一、hTERT的结构功能特点与应用前景（论文文献综述）
陈凯华[1]（2019）在《沉默hTERT通过抑制肿瘤干细胞样特性增强鼻咽癌细胞株CNE-2R放射敏感性的机制研究》文中提出背景鼻咽癌在中国是发病率仅次于甲状腺癌的头颈部恶性肿瘤,主要高发于中国华南以及东南亚等地区。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段及根治性治疗的重要组成部分。目前,鼻咽癌已取得较理想的生存预后,但临床上仍有超过五分之一的鼻咽癌患者经过规范治疗后出现复发或远处转移。放射抗拒被认为是鼻咽癌治疗后失败的主要原因,但目前放射抗拒的具体机制尚未十分明确。越来越多研究表明,肿瘤出现放射抗拒可能与肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）有关。CSCs是一组极少数的增殖性失控、能够自我更新、多向分化以及具有干细胞特性的肿瘤细胞,它们对放射治疗和其他肿瘤治疗方式存在抗拒性。以往有学者发现,通过分次照射的方法获得的放射抗拒食管癌细胞显示出CSC特性及高水平端粒酶活性。端粒酶是一种核糖核蛋白复合酶,参与了大约90%人类肿瘤的端粒维持机制。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）是维持端粒酶活性的必要催化亚基,表达水平与端粒酶活性相一致。hTERT与端粒酶对于维持CSCs的生物学特性至关重要,也被认为参与调控肿瘤放射敏感性。我们前期研究发现,自主构建的放射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2R高表达被认为是潜在干性标记物的CD166蛋白。综上所述,我们也有理由推测CNE-2R细胞可能也具CSC样特性并表达高水平的端粒酶活性及hTERT。迄今为止,国内外鲜有关于鼻咽癌放射抗拒细胞的CSC样特性及针对CSC特性改善其放射敏感性的研究报道。此外,鼻咽癌放射抗拒细胞是否具有高水平端粒酶活性以及高表达hTERT呢?若以hTERT作为干预靶点,能否调控CSC样特性从而改善放射抗拒性鼻咽癌的放射敏感性,其中是否还有更深层次的机制呢?综上所述,我们认为有必要进行深入探讨以验证提出的假说。目的本研究首先通过系列实验验证课题组前期构建的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R具有CSC样特性、高水平端粒酶活性及高表达hTERT;然后利用慢病毒介导的RNA干扰沉默CNE-2R细胞的hTERT表达,利用体外、体内试验观察CNE-2R细胞的CSC样特性及放射敏感性的变化;最后再进一步研究hTERT与CSC样特性之间可能存在的信号调节通路,明确hTERT如何调控CSC特性并最终影响CNE-2R细胞的放射敏感性。本研究的最终结果可能为寻找靶向杀伤CSCs的鼻咽癌放射增敏疗法寻找一些新思路。方法1.采用qPCR检测鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R与亲代放射敏感细胞株CNE-2的干细胞相关基因、β-catenin及hTERT基因的mRNA相对表达量;Western-Blot实验检测CNE-2R与CNE-2细胞的干细胞相关蛋白、β-catenin及hTERT蛋白表达情况;免疫细胞化学检测CNE-2R细胞与CNE-2细胞中的标记滞留细胞比例;PCR-ELISA法检测各组细胞端粒酶活性。流式细胞术检测CNE-2R细胞和CNE-2细胞的CD133表达率;免疫磁珠分选获得CNE-2R-CD133+细胞与CNE-2R-CD133-细胞,采用CCK8法、细胞成球实验以及裸鼠体内成瘤实验证实CNE-2R-CD133+细胞具有CSC特性。2.设计并包装hTERT基因的RNA干扰慢病毒载体,再将hTERT干扰慢病毒转染CNE-2R细胞获得hTERT-shRNA细胞,空载病毒感染CNE-2R细胞获得NC-shRNA细胞,然后通过流式细胞术检测感染率,利用荧光定量PCR及Western-blot实验检测细胞转染后hTERT mRNA及蛋白的表达情况以验证沉默效果,最终构建稳定沉默hTERT的细胞株。3.利用PCR-ELISA检测CNE-2R细胞hTERT沉默前后的端粒酶活性。采用克隆形成实验、CCK-8实验及流式细胞术检测体外放射敏感性;接着构建裸鼠移植瘤模型,观察沉默hTERT对移植瘤放射敏感性的影响;采用Western-blot实验、免疫组织化学检测体外或体内的hTERT蛋白、干细胞相关蛋白及β-catenin蛋白的表达水平;利用TUNEL法检测移植瘤内的细胞凋亡指数。4.利用hTERT过表达慢病毒转染CNE-2R细胞,采用荧光定量PCR及Western-blot实验检测细胞转染后hTERT mRNA及蛋白的表达情况以验证过表达效果。用含有Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂XAV-939和激动剂SKL2001 的培养基培养细胞。Western-blot 实验检测 hTERT、β-catenin及干细胞相关蛋白以了解hTERT与Wnt/β-catenin信号通路的关系以及对干细胞相关蛋白表达的影响。细胞免疫荧光检测hTERT沉默或过表达后β-catenin蛋白在细胞核和细胞质的分布情况。免疫共沉淀实验检测hTERT与β-catenin蛋白是否存在直接相互作用。利用PCR-ELISA法检测各组细胞的端粒酶活性,CCK-8实验检测各组细胞的放射敏感性。结果1.CNE-2R细胞的干细胞相关基因及hTERT基因mRNA相对表达量均高于CNE-2细胞（P<0.05）;同样,CNE-2R细胞的干细胞相关蛋白、β-catenin及hTERT蛋白表达量明显高于CNE-2细胞。CNE-2R细胞与CNE-2细胞的标记滞留细胞比例分别为（3.10±0.63%）vs（0.40±0.35%）,P<0.001。CNE-2R细胞的端粒酶活性（1.618±0.022）显着高于CNE-2细胞（1.344±0.006）,P<0.05。流式细胞术结果显示,CNE-2R细胞与CNE-2细胞的CD133阳性率分别为（2.49±0.56%）vs（0.76±0.25%）,P=0.008;CNE-2R-CD133+细胞的体外增殖能力、体内成瘤能力以及端粒酶活性均显着高于CNE-2R-CD133-细胞及CNE-2R细胞（P<0.05）。2.流式细胞术结果显示,hTERT-shRNA细胞和NC-shRNA细胞的慢病毒感染率均达到90%以上。荧光定量PCR结果显示,hTERT-shRNA细胞的hTERT mRNA 相对表达量（0.164±0.023）明显低于 NC-shRNA 细胞（1.207士0.054）及 CNE-2R 细胞（1.000±0.041）,P<0.001。Western-Blot 实验结果同样显示hTERT-shRNA细胞的hTERT蛋白表达明显下调。3.