素抗性标记的芽孢杆菌7PJ-16/gfp菌株。通过镜检观察浸根接种7PJ-16/gfp菌株的桑苗发现,接种1天后,该标记菌株在根尖、侧根、根毛等位点吸附和大量聚集,此时的菌体主要存在于根部侵染点的外表皮处;接种2-7天后,细菌逐渐向内表皮及维管组织中定植,在细胞内呈分散或聚集状分布;接种14-16天后,完成根部定植的菌体通过木质部导管向茎中迁徙,并于接种20天后,成功定植在叶片细胞间隙与叶脉中。进而采用稀释涂布平板法,在含氯霉素平板上定量分析7PJ-16/gfp在桑树各组织器官内的消长动态。结果显示,标记菌株在浸根处理的桑苗根、茎、叶,以及田间单独喷菌处理的花（果）部位均具相同的动态变化规律,即先上升后下降最终趋于稳定。显微观察及重分离实验结果表明,Bacillus sp.7PJ-16可在桑根、茎、叶和花（果）中实现成功定植。进一步利用组织分离培养法在2015与2016年冬季、春季、秋季（共计六个季节）,从四个果桑品种（川桑7637、长果桑、红果2号及新伦教）茎部中共分离获得608株内生细菌分离株。不同季节桑树内生菌种群分布结果显示,Bacillus spp.在连续两年各季节内生细菌中所占比例均在20%以上,尤以2016年冬季分离得到的芽孢杆菌最多,占该季节细菌总分离株的37.21%;同时Bacillus spp.的种群分布对宿主品种无明显偏好性,为多个品种果桑内生细菌的优势菌群。健康桑树内生细菌种群分布结果显示,Bacillus spp.能够长期以较高丰度稳定存在于不同品种的果桑体内。2.内生芽孢杆菌7PJ-16防病促生效果的研究为给后续室内抑菌和室外田间生防提供充足的实验材料,本文利用单因素与正交实验优化Bacillus sp.7PJ-16产生抑菌活性物质的发酵条件。发酵优化结果显示,该菌株最佳培养基配方与发酵条件为:蛋白胨0.5%、硫酸铵0.75%、麦芽糖3%、Na2HPO4 0.3%、培养温度为30℃、初始pH值为7.5、接种量为4%、装瓶量为30%、发酵时间为120 h。优化后的发酵培养基和培养条件有利于抑菌活性物质的合成。利用优化培养基大量发酵Bacillus sp.7PJ-16,收获菌悬液和发酵上清液,检测其对病原菌生长和桑园土壤微生态的影响。结果显示,7PJ-16菌悬液和发酵上清液均可明显抑制菌核萌发、菌丝生长、子实体生长发育以及孢子活力等菌核病原菌生长过程;与清水对照相比,经生防菌处理的桑园土壤中放线菌门的细菌比例显着升高,厚壁菌门中芽孢杆菌属的丰度亦有上升趋势,且β多样性分析结果显示,接种生防菌的土壤菌群结构更加稳定。连续两年的田间生防实验结果表明,不同浓度菌悬液和不同稀释倍数发酵上清液均能不同程度防控桑椹菌核病的发生,其中施用3次1.0×109 CFU/mL菌悬液处理组的田间防效最高（90.84%）,其防效甚至稍优于化学农药处理组（90.52%）,且该处理组对桑果的生长具有一定的催熟作用。温室浸种和盆栽实验结果显示,不同浓度菌悬液和不同稀释倍数发酵上清液对桑种萌芽和桑幼苗生长的影响差异较大,其中1.0×106CFU/mL的菌悬液和100倍稀释的发酵上清液能显着提升桑种发芽势和发芽率,且其对桑幼苗生长的各项指标均能起到促进作用。3.内生芽孢杆菌7PJ-16防病促生作用的分子机制研究Bacillus sp.7PJ-16菌株全基因组测序分析结果显示,该菌株基因组是由一条大小4.2 M的环形染色体以及两个内生质粒构成。基于芽孢杆菌近缘物种系统进化树分析,将前期鉴定为特基拉芽孢杆菌的7PJ-16菌株重新鉴定为枯草芽孢杆菌,更名为B.subtilis 7PJ-16。基因功能注释和次生代谢产物预测结果显示,7PJ-16菌株基因组中包含6个与抑菌物质合成相关的基因簇以及19个与促生物质合成相关的基因,这些基因与表面活性素、丰原素、铁载体、吲哚乙酸等生防相关代谢物的生物合成有关,同时该菌株基因组中亦发现21个与侵染定植过程（生物膜形成、运动性）相关的基因。为进一步挖掘生防相关基因及阐明B.subtilis 7PJ-16菌株与菌核病原菌（Sclerotinia sclerotiorum PZ-2、Scleromitrula shiraiana SXSG-5）之间的互作过程,本研究采用转录组测序技术,对共培养过程中的生防细菌与病原真菌分别进行原核和真核转录组分析。通过分析原核转录组数据发现,病原菌生长导致拮抗细菌的鞭毛组装和驱性相关基因下调表达,但其诱导了丰原素、铁载体、溶杆菌素等多种生防代谢物合成相关基因的上调表达;在真核转录组中,经拮抗细菌生物胁迫后,病原真菌的抗氧化酶相关基因多数表达上调,而其细胞壁组分合成（e.g.,几丁质）、植物胞壁降解酶代谢（e.g.,果胶酶、纤维素酶）、黑色素合成等与致病力相关的基因显着表达下调。基于7PJ-16菌株组学研究中挖掘到的大量生防相关基因,本研究从该菌株基因组中成功筛选和克隆到13个关键生防基因,其中包含5个表面活性素合成相关的基因（srfAA、srfAB、srfAC、srfAD、sfp）、7个溶杆菌素合成相关的基因（bacA、bacB、bacC、bacD、bacE、bacF、bacG）以及1个丰原素合成相关的基因（fenE）;利用同源重组技术,成功敲除与丰原素（fenE）和溶杆菌素（bacG）合成相关的两个生防基因,获得稳定转化子?FenE和?BacG,敲除株生物膜形成能力和抑菌活性均有不同程度的降低。4.内生芽孢杆菌7PJ-16生防相关代谢物的分析与鉴定结合生防相关基因的分析与功能验证,为进一步揭示B.subtilis 7PJ-16产生的生防相关代谢物,本研究首先检测了其活性发酵上清液中代谢产物的理化性质。结果显示,该活性发酵上清液对高温、酸碱具有较好的耐受性,对α-糜蛋白酶、胰蛋白酶不敏感,而对胃蛋白酶、蛋白酶K敏感。基于活性代谢物的理化性质,设计纯化策略,通过追踪抑菌活性,采用萃取、硅胶柱层析、薄层层析（TLC）、高效液相色谱（HPLC）等分离手段,从7PJ-16活性发酵上清液中分离纯化获得环二肽cycle（Pro-Phe）等6个单体III小分子物质;并利用酸沉淀与甲醇抽提相结合的方法,从7PJ-16发酵液中获得具有强烈抑菌活性的脂肽粗提物,经HPLC半制备分离后,质谱鉴定结果表明,该活性组分中包含表面活性素和丰原素两种脂肽抗生素,这与前文功能基因分析验证的结果一致。此外,7PJ-16菌株还可产生铁载体、植物外源激素吲哚乙酸和赤霉素等促生相关物质。综上所述,本研究从基因组、转录组、基因功能的分析验证及代谢物等层面,明确了拮抗作用与促生作用是桑树内生B.subtilis 7PJ-16对桑椹菌核病具有生防作用的主要机制。该菌株安全性能高,定植能力强,可通过产生表面活性素、丰原素、二肽小分子物质（环二肽和溶杆菌素）等多种抗生素来抑制桑椹菌核病原菌生长,进而在田间成功防控菌核病的发生与危害,且该菌株可通过产生植物激素、铁载体等促进桑种萌发和桑幼苗生长,从而来提升宿主系统抗性间接减少病害发生。论文研究取得的相关结果为桑椹菌核病生物防治奠定理论依据和实验基础,亦可为其他植物病害的生物防治提供重要参考。
孙丹[9]（2020）在《CRISPR/Cas9介导的小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素抗性的分子机制研究》文中指出苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是土壤中广泛存在的一种革兰氏阳性细菌,在代谢过程中能够产生可生物降解的杀虫晶体蛋白,具有对昆虫致病性。小菜蛾（Plutella xylostella）是一种全球性分布的农业害虫。其中,以钙粘蛋白（CAD）、碱性磷酸酶（ALP）、氨肽酶N（APN）、以及ABC转运蛋白（ABCC2,ABCC3）为代表的中肠受体基因表达量的改变或突变与昆虫对Bt Cry毒素的高水平抗性相关。CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术被应用到很多有机体中进行遗传修饰或改造。近几年来,该技术也被应用到节肢动物中,本文首先对CRISPR/Cas9在昆虫以及非昆虫节肢动物中的应用进行了系统性的总结,并且阐述了CRISPR/Cas技术的应用前景。随后,运用CRISPR/Cas9技术分别敲除小菜蛾敏感种群中肠PxABCC2、PxABCC3、PxAPN1和PxAPN3a基因,建立的4个纯合突变种群ABCC2KO、ABCC3KO、APN1KO和APN3aKO均对Bt Cry1Ac原毒素产生高水平的抗性。我们的研究结果为PxABCC2、PxABCC3、PxAPN1和PxAPN3a蛋白作为小菜蛾中肠受体提供了确凿的体内功能验证,为其他受体基因的发掘提供了良好的平台,同时也为新的害虫防治策略的开发提供思路。主要研究内容如下:（1）CRISPR/Cas系统在节肢动物中的发展现状及应用前景规律成簇的间隔短回文序列（CRISPR）及CRISPR相关联的基因Cas9共同组成了一个有价值的基因编辑系统,可以对不同的生物有机体进行精确的遗传改造。在本文中,我们对CRISPR/Cas9技术在昆虫及其他非昆虫的节肢动物中的应用进行了系统性的归纳与总结,对于该技术在节肢动物中的发展现状提供了一个综合且公正的视角。（2）小菜蛾CRISPR/Cas9基因编辑体系的构建利用Cas-Designer软件分别设计小菜蛾中肠PxABCC2及PxABCC3基因的sgRNA靶标序列,并搜索小菜蛾基因组数据库、Gen Bank数据库以及利用Cas-OFFinder软件进行脱靶效应检测。随后,对小菜蛾敏感种群（DBM1Ac-S）的卵进行显微注射,经过一系列种系转化和突变筛选策略,成功构建了小菜蛾PxABCC2及PxABCC3基因的纯合突变种群,分别命名为ABCC2KO和ABCC3KO。（3）ABCC2KO和ABCC3KO种群的毒力生物测定与染色体遗传互补分析采用叶片浸渍法,对基因敲除种群ABCC2KO和ABCC3KO的幼虫进行生物学测定分析,数据结果表明,与敏感种群（DBM1Ac-S）相比,ABCC2KO和ABCC3KO种群对Bt Cry1Ac原毒素分别产生了724和413倍的抗性。随后,通过基因编辑种群（ABCC2KO和ABCC3KO）分别与小菜蛾敏感（DBM1Ac-S）和近等基因系抗性（NIL-R）种群进行两两种群染色体遗传互补杂交,并利用诊断剂量的Cry1Ac毒素处理这四个种群及其F1代幼虫,明确基因敲除种群对Cry1Ac毒素的抗性遗传模式。（4）ABCC2KO和ABCC3KO种群中肠BBMV蛋白与Bt Cry1Ac毒素的结合分析分别提取小菜蛾敏感种群（DBM1Ac-S）、两个基因敲除种群（ABCC2KO和ABCC3KO）和近等基因系抗性种群（NIL-R）的中肠BBMV蛋白,运用Western Blot技术分析活化的Cry1Ac毒素与各种群BBMV蛋白的结合情况,实验结果表明,敏感种群的BBMV蛋白可以与Cry1Ac毒素结合,抗性种群的BBMV基本不与Cry1Ac毒素结合,而基因敲除种群ABCC2KO和ABCC3KO的BBMV蛋白与Cry1Ac毒素的结合能力显着下降。这表明敲除小菜蛾PxABCC2及PxABCC3基因会导致Cry1Ac毒素的结合降低,从而使得小菜蛾对Cry1Ac毒素产生高水平抗性。（5）小菜蛾不同中肠APN基因的体外异源表达通过比较小菜蛾Bt敏抗种群四龄幼虫的中肠转录组数据,发现所有Bt抗性种群的PxAPN1和PxAPN3a基因表达量均显着降低,而PxAPN5和PxAPN6基因的表达量则显着升高。为了确定这4个APN基因在Bt毒素作用机制中的作用,分别将PxAPN1、PxAPN3a、PxAPN5和PxAPN6基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在草地贪夜蛾细胞（Sf9）中进行融合表达,并通过Western Blot技术验证其表达情况。免疫荧光定位检测结果表明,这4个PxAPN蛋白均定位于细胞表面,但是只有PxAPN1和PxAPN3a蛋白可以结合Cry1Ac毒素,可以明确PxAPN1和PxAPN3a是Bt Cry1Ac毒素的功能受体。（6）CRISPR/Cas9介导的小菜蛾PxAPN1和PxAPN3a基因的敲除分别设计小菜蛾PxAPN1和PxAPN3a基因的特异性sgRNA序列,并与Cas9蛋白混合,利用实验室成熟的小菜蛾CRISPR/Cas9显微操控平台,对小菜蛾敏感种群（DBM1Ac-S）的卵进行显微注射。采用优化的种系转化和突变筛选策略,成功构建了PxAPN1和PxAPN3a基因的纯合突变种群,分别命名为APN1KO和APN3aKO。随后的生物学测定结果显示,APN1KO和APN3aKO种群的幼虫对Cry1Ac原毒素的抗性水平分别为463和346倍,证明了PxAPN1和PxAPN3a蛋白作为Cry1Ac毒素的功能性受体,参与了小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素的高水平抗性。
章磊[10]（2019）在《β-catenin基因在文昌鱼胚胎发育中的功能研究及两个脊椎动物神经嵴相关基因启动子在文昌鱼中的活性分析》文中研究表明文昌鱼作为无脊椎动物到脊椎动物进化的过渡类群,是研究脊椎动物发育相关基因功能演化的理想模型。核质穿梭蛋白β-catenin是经典Wnt信号通路的关键元件,Wnt/β-catenin在胚胎体轴建立以及器官发生中的调控作用在多种物种中都已有较为详细的报道,然而目前在文昌鱼中关于Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育中的调控作用研究还未深入,仅限于少数Wnt成员以及β-catenin、Dvl、Tcf、Gsk等基因的表达谱分析以及一些简单的功能实验,阐明β-catenin基因在胚胎不同发育阶段的功能还需要更多的基因敲除实验证据。本实验首先通过原位杂交方法检测了β-catenin基因在文昌鱼早期胚胎发育中的表达,并首次利用Talen技术建立了文昌鱼β-catenin基因敲除品系。原位杂交结果结合转录组数据显示,β-catenin为母源性表达基因,其mRNA在胚胎发育早期呈现全身性均匀分布。β-catenin突变体后端躯干结构明显缺失,体长明显缩短,后部体节无法形成,同时前端膨大,无法形成完整口鳃结构;跟踪观察发现β-catenin突变体在受精后5天左右死亡。为了探究β-catenin基因缺失对文昌鱼胚胎具体组织器官形成的影响,本文进一步检测了一些组织特异标记基因在β-catenin突变体胚胎中的表达变化情况。结果显示,在β-catenin突变体中,原肠时期背部标记基因Nodal和腹部标记基因Evx的表达均无明显变化;而从神经胚时期开始,前端外胚层标记基因FoxQ2,前端基因Fzl5/8以及Wnt拮抗因子Six3/6的表达区域均表现向后端扩张趋势;Pax4/6基因在前脑处表达区域扩大,而后其在口前窝处表达消失;在胚体后端,从神经胚中期开始,尾芽位置表达基因Wnt3、Wnt8、Brachyury、Cax、Evx的表达水平都明显降低,腹部标记基因FoxAa的表达区域也相对向后端推移。而到神经胚晚期,咽区标记基因Pax1/9、Eya、Six1/2表达区域都明显扩张,并且Pax1/9占据鳃裂原基位置,Dkk1/2/4在口原基位置的表达则消失,而后在幼体时期Pou4在口原基处的表达消失。这些结果说明,在文昌鱼胚体尾端,Wnt/β-catenin信号中心诱导并维持Brachyury、Cdx等基因的表达,保证尾芽结构正常形成,从而进一步调控胚胎后端延伸、体节发生过程。而在胚体前端,Wnt/β-catenin信号通过抑制前端发育相关基因如Six3/6等进而参与头部区域的划分以及咽区口鳃精细结构的形态建成。为研究母源性Wnt/β-catenin信号在胚胎早期背腹轴建立以及胚层特化中的作用,本实验进一步注射了Wnt抑制因子Dkk1/2/4 mRNA以及稳定形式的β-catenin mRNA。在DkM1/2/4注射胚胎中,原肠中晚时期内外胚层不再紧密贴合,内胚层膨大增厚,而原肠顶板正常形成,背腹结构保留,到神经胚时期胚胎前后轴向延伸发育受阻。然而在稳定形式β-catenin注射实验中,胚胎并未出现畸形表型。此结果说明在文昌鱼胚胎早期发育过程,Wnt/β-cateniin信号影响内外胚层的分界,但不参与背腹轴的建立过程。Tol2转座子系统可以稳定介导10 kb以上目的片段转座到宿主基因组中,且近来已成功在文昌鱼中应用此系统建立了两个转基因品系。相比于脊椎动物,文昌鱼缺失重要的神经嵴结构,为探究脊椎动物神经嵴诱导因子及其表达环境要素在文昌鱼中的存在情况,本研究尝试应用新建立的Tol2转座系统转入一些脊椎动物神经嵴特异表达的启动子,最终分别建立了爪蟾Snail基因启动子驱动mCherry报告基因以及人Sox9基因增强元件组合小鼠Sox9基因启动子共同驱动mCherry报告基因的两个转基因文昌鱼品系,检测这两个转基因子代胚胎中mChery的表达情况发现其特异性地表达在胚胎最前端部分神经板区域。由此,本文验证了爪蟾Snail基因以及小鼠Sox9基因启动子可以特异驱动基因在文昌鱼胚胎前端神经板边界位置表达,此结果为后续神经嵴结构诱导基因网络的演化研究提供了有力参考。