克隆形成实验结果显示,各照射剂量下hTERT-shRNA细胞的存活分数均低于CNE-2R及NC-shRNA细胞,hTERT-shRNA细胞相对于CNE-2R细胞的放射增敏比为1.23>1,提示hTERT-shRNA细胞对射线更为敏感。CCK-8结果同样提示hTERT-shRNA细胞相对于CNE-2R细胞对射线更加敏感。流式细胞术检测结果显示,OGy射线照射时,hTERT-shRNA细胞的凋亡率稍微增加,CNE-2R细胞、NC-shRNA细胞及hTERT-shRNA细胞的凋亡率分别为（4.82±0.73%）vs（4.85±0.35%）vs（6.25±0.38%）,P=0.023;4 Gy射线照射后,3组细胞的凋亡率分别为（12.10±1.14%）vs（12.71±0.74%）vs（19.03±0.43%）,P<0.001;CNE-2R 细胞、NC-shRNA 细胞照射前后的凋亡率差异均无统计学意义（P>0.05）。PCR-ELISA结果显示,hTERT-shRNA细胞的端粒酶活性为（1.263±0.024）,明显低于NC-shRNA细胞（1.629±0.007）及CNE-2R细胞（1.618±0.022）,P<0.001。裸鼠移植瘤模型结果显示,OGy射线照射时,hTERT-shRNA组移植瘤生长受到轻微抑制;8Gy射线照射后,3组移植瘤生长速度均受到抑制,但hTERT-shRNA组抑制程度更加明显。TUNEL法检测各组移植瘤的体内细胞凋亡指数,结果与体外细胞凋亡率基本一致。Western-blot实验及免疫组化结果均显示,沉默hTERT后,体外及体内的干细胞相关蛋白表达水平均明显下调;免疫组化结果还发现,hTERT-shRNA组移植瘤的β-catenin蛋白主要表达于细胞膜与细胞质,而CNE-2R及NC组移植瘤的部分细胞核内也可见表达。4.Western-blot实验结果显示,hTERT正调节干细胞相关蛋白的表达,但未能明显影响Wnt3a及总β-catenin蛋白的表达;进一步检测发现,沉默hTERT后核内β-catenin蛋白显着减少,过表达hTERT后核β-catenin蛋白显着增多;抑制或激活Wnt/β-catenin信号通路后可正调节hTERT及干细胞相关蛋白的表达。免疫共沉淀可检测到CNE-2R细胞中存在着β-catenin/hTERT蛋白复合物,表明β-catenin与hTERT蛋白存在直接相互作用。PCR-ELISA结果显示,沉默hTERT或抑制Wnt/β-catenin信号通路均能降低CNE-2R细胞的端粒酶活性;而当抑制Wnt/β-catenin信号通路后,可通过过表达hTERT逆转端粒酶活性。CCK8实验结果同样显示,沉默hTERT或抑制Wnt/β-catenin信号通路均能增加CNE-2R细胞的放射敏感性;而当抑制Wnt/β-catenin信号通路后,可通过过表达hTERT逆转细胞的放射抗拒性。结论本研究首先证实了课题组前期通过分割照射构建的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R表现出CSC样特性并表达高水平的端粒酶活性以及hTERT。然后通过慢病毒介导的RNA干扰技术成功构建了稳定沉默hTERT的CNE-2R细胞株,结果发现沉默hTERT后可在体外及体内增强CNE-2R细胞的放射敏感性,同时下调CNE-2R细胞的端粒酶活性并抑制其CSC样特性。我们进一步研究发现,在CNE-2R细胞中存在hTERT与Wnt/β-catenin信号通路的正反馈环并调控CNE-2R细胞的端粒酶活性及CSC样特性,从而对CNE-2R细胞的放射敏感性起到调节作用。因此,干扰hTERT表达和阻断Wnt/β-catenin信号转导可能是一种靶向杀伤具有CSC样特性的放射抗拒性鼻咽癌细胞的有前景策略,这将为研究放射抗拒鼻咽癌的放疗增敏疗法提供了新的思路。
蒋喆[2]（2019）在《BDNF高表达永生化间充质干细胞细胞系的建立、分选及鉴定》文中进行了进一步梳理目的:利用靶向AAVS1的端粒酶基因及Crispr/Cas9技术构建永生化的脐带间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）系,通过流式细胞分选仪从中分选出高表达BDNF的细胞亚群,为缺血性脑损伤的基础与临床研究提供BDNF高表达单克隆细胞亚群。方法:1.构建靶向AAVS1的hTERT/GFP质粒及Crispr/Cas9质粒:通过酶切从自供血液提取的人类DNA序列中获得HAL及HAR基因序列,从PLK0.1质粒中获得hPGK基因序列,从PX458质粒中获得FlagX3、T2A-bGH、GFP基因序列,从购买的pBABE-neo-hTERT质粒中获得hTERT基因序列,并通过PCR桥接、载体连接、质粒转化等方式将上述基因序列通过特定的顺序连接获得hTERT/GFP质粒。2.筛选传代的BDNF高表达的MSC细胞:收集第1-9代MSC细胞上清液,进行BDNF ELISA检测,选择BDNF高表达的一代细胞进行后续实验。3.质粒共转染:将hTERT/GFP质粒重组整合入Crispr/Cas9靶向AAVS1位点共转染进入MSC细胞;经GFP荧光挑选hTERT/GFP基因阳性表达的MSC细胞;并使用rt-PCR法检测hTERT在MCS细胞转染前后的表达。4.筛选永生化高表达BDNF的MSC细胞亚群:使用流式细胞仪将hTERT/GFP阳性的MSC细胞及未转染的MSC细胞分别分选到两个96孔板中,每孔1个细胞,放置37℃,5%CO2培养箱中培养,观察细胞增殖,并扩大培养。使用ELISA法分别检测上述细胞上清液中BDNF的表达。结果:1.通过酶切、连接、重组、转化等方式,成功构建hTERT/GFP质粒,并成功测序。2.通过ELISA法检测出第七代细胞为BDNF表达最高的一代（P<0.001）。使用转染技术将hTERT/GFP、Crispr/Cas9质粒转染进入第七代MSC细胞中,形成永生化MSC细胞系并通过rt-PCR定量分析,提示转染成功并稳定表达。3.分选型流式细胞仪筛选为单细胞,扩大培养,使用ELISA法得到转染质粒组（MSC-GFP组）浓度为941.51+201.90pg/ml,BDNF浓度最高亚群为1311.29pg/ml,MSC组浓度为959.23+205.75 pg/ml,两组间统计无差异（P>0.05）。提示MSC细胞永生化后并未改变细胞分泌BDNF蛋白的水平。结论:利用Crispr/Cas9技术及靶向AAVS1的端粒酶基因能够成功构建永生化MSC细胞并能分泌与稳定表达BDNF。