二、Creation of a Gene Knockout Population of Cotton（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Creation of a Gene Knockout Population of Cotton（论文提纲范文）
（1）扑草净降解菌Pseudomonas sp. DY-1的降解机制及其在污染土壤修复中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 三嗪类除草剂概述 |
| 1.2 扑草净概述 |
| 1.2.1 扑草净的理化性质 |
| 1.2.2 扑草净的应用现状 |
| 1.2.3 扑草净的危害 |
| 1.2.4 扑草净的残留限量 |
| 1.3 扑草净降解的研究进展 |
| 1.3.1 扑草净降解的物理化学方法 |
| 1.3.2 扑草净的微生物降解 |
| 1.4 微生物基因组学 |
| 1.4.1 基因组学研究技术发展概况 |
| 1.4.2 微生物基因组学发展现状 |
| 1.4.3 微生物基因组学研究内容 |
| 1.5 生物修复研究概况 |
| 1.5.1 生物修复的定义和分类 |
| 1.5.2 生物修复的作用机制 |
| 1.5.3 生物强化技术 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 培养基与抗生素 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 溶液与缓冲液 |
| 2.1.5 实验仪器与设备 |
| 2.1.6 PCR引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 扑草净降解菌DY-1降解特性的研究 |
| 2.2.2 扑草净降解菌DY-1的降解途径分析 |
| 2.2.3 扑草净降解菌DY-1的基因组学分析 |
| 2.2.4 扑草净降解菌DY-1的功能基因的克隆与表达 |
| 2.2.5 扑草净降解菌DY-1功能基因的敲除 |
| 2.2.6 扑草净降解菌DY-1应用潜力分析 |
| 2.2.7 微生物群落结构及生物强化机制研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 扑草净降解菌DY-1降解特性研究 |
| 3.1.1 温度对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.1.2 pH值对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.1.3 接种量对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.1.4 摇床转速对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.1.5 NaCl浓度对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.1.6 金属离子对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.1.7 菌株DY-1降解条件的优化 |
| 3.1.8 菌株DY-1的生长曲线与降解曲线测定 |
| 3.1.9 底物初始浓度对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.1.10 菌株DY-1的粗酶定位 |
| 3.1.11 菌株DY-1对其他三嗪类除草剂的降解 |
| 3.2 菌株DY-1降解扑草净的中间代谢产物鉴定及代谢途径分析 |
| 3.3 扑草净降解菌DY-1全基因组测序及注释 |
| 3.3.1 扑草净降解菌DY-1基因组数据质量统计 |
| 3.3.2 扑草净降解菌DY-1基因组测序数据分析 |
| 3.3.3 扑草净降解菌DY-1基因组特征分析 |
| 3.3.4 扑草净降解菌DY-1的功能基因注释 |
| 3.3.5 扑草净降解菌DY-1环境适应性的遗传基础分析 |
| 3.4 降解相关功能基因筛选与鉴定 |
| 3.4.1 功能基因选择与序列分析 |
| 3.4.2 扑草净降解基因的系统发育分析 |
| 3.4.3 扑草净降解基因的扩增与表达载体构建 |
| 3.4.4 扑草净降解基因的表达纯化 |
| 3.4.5 蛋白降解能力及降解特性分析 |
| 3.4.6 扑草净降解基因的敲除验证 |
| 3.4.7 目的蛋白的二级结构预测 |
| 3.4.8 目的蛋白的三级结构预测与活性位点分析 |
| 3.5 扑草净降解菌DY-1应用特性研究 |
| 3.5.1 土壤中菌株DY-1的扑草净降解实验 |
| 3.5.2 土壤中菌株DY-1的不同含菌量对其降解效率的影响 |
| 3.5.3 土壤中扑草净初始浓度对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.5.4 土壤中不同温度对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.5.5 土壤中不同含水量对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.5.6 土壤中不同的外源营养物质对菌株DY-1降解效率的影响 |
| 3.5.7 菌株DY-1灌根对扑草净药害的解除作用 |
| 3.5.8 菌株DY-1对扑草净污染土壤呼吸的影响 |
| 3.5.9 菌株DY-1对扑草净污染土壤酶活性的影响 |
| 3.5.10 生物强化系统中微生物群落结构解析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 菌株DY-1对扑草净的降解特性 |
| 4.2 菌株DY-1降解扑草净的途径 |
| 4.3 菌株DY-1全基因组测序 |
| 4.4 目的基因的表达与纯化 |
| 4.5 生物强化 |
| 4.6 微生物群落结构 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术学位论文 |
（4）寄主诱导的基因沉默在增强植物真菌病害抗性方面的研究进展（论文提纲范文）
| 1 HIGS技术的原理 |
| 2 HIGS技术在植物抗真菌病害领域的研究进展 |
| 3 HIGS技术的优缺点及展望 |
（5）CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章:文献综述 |
| 1.1 中国棉花生产概况 |
| 1.2 棉花基因组研究进展 |
| 1.3 棉花功能基因组学研究 |
| 1.4 植物应对草食性昆虫的内源防御系统 |
| 1.5 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.5.1 形态抗虫育种阶段 |
| 1.5.2 生化抗虫育种阶段 |
| 1.5.3 棉花抗虫基因工程育种阶段 |
| 1.5.3.1 Bt毒蛋白的发现以及作用机理 |
| 1.5.3.2 Bt转基因棉花研究进展 |
| 1.6 植物突变体创建方法 |
| 1.6.1 自发变异 |
| 1.6.2 物理诱变 |
| 1.6.3 化学诱变 |
| 1.6.4 分子生物学方法 |
| 1.7 基因编辑技术研究进展 |
| 1.7.1 ZFN基因编辑系统 |
| 1.7.2 TALEN基因编辑系统 |
| 1.7.3 CRISPR基因组编辑系统 |
| 1.7.3.1 CRISPR/Cas9 技术原理 |
| 1.7.3.2 CRISPR/Cas9 脱靶效应研究 |
| 1.8 CRISPR/Cas9 系统在作物育种中的应用 |
| 1.8.1 高产育种研究 |
| 1.8.2 品质育种研究 |
| 1.8.3 抗性育种研究 |
| 1.8.4 不育系研究 |
| 1.9 基因编辑检测方法 |
| 1.10 CRISPR/Cas9 技术的局限性 |
| 1.11 植物变体库研究进展 |
| 1.11.1 理化诱变突变体库 |
| 1.11.2 插入突变体库 |
| 1.11.3 基因编辑突变体库 |
| 1.12 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.12.1 本研究的目的与意义 |
| 1.12.2 本研究的技术路线 |
| 第二章:实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 基因编辑载体 |
| 2.1.3 供试的昆虫材料 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sgRNA及引物设计 |
| 2.2.2 GO靶基因功能富集分析 |
| 2.2.3 混合基因组编辑载体文库构建 |
| 2.2.3.1 载体充分酶切控制空载率 |
| 2.2.3.2 混合载体文库构建 |
| 2.2.4 棉花DNA提取 |
| 2.2.5 棉花遗传转化 |
| 2.2.6 Barcode设计和高通量测序检测分析基因编辑目标序列 |
| 2.2.7 基因组编辑检测 |
| 2.2.8 抗虫鉴定 |
| 2.2.8.1 蚜虫及棉铃虫繁殖培养 |
| 2.2.8.2 武汉温室蚜虫抗性表型筛选 |
| 2.2.8.3 海南温室咀嚼式害虫极端表型筛选 |
| 2.2.8.4 室内棉铃虫抗虫验证 |
| 第三章:结果与分析 |
| 3.1 目的基因sgRNA设计及GO富集分析 |
| 3.2 sgRNAs混合载体文库的构建与评估 |
| 3.3 棉花基因编辑突变体材料的获取 |
| 3.4 基于条形码的高通量测序技术检测T0 植株sgRNA信息 |
| 3.5 利用高通量测序方法检测基因组编辑效率 |
| 3.6 高效的棉花T0 代突变体基因组编辑效率 |
| 3.7 棉花T0 单株的编辑概况 |
| 3.8 棉花基因组编辑在后代中的遗传率 |
| 3.9 棉花基因编辑后代材料抗虫表型鉴定 |
| 3.9.1 温室蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.2 T2 代材料蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.3 海南温室咀嚼时害虫危害表型鉴定 |
| 3.10 GhMLP423 基因虫害表型验证 |
| 3.10.1 超表达和基因编辑材料筛选 |
| 3.10.2 棉铃虫饲喂实验 |
| 3.10.3 棉铃虫取食偏好性验证 |
| 3.10.4 JA-Ile相关检测 |
| 3.11 脱靶分析 |
| 第四章:讨论 |
| 4.1 利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统创建陆地棉突变体库的必要性 |
| 4.2 CRISPR/Cas9 系统在棉花基因组中高效的编辑及遗传规律 |
| 4.3 CRISPR/Cas9 在陆地棉基因组编辑系统的高特异性 |
| 4.4 棉花基因编辑工具的优化与展望 |
| 4.5 植物在非生物和生物胁迫的响应中可能涉及复杂而重叠的信号网络 |
| 4.6 CRISPR/Cas9 基因组编辑植物相比于转基因植物在育种上的优越性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 混合载体文库构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 棉花RNA提取(天根试剂盒法) |
| 附录5 RNA反转录 |
| 附录6 Real-time |
| 附录7 棉铃虫饲喂 |
| 附表 |
| 附表1 502 个目的基因ID |
| 附表2 968个sgRNA靶标序列 |
| 附表3 barcoded引物序列 |
| 附表4 潜在脱靶位点检测引物序列 |
| 已发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（6）烟粉虱水平转移基因合成生物素和泛酸的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 昆虫共生菌研究进展 |
| 1.1 昆虫共生菌概述 |
| 1.2 烟粉虱的共生菌 |
| 2 水平转移基因的研究进展 |
| 2.1 原核生物的水平转移基因 |
| 2.2 真核生物的水平转移基因 |
| 2.3 昆虫的水平转移基因 |
| 2.4 水平转移基因对昆虫-共生菌共生关系的维持具有重要的作用 |
| 3 昆虫B族维生素的研究进展 |
| 3.1 昆虫必需B族维生素 |
| 3.2 B 族维生素的检测方法 |
| 3.3 昆虫B族维生素的研究方法 |
| 4 本研究目的、意义和内容 |
| 第二章 基本材料与方法 |
| 1 基本材料 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 供试植物 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 1.4 生态学试验使用的主要仪器和设备 |
| 2 基本试验方法 |
| 2.1 烟粉虱总DNA提取 |
| 2.2 烟粉虱总RNA提取 |
| 2.3 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.4 PCR产物纯化 |
| 2.5 质粒提取 |
| 2.6 Western杂交 |
| 2.7 免疫荧光标记 |
| 2.8 荧光原位杂交 |
| 第三章 微生物法测定小型昆虫体内维生素 B_7 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同测定波长对生物素测定标准曲线的影响 |
| 2.2 不同继代菌株对生物素测定标准曲线的影响 |
| 2.3 不同培养时间对生物素测定标准曲线的影响 |
| 2.4 不同培养方式对生物素测定标准曲线的影响 |
| 2.5 微生物法测定小型昆虫生物素含量 |
| 2.6 加标回收试验 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 共生菌对粉虱B族维生素合成的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 粉虱共生菌携带合成 B 族维生素基因情况 |
| 1.3 缺失共生菌粉虱种群的建立 |
| 1.4 共生菌滴度检测 |
| 1.5 测定烟粉虱和温室白粉虱B族维生素的含量 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 粉虱共生菌合成B族维生素的基因信息 |