侯小赛[3]（2018）在《miR-1182通过靶向hTERT抑制卵巢癌的转移和增殖》文中研究指明目的:目前研究发现,micromaRNA（miRNA）与多种危害人类健康的恶性肿瘤发生发展密切相关,其参与调控肿瘤细胞的生物学特性,例如增殖、侵袭、转移、凋亡等阶段,通过对癌基因、抑癌基因以及相关蛋白表达的表观遗传学调控对肿瘤细胞发挥作用,这表明miRNA有望成为癌症治疗靶点。MicroRNA1182（miR-1182）是micromaRNA调控网络的重要组成部分,对许多疾病发挥重要调节作用,然而,其对卵巢癌发生发展和作用机制尚未研究。本研究旨在探讨miR-1182在卵巢癌发生、发展以及转移中的表达情况,及其潜在的变化规律和作用靶点,为临床诊断和治疗卵巢癌提供理伦依据。方法:本研究通过收集我院2015年03月至2018年03月之间卵巢癌患者行手术切除的卵巢上皮癌组织标本,共50例;同时收集癌旁正常卵巢组织标本50例。在第一部分通过荧光实时定量PCR（RT-PCR）法观察比较miR-1182在卵巢癌组织、细胞（SKOV3）和正常卵巢组织及细胞（IOSE80）中的表达情况和变化规律。在第二部分中,为了研究miR-1182的潜在靶点,我们利用TargetScan,miRDB和microRNA三种公开的算法对其进行了检测,以推测阐明miR-1182的可能靶点,并采用双荧光素酶报告系统证实了人端粒酶逆转录酶（human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT）是miR-1182的直接调控靶点,并被实施到下一步的实验中。在第三部分中我们在SKOV3细胞中分别设立三个组进行相似的实验（miR-NC组,miR-1182模拟组和模拟物+ hTERT组）,使用RT-PCR方法和Western blot蛋白印记实验检测miR-1128对靶基因hTRET表达情况的影响,进而明确miR-11H82与其靶基因之间的相关性。在第四部分中我们进一步采用MTT法检测卵巢癌细胞的增殖率,采用Transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力,从而明确miR-1182对卵巢癌的发生与发展,以及在侵袭和转移方面发挥的作用。结果:1、miR-1182在卵巢癌组织和细胞中表达下调我们通过RT-PCR的方法观察了miR-1182在卵巢癌组织和细胞（SKOV3细胞）及正常卵巢组织和细胞（IOSE80细胞）中miR-1182的表达情况,结果显示,与正常卵巢组织相比,卵巢癌组织中miR-1182的表达水平下调,差异有统计学意义（p<0.0001,见图1-1）,与正常卵巢细胞（IOSE80细胞）相比,卵巢癌细胞（SKOV3细胞）中miR-1182的表达水平也呈下降趋势,差异有统计学意义（p<0.001,见图1-2）,因此我们认为miR-1182在卵巢癌进展过程中具有一定的调节作用。2、卵巢癌中hTERT是miR-1182的直接靶标我们利用TargetScan,miRDB和microRNA三种公开的算法推测出人端粒酶逆转录酶（human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT）是miR-1182的潜在靶点,并建立含有hTERT3’UTR野生型和含有hTERT3’UTR突变型miR-1182种子序列的萤光素酶报告载体,利用模拟物增加miR-1182的表达从而导致野生型hTERT 3’UTR报告基因的荧光素酶活性降低,但对突变型却没有影响（P<0.001,见图2-2）,这表明可通过调节miR-1182来抑制hTERT的表达水平。3、miR-1182和hTERT的相关性我们在SKOV3细胞中分别设立三个组进行相似的实验（miR-NC组,miR-1182模拟组和模拟物+ hTERT组）,通过实时PCR分析和Western blot蛋白质印迹两种实验可以发现,SKOV3细胞中miR-1182的上调可以降低hTERT的表达水平（图3-1,图3-2）,其差异有统计学意义（P<0.05）,这些数据表明hTERT受到miR-1182的负调控。4、miR-1182抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移我们通过MTT法检测细胞增殖率,MTT结果显示,通过转染miR-1182模拟物上调miR-1182后,SKOV3细胞的细胞增殖率出现降低趋势,相比之下,下调miR-1182反而促进卵巢癌细胞的生长（见图4-1）。在Transwell实验中,我们发现SKOV3细胞的迁移和侵袭能力通过上调miR-1182起到抑制作用。（p<0.05,图4-2,图4-3）。结论:首先实验发现miR-1182在卵巢癌组织、细胞（SKOV3）中的异常表达情况,进而证实hTERT是miR-1182的潜在靶点,hTERT的表达可被miR-1182调节,hTERT受到miR-1182的负调控,从而抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭迁移能力,揭示miR-1182/hTERT轴可能成为诊断和治疗卵巢癌的潜在靶点,为临床提供理论依据。
杨圆圆[4]（2018）在《E1A基因修饰的间充质干细胞介导的CD3-HAC阻断PD-1/PD-L1对转移性乳腺癌的免疫治疗研究》文中指出背景和目的:乳腺癌是影响全世界女性健康的头号杀手,据全国肿瘤登记中心统计,2015年全国乳腺癌发病病例约26.9万例,死亡病例约7.0万例。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是其中恶性程度最高的一个分型,预后极差,且极易发生脑部和内脏的转移。全球范围内每年有超过50万人死于乳腺癌转移,其中位生存期仅有2到3年。临床上对于TNBC的治疗手段以手术和化疗为主,但对于已发生转移的患者手术切除明显是不现实的,化疗药物也很难起到很好的效果,并常常伴有副作用。随着免疫治疗的迅速发展,CAR-T、TCR-T、肿瘤疫苗、双功能抗体、免疫检查点抑制剂等多种治疗方案应用于恶性肿瘤的治疗中,并取得了喜人的临床效果。其中又以PD-1/PD-L1通路阻断剂在实体瘤的疗效最为突出。对TNBC的肿瘤微环境研究表明,TNBC是一种高异质性和突变负荷的肿瘤类型,且有着较多的淋巴细胞浸润和PD-L1表达。这样的免疫微环境对于PD-1/PD-L1抑制剂发挥作用是非常有益的。随着临床适应症的扩展和患者范围的扩大,PD-1抗体的不良反应事件逐渐增多,且对部分患者临床响应率偏低也一直是饱受诟病的问题。瘤内局部给药有着避免PD-1抗体全身暴露、减少副作用、提高药物利用度、增强免疫反应的优势。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一类来源广泛免疫原性低,具有多项分化潜能的成体干细胞。多项研究表明,MSCs可以有效地向肿瘤原位和微小转移灶归巢,这些特性使其成为基因治疗的理想载体。根据上述理论和研究基础,我们设计双特异性的融合蛋白CD3-HAC（HAC为文献中报道的具有高亲和能力的PD-1胞外区突变序列）,并以人端粒酶启动子（hTERTp）调控其表达,将其克隆到腺病毒载体中,利用E1A修饰的MSCs于肿瘤部位包装分泌腺病毒,并感染肿瘤细胞。继而在肿瘤原位激活T细胞,发挥免疫杀伤功能。方法:采用PCR、重叠PCR（overlap PCR）、酶切、连接等方法构建pAd-hTERT-CD3-HAC,pAd-hTERT-CD3scFv,pAd-hTERT-HAC 腺病毒表达载体,pcDNA3.1（+）-CD3-HAC,pcDNA3.1（+）-CD3scFv,pcDNA3.1（+）-HAC 真核表达载体,以及pAdTrack和pLentiR空载对照载体,并经测序验证其基因序列的正确性。