| 2.2 抗生素处理对烟粉虱和温室白粉虱共生菌滴度的影响 |
| 2.3 缺失共生菌对粉虱B族维生素含量的影响 |
| 3 小结与讨论 |
| 第五章 粉虱细菌源水平转移基因bioA、bioD、bioB和 panBC的进化起源分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫和植物 |
| 1.2 试验所需试剂和仪器 |
| 1.3 构建烟粉虱生物素和泛酸的代谢通路 |
| 1.4 构建烟粉虱水平转移基因的克隆载体 |
| 1.5 烟粉虱基因bioA、bioD、bioB和 panBC的进化起源分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 烟粉虱合成生物素和泛酸的通路 |
| 2.2 构建烟粉虱水平转移基因 bioA、bioD、bioB 和 panBC 的克隆载体 |
| 2.3 粉虱和共生菌基因组携带 bioA、bioD、bioB、panB 和 panC 基因情况 |
| 2.4 粉虱、共生菌和 E.coli 基因 bioA、bioD、bioB 和 panBC 编码的氨基酸序列比对 |
| 2.5 粉虱基因 bioA、bioD、bioB 和 panBC 的系统发育分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第六章 功能补偿营养缺陷大肠杆菌验证烟粉虱水平转移基因bioA、bioD、bioB和 panBC的功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 试验试剂及仪器 |
| 1.3 大肠杆菌定点突变 |
| 1.4 烟粉虱水平转移基因回补E.coli K12 BW25113 突变体菌株 |
| 1.5 菌株生长量的检测 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组菌株和打靶卡那抗性片段的获得 |
| 2.2 大肠杆菌基因敲除和烟粉虱水平转移基因回补 |
| 2.3 检测大肠杆菌基因敲除和回补烟粉虱水平转移基因菌株的生长量 |
| 3 小结与讨论 |
| 第七章 烟粉虱水平转移基因 bioA、bioD 和 bioB 合成生物素功能研究 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 供试昆虫和植物 |
| 1.2 试验所需试剂及仪器 |
| 1.3 缺失Hamiltonella对烟粉虱bioA、bioD和 bioB基因表达的影响 |
| 1.4 烟粉虱水平转移基因 bioA、bioD 和 bioB 表达载体构建 |
| 1.5 重组蛋白的表达与纯化 |
| 1.6 免疫荧光聚焦显微观察烟粉虱的含菌细胞和中肠 |
| 1.7 荧光原位杂交检测烟粉虱共生菌的分布 |
| 1.8 RNA干扰 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 缺失 Hamiltonella 对烟粉虱基因 bioA、bioD 和 bioB 表达的影响 |
| 2.2 构建表达载体 |
| 2.3 重组蛋白的表达、纯化及兔多抗Western-Blot的检验 |
| 2.4 免疫荧光共聚焦显微观察蛋白 BioA、BioD 和 BioB 在含菌细胞和中肠中的分布 |
| 2.5 烟粉虱基因 bioA、bioD 和 bioB 的沉默 |
| 2.6 基因 bioA、bioD 和 bioBB 沉默对烟粉虱生物素含量的影响 |
| 2.7 基因bioA、bioD和 bioB沉默对烟粉虱适合度的影响 |
| 2.8 基因bioA沉默后回补生物素对烟粉虱适合度的影响 |
| 2.9 烟粉虱基因bioA、bioD和 bioB沉默对Hamiltonella滴度的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 第八章 水平转移基因 panBC 和 Portiera 协同合成泛酸调控烟粉虱和共生菌的适合度 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 供试昆虫和植物 |
| 1.2 试验所需试剂和仪器 |
| 1.3 构建表达载体 |
| 1.4 重组蛋白表达与纯化 |
| 1.5 共生菌 Portiera 与蛋白 PanBC 在烟粉虱含菌细胞内的分布 |
| 1.6 缺失共生菌Portiera对烟粉虱适合度及蛋白PanBC表达的影响 |
| 1.7 RNA干扰 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 构建表达载体 |
| 2.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 兔多抗Western-Blot的检验 |
| 2.4 缺失共生菌Portiera对烟粉虱适合度及蛋白PanBC表达的影响 |
| 2.5 基因 panBC 沉默对烟粉虱适合度、泛酸含量和共生菌滴度的影响 |
| 3 小结与讨论 |
| 第九章 结论与讨论 |
| 1 结论 |
| 2 讨论 |
| 3 本研究的创新点 |
| 4 今后研究方向 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
（7）嗜线虫致病杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白的特性和功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 共生菌的分类和发展 |
| 1.2 共生菌的生物学特性 |
| 1.2.1 共生菌的生理和生化特征 |
| 1.2.2 共生菌的表型变异 |
| 1.2.3 共生菌和线虫的共生关系 |
| 1.2.4 共生菌的致病性 |
| 1.3 共生菌代谢物的研究 |
| 1.3.1 杀虫毒素 |
| 1.3.2 几丁质酶 |
| 1.3.3 几丁质结合蛋白 |
| 1.4 基因敲除技术 |
| 1.4.1 同源重组法 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas系统敲除法 |
| 1.5 立题目的意义 |
| 第二章 嗜线虫致病杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白的生物信息学分析 |
| 2.1 生物信息学分析软件和网址 |
| 2.2 几丁质酶和几丁质结合蛋白基因生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 几丁质酶和几丁质结合蛋白的基因序列分析 |
| 2.3.2 几丁质酶和几丁质结合蛋白基因所编码蛋白质的性质和特征 |
| 2.3.3 几丁质酶和几丁质结蛋白的二级结构 |
| 2.3.4 几丁质酶和几丁质结蛋白的三级结构 |
| 2.3.5 几丁质酶和几丁质结蛋白的系统进化分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 嗜线虫致病杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白基因的克隆及表达 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试菌株和载体 |
| 3.1.2 供试药品和试剂盒 |
| 3.1.3 供试培养基 |
| 3.1.4 试验仪器 |
| 3.1.5 供试试剂的配制方法 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 嗜线虫致病杆菌HB310基因组DNA提取 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 PCR扩增及产物回收 |