将表达载体 pcDNA3.1（+）-CD3-HAC,pcDNA3.1（+）-CD3scFv,pcDNA3.1（+）-HAC 瞬时转染至293T细胞,收集培养上清并通过His标签亲和层析对产物进行纯化,通过Western blot检测培养上清及纯化后样品中目的蛋白的表达。通过WB、免疫荧光、流式分析,检测CD3-HAC蛋白的表达及其与靶细胞的结合。利用活细胞工作站监测PBMC与AdCD3-HAC感染的MDA-MB-231乳腺癌靶细胞之间经典相互作用,乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）释放法定量检测PBMC对不同靶细胞的杀伤水平,流式检测淋巴细胞表面活化分子的表达,ELISA检测细胞因子的分泌,CellTrace Far Red检测淋巴细胞增殖等,从不同角度全面分析CD3-HAC蛋白的生物学功能。通过ELISA及细胞凋亡检测证实HAC对PD-1/PD-L1通路的阻断作用。联合低剂量5-FU,检测其对腺病毒感染的增敏及免疫杀伤的促进作用。使用Bio-Rad QX200数字微滴PCR系统检测不同时间点腺病毒在MSC.Adtrack.E1A胞内及上清的绝对拷贝数,绘制腺病毒复制时间曲线;采用细胞透射电镜证明腺病毒颗粒在MSC.Adtrack.E1A中的存在。建立MDA-MB-231乳腺癌转移小鼠模型,尾静脉注射MSC.AdLuc.E1A或MSC.AdLuc.LentiR.至荷瘤小鼠体内,IVIS成像系统观察其向肿瘤部位的归巢情况。尾静脉注射MSC.Adtrack.E1A或MSC.AdCD3-HAC.E1A,检测CD3-HAC蛋白对PBMC的体内激活作用。最后,利用MDA-MB-231乳腺癌肺转移小鼠模型评价MSC.AdCD3-HAC.E1 A治疗系统单独或联合低剂量5-FU对肿瘤生长的抑制作用,并绘制生存曲线。结果:成功构建 pAd-hTERT-CD3-HAC,pAd-hTERT-CD3scFv,pAd-hTERT-HAC,pcDNA3.1（+）-CD3-HAC,pcDNA3.1（+）-CD3scFv,pcDNA3.1（+）-HAC,pAdTrack及pLentiR载体,经测序证明其基因序列正确。免疫荧光及流式分析,结果表明CD3-HAC双特异性融合蛋白CD3-HAC表达于乳腺癌细胞,并成功结合于细胞表面。活细胞工作站监测PBMC与AdCD3-HAC感染的MDA-MB-231乳腺癌细胞之间的相互作用。LDH释放实验结果表明CD3-HAC能够特异性介导T细胞对PD-L1阳性细胞的杀伤。HAC功能蛋白可以阻断PD-1与PD-L1相互作用。联合低剂量5-FU可增敏腺病毒对靶细胞的感染,进而促进PBMC的细胞毒作用。腺病毒AdTrack及慢病毒LentiR.E1A共感染HUMSC后,腺病毒在MSCs中复制及包装,最终裂解MSCs并释放具有感染能力的完整腺病毒颗粒。成功建立MDA-MB-231肺转移小鼠模型,经基因修饰的MSCs在尾静脉注射24小时后即可归巢至肿瘤局部,然后能够产生新的病毒并感染肿瘤细胞,实现体内CD3-HAC融合蛋白介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤。体内抑瘤实验证明,MSC.AdCD3-HAC.E1A+PBMC单独或5-FU联用组,小鼠的生存期明显延长。结论:本课题建立了由经过基因修饰的MSCs运载CD3-HAC双特异性融合蛋白的局部靶向治疗系统,并与5-FU联用增强抗肿瘤作用。在增强免疫应答的同时,避免了 PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂的副作用,为恶性转移肿瘤的治疗提供了新的思路。
杨育才[5]（2017）在《基于金属纳米颗粒的肿瘤诊疗新方法研究》文中进行了进一步梳理肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致克隆性异常增生而形成的异常病变,其中恶性肿瘤容易侵润和转移、不易根治、死亡率高,是威胁人类健康的重大疾病。肿瘤的早期诊断、早期治疗对延长病人生存时间、提高生活质量、降低死亡率具有非常重要的意义。虽然现代的医疗水平和诊断技术都比过去有了显着的提高,但是在肿瘤的早期诊断方面仍然有很多欠缺,导致部分病人在发现肿瘤时已经进入晚期,失去了治疗的最佳时机。因此,亟需开发肿瘤诊断和治疗的新原理、新方法以提高肿瘤的早期诊断率和治愈率。近年来,纳米技术的快速发展以及与物理、化学、生物学等其他学科的交叉融合,为肿瘤诊疗的发展提供了新的契机。目前,已经出现很多新的基于纳米材料的检测方法,具有较高的灵敏度和特异性,然而,能够在细胞中进行检测的方法仍然很少。对细胞内生物分子的实时、原位检测,不仅对肿瘤生物学的基础研究具有重要的意义,而且有助于提供肿瘤诊断新方法,因此,开发细胞内的生物传感器十分有必要。此外,现有的肿瘤治疗药物通常靶向性较差,对正常细胞仍具有一定的杀伤力,治疗带来的副作用较大,且容易耐药。以纳米材料为基质,开发靶向性强的纳米药物将会为肿瘤的治疗开辟新的途径。本论文以金属纳米材料为载体,开发了检测肿瘤标志物以及靶向杀伤肿瘤细胞的新方法,为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。第一章:基于金纳米颗粒的端粒酶检测新方法研究在本章中,我们构建了一种基于金纳米颗粒的细胞内端粒酶活性检测新方法,通过在金纳米颗粒表面修饰端粒酶引物序列和信号序列制备成端粒酶活性检测探针,在细胞的内吞作用下探针进入细胞,当遇到有活性的端粒酶时,探针的引物序列末端可以延伸出许多重复的端粒序列,进而与周围信号序列的茎环结构互补配对并打开茎环,使修饰在5’端的荧光基团远离金纳米颗粒表面并恢复荧光,通过检测荧光值的大小即可表征端粒酶的活性。此外,基于同样的末端延伸原理,我们又设计出一种可以在体外检测核酸片段的生物传感器。通过一系列的实验,证明以上两种传感器在检测细胞内端粒酶活性以及溶液中核酸浓度方面都具有良好的检测性能。这将为肿瘤广谱标志物端粒酶以及肿瘤相关核酸片段的灵敏检测提供新的方法,具有发展成为肿瘤早期诊断方法的潜力。第二章:基于液态金属纳米颗粒的肿瘤细胞内mRNA检测新方法研究在本章内容中,我们构建了一种可以检测肿瘤细胞内mRNA的检测新方法,这种方法以液态金属镓铟合金纳米颗粒为核心,通过表面修饰互补配对且分别带有荧光基团和荧光淬灭基团的双链DNA分子来形成检测探针,在细胞核内体的弱酸性环境下,稼铟合金纳米颗粒逐渐融合释放出表面的双链DNA分子,当待测mRNA存在时,mRNA与双链DNA竞争性结合,使带有荧光标记的短DNA链脱落,荧光恢复,通过对荧光值的检测来实现对靶mRNA的检测。在完成检测的一定时间后,稼铟合金纳米颗粒将由细胞代谢排出,因此该纳米探针不仅可以方便快捷的对mRNA进行体内、体外检测,并且由于其可降解性,即使进行体内检测,也不会对细胞产生毒性,为将来的肿瘤在体检测和实时监测提供了新的思路。第三章:基于适体/蛋白酶修饰的金纳米颗粒用于肿瘤治疗的新方法研究在本章内容中,我们设计并制备了一种基于适体的靶向性蛋白酶纳米复合物MUC1-ProK-GNPs,通过MUC1适体与肿瘤细胞膜上高表达的MUC1蛋白结合,将纳米复合物拉近至肿瘤细胞膜表面,使得细胞膜上的膜蛋白靠近金纳米颗粒上修饰的蛋白酶K,导致周围距离较近的膜蛋白均被水解,同时由于细胞膜的流动性,水解后的MUC1膜蛋白与适体的结合变得松散,于是从适体上脱落,进而纳米复合物可以寻找下一个MUC1膜蛋白并与之结合,重复上述过程,直至大部分膜蛋白被摧毁。这一过程将导致细胞膜上的蛋白质逐渐变少,细胞膜的物质代谢、信息交换以及屏障功能均受到破坏,最终引起细胞死亡。经过一系列实验,我们证实该纳米复合物具有极高的肿瘤细胞靶向性,对正常细胞毒性很低,具有发展成为抗肿瘤药物的潜在应用价值,为肿瘤治疗提供了一种新的思路。
张岩[6]（2016）在《人端粒酶逆转录酶基因修饰的内皮祖细胞改善糖尿病大鼠的勃起功能及机制研究》文中提出[目的]建立含有hTERT基因的重组慢病毒载体,进一步鉴定构建的载体是否正确。扩增慢病毒颗粒的数量,并检测浓缩后的病毒滴度,以便用于下一步的研究——基因修饰大鼠EPCs。[方法]采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）的方法获取hTERT基因的全长片段,并大量扩增。AgeⅠ和NheⅠ内切酶处理GV341质粒使其在特定酶切位点断裂,从而线性化。在交换酶的作用下,将获得的hTERT基因片段与线性化GV341质粒交换连接,产生重组质粒。将这些重组质粒导入制备好的感受态细胞（由大肠杆菌制备）中,在含有氨苄青霉素的培养基中培养扩增。采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）鉴定单克隆菌落中含有的质粒,有hTERT基因表达即为阳性克隆。检测这些初步鉴定为阳性菌落中质粒的核苷酸序列,并将结果与hTERT基因序列进行比较,两者的核苷酸序列完全相同,表示成功构建了hTERT基因重组质粒。大量扩增且纯化hTERT基因重组质粒和相应的辅助质粒（pHelper1.0和2.0）.在转染试剂和Opti-MEM的辅助下,三种质粒一起转染293T细胞,合成病毒颗粒。2天后,上清滤去细胞残渣,离心超滤获取浓缩的病毒液。制备好的病毒液处理293T细胞,使病毒转染293T细胞后,利用含适当浓度的筛选药物（嘌呤霉素）的培养基孵育,在显微镜下监测细胞的状态,计算病毒的滴度。[结果]核苷酸序列检测结果显示质粒与hTERT基因的序列吻合,构建的重组质粒中的目的基因序列完全正确。利用293T细胞合成了大量的慢病毒颗粒,利用嘌呤霉素筛选处理,确定浓缩后病毒的最终滴度为2×108TU/ml。[结论]我们成功建立了含有hTERT基因的重组慢病毒载体,并且合成量较大且浓度高,可顺利的用于我们的下一步研究—-hTERT基因修饰EPCs。[目的]将hTERT重组慢病毒载体转染大鼠EPCs,探讨外源性hTERT基因在大鼠EPCs内的表达及对大鼠EPCs的影响。[方法]采用密度梯度离心法原代分离培养大鼠EPCs,细胞免疫荧光方法检测表面标志CD31、CD34、CD133和血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2）在EPCs中的表达,Western blot法检测内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）的表达。在特定的诱导培养基条件下将大鼠EPCs向平滑肌细胞和脂肪细胞定向分化。当感染复数（multiplicity of infection,MOI）为50时,将hTERT重组慢病毒载体或阴性对照病毒载体转染大鼠EPCs,得到EPCs-hTERT或EPCs-control。利用嘌呤霉素筛选转染后的大鼠EPCs得到阳性克隆。免疫荧光法、Western blot及Real-time PCR法检测hTERT及大鼠端粒酶逆转录酶（rat telomerase reverse transcriptase, rTERT）在EPCs-hTERT中的表达。端粒重复序列扩增（telomeric repeat amplification protocol, TRAP）法检测EPCs-hTERT的端粒酶活性。为进一步了解hTERT过表达对大鼠EPCs的影响,细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）法及5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）法检测EPCs-hTERT的增殖能力。二氯二氢荧光素二乙酸酯（dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, DCFH-DA）荧光探针检测EPCs-hTERT内的ROS水平。将EPCs-hTERT在氧化应激条件下培养,CCK-8法检测EPCs-hTERT的抗氧化应激能力。[结果]原代分离培养出大鼠EPCs。大鼠EPCs表达CD31、CD34、CD133和VEGFR-2,阳性率分别为（96.8±0.5）%、（97.2±1.4）%、（92.8±5.3）%和（91.5±3.7）%。Western blot可检测到大鼠EPCs内eNOS的表达。多向诱导分化鉴定结果显示,大鼠EPCs可定向诱导分化为脂肪细胞（油红O染色阳性）及平滑肌细胞（α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性）。慢病毒转染后,EPCs-hTERT内的hTERT基因在nRNA和蛋白水平的表达显着升高,并对rTERT的表达无影响。免疫荧光检测可见EPC-hTERT内的TERT蛋白表达于细胞核及细胞浆内,同时flag蛋白表达于细胞浆内,说明hTERT表达于细胞浆内。TRAP端粒酶活性检测结果显示,EPCs-hTERT的端粒酶活性显着升高。CCK-8法和EdU法结果显示,EPCs-hTERT的增殖能力显着强于EPCs和阴性对照病毒转染的EPCs （EPCs-control）。 EPCs-hTERT内ROS水平较低,且在氧化应激条件下培养,EPCs-hTERT的存活率显着高于EPCs和EPCs-control。[结论]成功分离并培养大鼠EPCs。hTERT基因重组慢病毒转染后,EPCs-hTERT端粒酶活性升高,且具有较强的增殖能力和抗氧化应激能力。EPCs-hTERT对糖尿病ED大鼠勃起功能的作用及机制研究[目的]探讨阴茎海绵体内注射EPCs-hTERT是否能够改善糖尿病ED大鼠勃起功能,并对可能机制进行探索。[方法]利用腹腔内注射链脲佐菌素（60mg/kg）的方法建立大鼠糖尿病模型,并进一步采用阿扑吗啡（apomorphine, APO）实验筛选糖尿病ED大鼠。