| 3.2.4 扩增产物平末端加A |
| 3.2.5 目的基因与pMD18-T载体连接转化 |
| 3.2.6 阳性克隆的检测和测序 |
| 3.2.7 质粒的酶切 |
| 3.2.8 原核表达载体的构建 |
| 3.2.9 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.10 包涵体的变性和复性 |
| 3.2.11 重组蛋白的纯化及含量测定 |
| 3.2.12 几丁质结合蛋白底物结合能力的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 目的基因的扩增 |
| 3.3.2 载体的酶切验证 |
| 3.3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.3.4 重组蛋白的可溶性分析 |
| 3.3.5 重组蛋白的变复性和纯化 |
| 3.3.6 几丁质结合蛋白的底物结合活性 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 嗜线虫致病杆菌几丁质酶的酶学性质研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 供试几丁质酶 |
| 4.1.2 供试药品 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.1.4 试验所需溶液的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 标准曲线的制作 |
| 4.2.2 重组几丁质酶酶活力测定 |
| 4.2.3 pH对重组几丁质酶活力及稳定性影响的测定 |
| 4.2.4 温度对重组几丁质酶活力及热稳定性影响的测定 |
| 4.2.5 金属离子和化学试剂对重组几丁质酶活力影响的测定 |
| 4.2.6 重组几丁质酶底物特异性和动力学常数的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 标准曲线的制作 |
| 4.3.2 pH对各几丁质酶活力和稳定性的影响 |
| 4.3.3 温度对重组几丁质酶活力的影响 |
| 4.3.4 金属离子和化学试剂对重组几丁质酶活力的影响 |
| 4.3.5 重组几丁质酶底物特异性和动力学常数 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 几丁质酶和几丁质结合蛋白杀虫和抑菌活性的研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 菌株、蛋白和试虫 |
| 5.1.2 供试培养基 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 几丁质酶和几丁质结合蛋白的杀虫活性及对毒素的增效作用测定 |
| 5.2.2 几丁质酶和几丁质结合蛋白抑菌活性测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 几丁质酶和几丁质结合蛋白的杀虫活性及其对毒素的增效作用 |
| 5.3.2 几丁质酶和几丁质结合蛋白的抑菌活性 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 嗜线虫致病杆菌Xn-Chi60和Xn-Chi70几丁质酶与Xn-Tc毒素的关系 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 菌株和载体 |
| 6.1.2 供试药品和试剂盒 |
| 6.1.3 供试培养基 |
| 6.1.4 供试仪器 |
| 6.1.5 供试试剂的配制方法 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 嗜线虫致病杆菌HB310菌株抗生素耐受水平检测 |
| 6.2.2 嗜线虫致病杆菌HB310基因组DNA提取 |
| 6.2.3 引物设计 |
| 6.2.4 PCR扩增 |
| 6.2.5 融合PCR法扩增全长片段 |
| 6.2.6 目的片段与载体的双酶切 |
| 6.2.7 同源重组载体的构建 |
| 6.2.8 菌液PCR验证 |
| 6.2.9 单基因敲除株的筛选 |
| 6.2.10 双基因敲除株的筛选 |
| 6.2.11 野生型菌株和敲除株Xn-Tc毒素对棉铃虫杀虫活性的测定 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 嗜线虫致病杆菌HB310菌株抗生素耐受性水平 |
| 6.3.2 Xn-chi60和Xn-chi70基因上下游同源臂序列及抗性标记的独立扩增 |
| 6.3.3 融合片段的全长扩增 |
| 6.3.4 同源重组载体的构建及鉴定 |
| 6.3.5 构建并获得单基因敲除株 |
| 6.3.6 构建并获得双基因敲除株 |
| 6.3.7 野生型菌株和敲除株Xn-Tc毒素对棉铃虫的杀虫活性 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 讨论 |
| 7.1 几丁质酶和几丁质结合蛋白的结构 |
| 7.2 几丁质酶和几丁质结合蛋白的性质 |
| 7.3 几丁质酶和几丁质结合蛋白的杀虫活性 |
| 7.4 几丁质酶和几丁质结合蛋白的抑菌活性 |
| 7.5 几丁质酶和Tc毒素关系 |
| 第八章 结论 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表的学位论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）桑树内生枯草芽孢杆菌7PJ-16对桑椹菌核病生防作用及机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 桑椹菌核病的研究概况 |
| 1.1.1 发生及危害 |
| 1.1.2 病原菌的种类及侵染循环 |
| 1.1.3 防治措施 |
| 1.2 植物内生菌起源及其生物学作用 |
| 1.2.1 植物内生菌的概念 |
| 1.2.2 植物内生菌的多样性与生物学功能 |
| 1.3 芽孢杆菌的分布及对植物病害的生物防治作用 |
| 1.3.1 芽孢杆菌的基本概况 |
| 1.3.2 芽孢杆菌防治植物病害的主要机制 |
| 1.4 微生物组学研究概况 |
| 1.4.1 微生物基因组学研究 |
| 1.4.2 微生物转录组学研究 |
| 1.4.3 芽孢杆菌组学研究 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的与意义 |
| 2.3 主要研究内容 |
| 2.3.1 内生芽孢杆菌7PJ-16生防潜力的评估 |
| 2.3.2 内生芽孢杆菌7PJ-16防病促生效果的研究 |
| 2.3.3 内生芽孢杆菌7PJ-16防病促生作用的分子机制研究 |
| 2.3.4 内生芽孢杆菌7PJ-16生防相关代谢物的分析与鉴定 |
| 2.4 技术路线 |
| 第3章 内生芽孢杆菌7PJ-16生防潜力的评估 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 质粒、供试桑种与土壤 |
| 3.1.4 桑树样本的采集 |
| 3.1.5 主要培养基 |
| 3.1.6 主要试剂及其配制 |
| 3.1.7 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 内生Bacillus sp.7PJ-16 对小鼠生长的影响 |
| 3.2.2 内生Bacillus sp.7PJ-16 对家蚕生长的影响 |
| 3.2.3 内生Bacillus sp.7PJ-16 在桑树中的侵染定植特征 |