将30只SD雄性大鼠分为5组：正常对照组、糖尿病ED组、采用EPCs治疗的糖尿病ED组（EPCs组）、采用EPCs-control治疗的糖尿病ED组（EPCs-control组）、采用EPCs-hTERT治疗的糖尿病ED组（EPCs-hTERT组）。2周后电刺激海绵体神经检测每组的勃起功能,并计算海绵体内压（intracavernous pressure, ICP）与平均动脉压（mean artery pressure, MAP）的比值。免疫荧光法检测阴茎组织内平滑肌含量和移植的EPCs的存活量。采用Masson’s染色检测海绵体内纤维的含量。TUNEL法检测海绵体内细胞凋亡情况。Western blot法检测海绵体内转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）/Smad2/3通路、Bcl-2、Bax、eNOS、磷酸化eNOS （phospho-eNOS, p-eNOS）和神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）的表达情况。分别采用ELISA法和硝酸盐还原法测定大鼠阴茎海绵体组织中cGMP浓度和细胞内NO浓度。[结果]经EPCs和EPCs-control治疗后,糖尿病ED大鼠的勃起功能显着改善。EPCs-hTERT组的ICP/MAP比值显着高于EPCs和EPCs-control组。免疫荧光检测发现阴茎组织内的平滑肌含量及EPCs-hTERT存活量明显多于EPCs或EPCs-control组。Masson’s染色显示EPCs-hTERT组的海绵体内纤维含量显着降低,且TGF-β1/Smad2/3通路的表达显着降低。与EPCs和EPCs-control组相比,EPCs-hTERT组阴茎海绵体内凋亡水平及Bax/Bcl-2比值均较低。EPCs-hTERT组的海绵体内NO、cGMP含量和eNOS、p-eNOS及nNOS表达水平显着高于糖尿病ED组。[结论]EPCs-hTERT可显着改善糖尿病ED大鼠的勃起功能,其机制可能为EPCs-hTERT在阴茎海绵体内存活量增多,并进一步减轻阴茎海绵体纤维化、降低组织内细胞凋亡水平和增加NO合成。
谢星[7]（2016）在《H3N2亚型犬流感病毒保护性单抗的制备及宿主microRNA对病毒复制的影响》文中研究说明H3N2亚型犬流感病毒（canine influenza virus,CIV）是一种在犬群中流行的能够引起犬咳嗽、高热、肺炎甚至死亡的高度接触性传染病。犬流感病毒不仅对犬类的生存和健康带来严重的危害,同时也给人类健康带来巨大的风险,如果能够制备针对犬流感病毒的有效单抗,并阐明犬流感病毒的感染机制,无疑将有效地促进对犬流感病毒感染的预防和控制。然而,目前却尚无针对H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体,亦没有研究该病毒的合适细胞模型。因此,本研究制备了针对H3N2亚型犬流感病毒的保护性单克隆抗体,并建立了永生化的犬细支气管上皮细胞作为研究犬流感病毒的细胞模型。另外,本研究还获得了原代犬细支气管上皮细胞和原代犬肺泡巨噬细胞感染H3N2亚型犬流感病毒后的microRNA差异表达谱,并对其中的3个microRNA的作用进行了研究,研究结果表明宿主细胞在被犬流感病毒感染后,能够通过改变microRNA的水平来影响病毒在细胞内的复制,研究结果有助于阐明犬流感病毒感染宿主细胞的分子机制。1. H3N2亚型犬流感病毒单克隆抗体的制备及相关特性分析在对H3N2亚型犬流感病毒A/Canine/Jiangsu/06/2010 （JS/10）株进行扩增和纯化的基础上,以全病毒作为免疫抗原皮内多点注射免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合及杂交瘤细胞的亚克隆,获得了7株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,随后利用7株杂交瘤细胞制备了腹水并进行纯化,最终获得了 7株单克隆抗体,并对单克隆抗体的特性进行了分析。其中,单抗D7的中和效价达了 1:12800,并且对不同的H3N2亚型流感病毒株具有交叉反应性;Western blot鉴定结果表明,该单抗所针对的抗原表位位于相对保守的HA2片段。本研究制备的针对H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体,为该病毒的检测及其感染的治疗提供了物质基础,具有潜在的应用价值。2.单克隆抗体对不同H3N2亚型流感病毒株感染的保护作用为评估单克隆抗体D7对H3N2亚型犬流感病毒感染的保护作用,本研究以BALB/c小鼠为感染模型,评估了单抗D7对H3N2亚型犬流感病毒江苏分离株JS/10、广东分离株GD/12以及H3N2亚型猪流感病毒山东分离株SD/05感染的保护效果。将单抗D7预先给小鼠注射后,分别感染上述3种流感病毒,并以非相关单抗、单独病毒感染以及PBS作为对照,于病毒感染后第2、4、6、10和14天等5个时间点,分别测定小鼠体重,血液、粪便及不同脏器中的病毒载量,以及肺组织中的细胞因子（IFN-γ和TNF-α）水平。同时,对小鼠的肺、心、脑3种脏器进行组织病理学观察及免疫组化分析。实验结果表明,单抗D7对以上3株H3N2亚型流感病毒株的感染均起到了一定的免疫保护作用,其中对JS/10株的保护效果最好,表现为腹腔注射单抗D7后,较好的维持了感染小鼠的体重,降低了各脏器的病毒载量,并减轻了病毒感染对各脏器所造成的组织病理损伤,降低了与病毒感染相关的IFN-γ和TNF-α表达水平。本研究说明单抗D7对H3N2亚型流感病毒感染具有良好的防控效果。3. 永生化犬细支气管上皮细胞系的建立及其特征分析为深入研究犬流感病毒的致病机制,本研究分离并培养了原代犬细支气管上皮细胞（CBECs）,并在此基础上,将端粒酶（hTERT）基因以真核重组表达质粒（pEGFP-hTERT）的形式转入CBECs中,建立了永生化的犬细支气管上皮细胞系（hTERT-CBECs ）。特性分析表明,永生化的hTERT-CBECs保留了原代细胞的形态和功能特征;实时定量PCR（qRT-PCR）、增殖试验、核型分析、端粒酶活性检测以及Western blot等方法证实,永生化犬细支气管上皮细胞传至第50代,仍具有很强的端粒酶活性、延长的增殖寿命以及二倍体染色体特征;软琼脂分析和裸鼠体内致瘤性试验均表明,该永生化细胞系不具有致瘤性。本试验获得的原代犬细支气管上皮细胞及永生化犬细支气管上皮细胞系,为探讨犬流感病毒等呼吸道病原的感染机制提供了重要的生物材料。4. CIV感染犬原代细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的microRNA表达谱分析分离培养了原代犬细支气管上皮细胞和原代犬肺泡巨噬细胞,并通过small RNA测序和microRNA基因芯片测序,获得了以上两种细胞在感染H3N2亚型犬流感病毒后的microRNA表达谱。分析结果表明,在原代犬细支气管上皮细胞和原代犬肺泡巨噬细胞中,分别检测到了421和292个microRNA （miRNA）的表达,其中差异表达倍数在2倍以上的miRNA分别有117个和71个。通过TargetScan、PITA和miRanda数据库对这些差异表达miRNA的靶基因进行预测,并在Gene Ontology和KEGG数据库中对这些靶基因的功能进行预测注释,结果表明这些差异表达miRNA主要参与抗病毒应答,凋亡应答和趋化因子细胞因子炎性应答等信号通路。另外,试验还通过qRT-PCR对测序结果进行了验证,结果表明qRT-PCR结果与测序结果中miRNA的表达水平变化趋势一致,说明测序结果较可靠。研究所得到的miRNA表达谱,为犬流感病毒致病机制的研究提供了重要信息。5.宿主细胞microRNA对H3N2亚型犬流感病毒复制的影响选择病毒感染后表达水平显着下调的3个miRNA: cfa-miR-125b、cfa-miR-151和cfa-miR-423a,并对其在细胞抵抗病毒感染中的作用展开研究。试验以永生化的犬细支气管上皮细胞（hTERT-CBECs）和犬巨噬细胞系（DH82）为基础,分别以腺病毒载体和慢病毒载体,构建了3个miRNA的稳定过表达和抑制细胞系,然后分析3个miRNA过表达或者表达被抑制后,对病毒在相应细胞中的复制能力进行评估,同时对感染细胞中病毒的NP和NS1表达水平进行检测。研究结果显示,cfa-miR-125b和cfa-miR-151的过表达能够促进病毒的复制,而当这两种miRNA的表达被抑制后,则会导致病毒复制能力显着下降,而cfa-miR-423a的过表达和抑制则对病毒的复制能力没有明显影响。同时qRT-PCR和Western blot检测结果也显示cfa-miR-125b和cfa-miR-151的过表达和抑制分别能够提高和降低NP和NS1的表达水平,并且这种现象在hTERT-CBECs和DH82细胞中均存在。此外,在上述两种细胞中,无论cfa-miR-423a过表达还是抑制都能抑制NP的表达水平,而对NS1的表达水平没有影响。本试验表明,当细胞受到H3N2犬流感病毒感染后,可以通过改变自身的miRNAs水平来调控病毒的复制。该研究有助于进一步阐明细胞对病毒感染的抵抗机制。
牛星[8]（2016）在《人端粒酶（hTERT）表达促进剂的筛选及其抗衰老活性研究》文中进行了进一步梳理衰老是人类健康领域的重大科学问题之一,由其引起的机体组织器官衰老问题也给整个生命科学和医学领域带来了严峻的挑战。研究表明,端粒对于细胞复制性衰老、整体性衰老以及由其引起的衰老相关疾病等生理病理过程起着重要的作用,端粒长度更被作为一种与生物衰老相关的标志物。端粒酶是细胞中负责延长端粒的一种核糖核蛋白复合体,其活性与人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达密切相关,外源性表达hTERT可以提高细胞端粒酶活性,赋予其抗衰老或永生化能力。因此,hTERT表达促进剂有望成为抗衰老的新策略。本论文利用荧光素酶报告系统,构建促进hTERT表达化合物的筛选系统,对来自天津科技大学药物合成实验室的156种小分子化合物进行筛选,获得一种促进hTERT表达的化合物HKL2-3-35。分别用终浓度为4 μM和8 的化合物HKL2-3-35处理宫颈癌HeLa细胞,结果发现HKL2-3-35能够促进端粒的延长,促进细胞增殖和迁移,研究表明HKL2-3-35能够加快细胞由G1至S期的转换。同时,用终浓度为0.25μM和0.5 的化合物HKL2-3-35处理人胚胎成纤维细胞,发现化合物HKL2-3-35具有明显的抗衰老作用。另外,本论文对生活中接触到的系列环境因子化合物进行筛选,发现乙酸、咖啡因和乙酸乙酯能够促进hTERT的表达,与化合物HKL2-3-35促进效果相似,但具有更高的特异性。进一步研究发现,HeLa细胞经乙酸处理后,p21及p53 mRNA水平分别下调58.6%和31.4%;咖啡因处理后,p21及p53 mRNA水平分别下调11.6%和31.3%,表明hTERT表达促进剂可以加快细胞周期,增强细胞活力,减缓细胞衰老。综上所述,本论文筛选出化合物HKL2-3-3、乙酸、咖啡因和乙酸乙酯四种hTERT表达促进剂,为端粒酶的抗衰老机制研究提供更多的理论支持,也为开发治疗衰老相关疾病的药物提供新的策略。
杨国华[9]（2015）在《重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERT-E1a对结肠癌抑制作用的实验研究》文中研究指明结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,据国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer）资料显示,全球结直肠癌新发病例在男性中发病率位居恶性肿瘤第3位,女性患者仅次于乳腺癌而位居第2位。我国结肠癌发病率位于肺癌、胃癌、肝癌和乳腺癌之后,居第5位。尽管在肿瘤防治以及手术、放疗、化疗等治疗策略上都有进步,这些仅限于在初期肿瘤的治疗中有较满意的疗效,而在晚期多无法获得根治。目前临床迫切需求新型的更有效的治疗手段进入临床应用。在肿瘤研究领域,基因治疗是一项有潜力的逆转常规放化疗抵抗的研究热点之一。然而,基因治疗的有效性及其特异性仍存在诸多挑战。溶瘤病毒能够特异性识别肿瘤细胞并具备复制能力,通过直接溶瘤而杀伤肿瘤细胞。此外,溶瘤病毒还可以通过基因修饰等分子工程的操作,携带各种肿瘤特异治疗元件产生抗肿瘤免疫等多种作用发挥抗癌效应。这种将肿瘤的病毒治疗与基因治疗结合起来的方法,利用溶瘤病毒选择性在肿瘤细胞内的增殖与复制,增加溶瘤病毒携带的抗癌基因的拷贝数量,提高其表达水平,从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。因此,溶瘤病毒为强效且特异选择性杀伤的极具潜力的抗肿瘤方法之一。基于腺病毒的载体是基因转移最广泛应用的平台之一。然而,非复制潜能的腺病毒极少可以有效地清除肿瘤细胞。因此,需要极大的浓度或剂量以达到较有效的抗肿瘤反应;但是往往诱导宿主抗病毒免疫反应,导致病毒载体在随后的组织免疫与毒性反应过程中被中和,而失去治疗作用。为克服这些局限,条件性复制潜能的腺病毒被开发而广泛检测评估,这一系列的病毒可特异性地在肿瘤细胞内复制,随后溶解肿瘤细胞并释放子代病毒,继续感染并杀伤邻近的肿瘤细胞。近年来的研究证实,可与有复制潜能的腺病毒中和的抗体实际上对这些腺病毒作用有限,因此可以推测,肿瘤特异选择性复制潜能的腺病毒在肿瘤基因治疗中极为有效。在本研究中,已应用肿瘤特异启动子人端粒酶逆转录酶（h TERT）以及肿瘤细胞选择性凋亡诱导基因凋亡素（Apoptin）构建了重组溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a,并已经在一系列的不同类型肿瘤细胞中如胃癌、前列腺癌中呈现出强效的抗肿瘤生长与抑制肿瘤转移的疗效。