| 3.2.4 健康桑树内生细菌的种群分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 内生Bacillus sp.7PJ-16 对小鼠生长的影响 |
| 3.3.2 内生Bacillus sp.7PJ-16 对家蚕生长发育的影响 |
| 3.3.3 内生Bacillus sp.7PJ-16 在桑树中定植能力的分析 |
| 3.3.4 内生芽孢杆菌在健康桑树中的种群分布 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 内生芽孢杆菌7PJ-16防病促生效果的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试菌株、桑种和土壤 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 内生Bacillus sp.7PJ-16 发酵条件的优化 |
| 4.2.2 内生Bacillus sp.7PJ-16 对菌核病原菌生长和土壤微生态的影响 |
| 4.2.3 内生Bacillus sp.7PJ-16 对田间防病效果的检测 |
| 4.2.4 内生Bacillus sp.7PJ-16 对温室促生效果的检测 |
| 4.2.5 数据处理与统计 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 内生Bacillus sp.7PJ-16 产抑菌活性物质发酵条件的优化 |
| 4.3.2 内生Bacillus sp.7PJ-16 对菌核病原菌生长与土壤微生态的影响 |
| 4.3.3 内生Bacillus sp.7PJ-16 田间防病效果的检测 |
| 4.3.4 内生Bacillus sp.7PJ-16 温室促生效果的检测 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第5章 内生芽孢杆菌7PJ-16防病促生作用的分子机制研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试菌株与质粒 |
| 5.1.2 培养基和主要试剂 |
| 5.1.3 主要设备仪器 |
| 5.2 主要方法 |
| 5.2.1 内生Bacillus sp.7PJ-16 全基因组的解析 |
| 5.2.2 内生Bacillus sp.7PJ-16 与菌核病病原菌的互作转录组研究 |
| 5.2.3 内生Bacillus sp.7PJ-16 生防相关基因的克隆与功能验证 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 内生Bacillus sp.7PJ-16 的全基因组解析 |
| 5.3.2 内生B.subtilis7PJ-16 与菌核病病原菌的互作转录组研究 |
| 5.3.3 内生B.subtilis7PJ-16 生防相关基因的克隆与功能验证 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第6章 内生芽孢杆菌7PJ-16生防相关代谢物的分析与鉴定 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 供试菌株 |
| 6.1.2 主要培养基与试剂 |
| 6.1.3 主要仪器设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 内生B.subtilis7PJ-16 发酵上清液制备与理化性质检测 |
| 6.2.2 抑菌活性的检测方法 |
| 6.2.3 内生B.subtilis7PJ-16 发酵液中小分子抑菌活性物质的分离鉴定 |
| 6.2.4 内生B.subtilis7PJ-16 发酵液中脂肽抗生素的分析与鉴定 |
| 6.2.5 内生B.subtilis7PJ-16 促生相关物质的检测 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 内生B.subtilis7PJ-16 发酵上清液理化性质的检测 |
| 6.3.2 内生B.subtilis7PJ-16 发酵液中抑菌活性物质的分离鉴定 |
| 6.3.3 内生B.subtilis7PJ-16 促生相关物质的检测 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第7章 全文总结与展望 |
| 论文创新性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的论文及参研课题 |
| 致谢 |
（9）CRISPR/Cas9介导的小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素抗性的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 小菜蛾研究概况 |
| 1.1.1 小菜蛾的形态特征和进化优势 |
| 1.1.2 小菜蛾的分布和为害状况 |
| 1.1.3 小菜蛾抗药性研究进展 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌Bt及其杀虫蛋白研究概况 |
| 1.2.1 Bt研究概况 |
| 1.2.2 Bt杀虫晶体蛋白的分类和结构特征 |
| 1.2.3 Bt杀虫晶体蛋白的作用机制 |
| 1.3 昆虫对Bt抗性的研究概况 |
| 1.3.1 昆虫对Bt抗性现状 |
| 1.3.2 鳞翅目昆虫对Bt的抗性机制 |
| 1.3.3 小菜蛾对Bt抗性的研究概况 |
| 1.4 CRISPR/Cas9技术的研究进展 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9系统的由来 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas技术发展历程 |
| 1.4.3 基因编辑技术的应用 |
| 1.5 主要内容和意义 |
| 1.5.1 主要内容 |
| 1.5.2 本研究的意义 |
| 第2章 CRISPR/Cas系统在节肢动物中的发展现状及应用前景 |
| 2.1 基因编辑技术概述 |
| 2.1.1 基因编辑技术的发展历史 |
| 2.1.2 CRISPR/Cas9序列的组成和原理 |
| 2.1.3 CRISPR/Cas9基因编辑后的修复方式 |
| 2.1.4 不同基因编辑系统的比较 |
| 2.1.5 CRISPR/Cas9基因编辑系统的应用 |
| 2.2 CRISPR/Cas9系统在昆虫中的应用 |
| 2.2.1 CRISPR/Cas9系统在双翅目昆虫中的应用 |
| 2.2.2 CRISPR/Cas9系统在鳞翅目昆虫中的应用 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9系统在直翅目昆虫中的应用 |
| 2.2.4 CRISPR/Cas9系统在鞘翅目昆虫中的应用 |
| 2.2.5 CRISPR/Cas9系统在膜翅目昆虫中的应用 |
| 2.3 CRISPR/Cas9系统在非昆虫节肢动物中的应用 |
| 2.3.1 CRISPR/Cas9系统在蜱螨目昆虫中的应用 |
| 2.3.2 CRISPR/Cas9系统在十足目昆虫中的应用 |
| 2.3.3 CRISPR/Cas9系统在端足目昆虫中的应用 |
| 2.3.4 CRISPR/Cas9系统在枝角目昆虫中的应用 |
| 2.4 sgRNA的设计与脱靶效应 |
| 2.5 基因编辑技术的发展前景 |
| 2.6 本章小结与讨论 |
| 第3章 小菜蛾CRISPR/Cas9基因编辑体系的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 小菜蛾种群 |
| 3.1.2 小菜蛾中肠PxABCC2与PxABCC3基因sgRNA靶标序列的设计 |
| 3.1.3 sgRNAs靶标序列的体外合成 |
| 3.1.4 Cas9蛋白 |
| 3.1.5 小菜蛾卵的收集和显微注射 |
| 3.1.6 PxABCC2与PxABCC3基因突变个体的无损检测 |
| 3.1.7 ABCC2KO和ABCC3KO纯合突变种群的构建 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 小菜蛾CRISPR/Cas9基因编辑体系的构建 |
| 3.2.2 ABCC2KO和ABCC3KO纯合突变种群的构建 |
| 3.3 本章小结与讨论 |
| 第4章 ABCC2KO和ABCC3KO种群对Cry1Ac毒素的响应 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试小菜蛾种群 |
| 4.1.2 Bt毒素的制备 |
| 4.1.3 小菜蛾生物学测定分析 |
| 4.1.4 显性度分析 |
| 4.1.5 染色体遗传互补分析 |
| 4.1.6 小菜蛾中肠BBMV蛋白与Cry1Ac毒素的结合分析 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 ABCC2KO和ABCC3KO种群对Cry1Ac毒素的敏感性 |
| 4.2.2 ABCC2KO和ABCC3KO种群对Cry1Ac抗性的遗传分析 |
| 4.2.3 基因编辑种群的BBMV蛋白与Cry1Ac毒素的结合分析 |
| 4.3 本章小结与讨论 |
| 第5章 小菜蛾APNs基因的体外异源表达分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞继代培养 |
| 5.1.2 小菜蛾APNs基因克隆及重组质粒构建 |
| 5.1.3 细胞转染及免疫荧光定位 |
| 5.1.4 APN重组蛋白与Cry1Ac毒素的体外结合分析 |
| 5.2 结果分析 |
| 5.2.1 PxAPNs基因的克隆及表达分析 |
| 5.2.2 受体功能分析 |
| 5.3 本章小结与讨论 |
| 第6章 小菜蛾中肠PxAPN1和PxAPN3a基因敲除及功能验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 小菜蛾种群 |
| 6.1.2 PxAPN1和PxAPN3a基因sgRNA靶标序列的设计与体外合成 |
| 6.1.3 Cas9蛋白的准备 |
| 6.1.4 小菜蛾卵的收集和显微注射 |
| 6.1.5 小菜蛾PxAPN1和PxAPN3a基因突变个体的无损检测 |
| 6.1.6 APN1KO和APN3aKO纯合突变种群的构建 |
| 6.1.7 APN1KO和APN3aKO种群生物学测定分析 |
| 6.1.8 显性度和染色体遗传互补分析 |
| 6.2 结果分析 |
| 6.2.1 APN1KO和APN3aKO纯合突变种群的构建 |
| 6.2.2 APN1KO和APN3aKO种群对Cry1Ac毒素的生物学测定分析 |
| 6.2.3 APN1KO和APN3aKO种群对Cry1Ac毒素抗性的遗传分析 |
| 6.3 本章小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读学位期间所完成的论文 |
| 附录B 攻读学位期间参加的科研课题 |
| 致谢 |
（10）β-catenin基因在文昌鱼胚胎发育中的功能研究及两个脊椎动物神经嵴相关基因启动子在文昌鱼中的活性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 一 文昌鱼与进化发育生物学 |
| 1 文昌鱼简介 |
| 2 文昌鱼的胚胎发育 |
| 3 文昌鱼模式化进展 |
| 二 Wnt/β-catenin信号通路调控胚胎发育 |
| 1 经典Wnt/β-catenin信号通路简介 |
| 2 Wnt/β-catenin信号在胚胎发育中功能 |
| 三 文昌鱼与脊椎动物中神经嵴结构发育研究概况 |
| 1 文昌鱼与脊椎动物神经嵴结构信号通路演化 |
| 2 脊椎动物Snail和Sox9基因在神经嵴诱导中功能研究 |
| 四 论文的选题和目的 |
| 第二章 β-catenin基因敲除对文昌鱼胚胎发育影响 |
| 一 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 二 结果 |
| 1 β-catenin转录本呈现全身性均匀分布模式 |
| 2 β-catenin基突变体建立 |
| 3 β-catenin突变体表型分析 |
| 4 β-catenin基因敲除不影响背腹基因表达 |
| 5 β-catenin基因突变体中前端基因表达范围扩张 |
| 6 β-catenin基因突变体中尾端基因表达下调 |
| 7 β-catenin基因敲除影响口鳃组织基因表达 |
| 8 Dkkl/2/4 mRNA和(△P)β-catenin mRNA注射后胚胎表型分析 |
| 三 讨论 |
| 1 文昌鱼早期胚胎中β-catenin表达分析 |
| 2 文昌鱼中Wnt/β-catenin参与确定胚层界限,不参与胚胎背腹轴向建立 |
| 3 尾芽处的Wnt/β-catenin信号中心调控后端延伸及体节形成 |
| 4 Wnt/β-catenin信号抑制胚胎头部形成和影响具体咽区器官位置的划分 |
| 第三章 Snail和Sox9基因启动子在文昌鱼中活性分析 |
| 一 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 二 结果 |
| 1 显微注射F0代胚胎中Sox9-mCherry和Snail-mCherry嵌合表达 |
| 2 代胚胎中检测ox9-mCherry和Snail-mCherry表达检测 |
| 三 讨论 |
| 1 Tol2系统介导转基因效率分析 |
| 2 Sox9和Snail基因在神经嵴分化过程中功能实现 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、Creation of a Gene Knockout Population of Cotton（论文参考文献）
- [1]扑草净降解菌Pseudomonas sp. DY-1的降解机制及其在污染土壤修复中的应用研究[D]. 梁栋. 东北农业大学, 2021
- [2]黄萎病菌VdxyL3和VdITP1基因对棉花的抗病性影响[D]. 张小雪. 石河子大学, 2021
- [3]Hox基因介导的毒死蜱对热带爪蟾胚胎致畸的分子机制初探[D]. 曹玲. 浙江农林大学, 2021
- [4]寄主诱导的基因沉默在增强植物真菌病害抗性方面的研究进展[J]. 冯丹丹,邓蕾,汪祖鹏,潘慧,李文艺,钟彩虹,李黎. 植物科学学报, 2021(03)
- [5]CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建[D]. 孙琳. 华中农业大学, 2021
- [6]烟粉虱水平转移基因合成生物素和泛酸的作用研究[D]. 任飞荣. 沈阳农业大学, 2021
- [7]嗜线虫致病杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白的特性和功能[D]. 刘佳. 河北农业大学, 2020(01)
- [8]桑树内生枯草芽孢杆菌7PJ-16对桑椹菌核病生防作用及机理的研究[D]. 徐伟芳. 西南大学, 2020(11)
- [9]CRISPR/Cas9介导的小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素抗性的分子机制研究[D]. 孙丹. 湖南大学, 2020
- [10]β-catenin基因在文昌鱼胚胎发育中的功能研究及两个脊椎动物神经嵴相关基因启动子在文昌鱼中的活性分析[D]. 章磊. 厦门大学, 2019(12)