端粒酶活性在大约90%以上的肿瘤组织内过表达,而在正常组织内无法测出,因其肿瘤特异性强而作为肿瘤标志物被广为应用。在端粒酶亚型中,h TERT决定永生化细胞以及85%以上人类肿瘤细胞的端粒酶活性。因此,h TERT启动子已通过转基因操作而达到肿瘤特异表达的效应。另一方面,Apoptin是鸡贫血病毒的VP3基因表达的产物,对一系列转化或人源性恶性肿瘤包括肝癌,淋巴瘤,胆管癌,黑色素瘤以及乳腺、肺与结肠癌中呈现出特异性与有效性,而对非转化细胞包括成纤维细胞、角质细胞或平滑肌细胞则无促凋亡作用,因此认为,Apoptin是一较特异的肿瘤促凋亡蛋白。目前尚无Ad-Apoptin-h TERT-E1a对结肠癌抑制作用效果的研究,本研究通过系列的体外及体内实验,以检测Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP等重组腺病毒对肿瘤组织的靶向作用,探讨AdApoptin-h TERT-E1a抑制肿瘤生长并促进其凋亡的疗效。实验目的本实验拟研究Ad-Apoptin-h TERT-E1a对结肠癌细胞特异性杀伤作用,并探讨Ad-Apoptin-h TERT-E1a的抑瘤率、对结肠癌细胞的抑制作用方式及其作用机制。实验方法体外实验中,以正常胃粘膜细胞系GES为对照组,重组腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP分别感染人结肠癌细胞SW1116,通过MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式细胞术明确重组腺病毒的靶向作用及抑制作用方式。同时,以Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP不同重组腺病毒为对照组,通过MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式细胞术明确Ad-Apoptin-h TERT-E1a对结肠癌细胞的抑制作用效果。此后,通过Western blot检测及流式细胞仪检测Caspase酶、活性氧（ROS）和线粒体膜电位（MMP）水平,进一步检测抑制效应的相关机制,从分子水平对重组腺病毒的抑瘤途径进行研究。在体内实验中,利用鼠结肠癌CT26细胞分别构建BALB/c小鼠实体荷瘤模型及肺转移荷瘤模型,经皮下注射及尾静脉注射两种方式接种重组腺病毒,通过观察肿瘤生长趋势、不同时间的抑瘤率、生存期探讨Ad-Apoptin-h TERT-E1a的体内抑瘤作用效果。实验结果通过MTT染色、光镜检测、AO/EB染色以及Annexin V染色等检测,结果显示重组腺病毒可不同程度诱导细胞凋亡,其中,Ad-Apoptin-h TERT-E1a对人结肠癌细胞SW1116的诱导凋亡作用最强,而各重组腺病毒均对正常细胞系GES未见明显抑制作用。MTT染色还表明,相对定量分析,Ad-Apoptin-h TERT-E1a对体外培养的SW1116的抑瘤作用呈现出一定的剂量依赖效应以及时间依赖效应。Western blot检测及流式细胞仪检测caspase 3,caspase 6及caspase 7等凋亡执行蛋白的表达水平变化,同时检测此过程中线粒体膜电位、活性氧以及细胞色素酶C的变化。结果表明,在Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116细胞中,Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7凋亡执行蛋白的活性明显增强,并伴有ROS、MMP及Cyto C的变化。结果提示,Ad-Apoptin-h TERT-E1a诱导人结肠癌细胞凋亡的作用机制之一为通过影响线粒体膜电位而启动内源性激活凋亡信号通路,而对正常的胃粘膜细胞GES并产生影响。对两种荷瘤模型的体内治疗实验结果显示,接种Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin等重组腺病毒瘤内注射或血管用药,均可以明显的抑制小鼠体内接种的肿瘤的增殖,并显着地延长小鼠模型的生存期,且未见明显的毒副作用,其中Ad-Apoptin-h TERT-E1a T作用最强。进一步验证了重组溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。结论h TERT启动子调控的表达Apoptin基因的溶瘤腺病毒,即Ad-Apoptin-h TERT-E1a可使大多数SW1116肿瘤细胞表现为凋亡形态,这种诱导凋亡的作用呈现出典型的剂量依赖的特征以及时间依赖特征。Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116细胞中,Caspase-3/6/7凋亡相关蛋白的活性明显增强,线粒体膜电位水平下调,而活性氧水平及Cyto C水平上调,提示Ad-Apoptin-h TERT-E1a可能通过线粒体途径诱导人结直肠癌细胞凋亡、抑制其增殖。Ad-Apoptin-h TERT-E1a的这种诱导肿瘤细胞凋亡的抑瘤作用具有特异的肿瘤细胞靶向性,对正常细胞无诱导凋亡作用。Ad-Apoptin-h TERT-E1a显着地抑制了小鼠体内接种肿瘤的增殖,同时可延长CT26荷瘤小鼠模型的生存时间,而未见明显的毒副反应。综上所述,Ad-Apoptin-h TERT-E1a呈现出应用于抗肿瘤治疗的潜力,可同时应用于原发性与转移性结肠癌的治疗。
李俊[10]（2015）在《调控头颈鳞癌端粒酶miRNAs的研究》文中进行了进一步梳理目的：通过广谱miRNA芯片技术筛查调控端粒酶活性的特异性miRNA。方法：选择端粒酶阳性细胞株人喉鳞癌细胞（Hep-2）,人鼻咽癌细胞（CNE）及端粒酶阴性细胞株人骨肉瘤细胞（U-2 OS）,正常组织细胞人肺上皮细胞（BEAS-2B）,抽提所有细胞总RNA并进行Hy3荧光标记,在miRCURYTM LNAArray（v.11.0）（Exiqon）芯片上进行杂交反应,同时采用实时定量PCR验证miRNAs芯片结果的可靠性。结果：芯片结果显示5种miRNA：hsa-miR-301b,hsa-miR-624,hsa-miR-22,hsa-miR-618,hsa-miR-1267在端粒酶阳性细胞中高表达,7种miRNA：hsa-miR-512-5p, hsa-miR-647, hsa-miR-194, hsa-miR-135a, hsa-miR-621hsa-miR-640,hsa-miR-155在端粒酶阴性细胞中高表达。在所有这些表达差异的miRNA中,miR-512-5P在两类细胞中表达差异最大。结论：miR-512-5P可能参与了肿瘤细胞端粒酶活性的内在调控。目的：探讨miRNA-512-5P调控肿瘤端粒酶可能的机制。方法：通过miRNA数据库寻找miR-512-5p可能的靶基因,构建miR-512-5p质粒并转染肿瘤细胞,观察miR-512-5p对靶基因的抑制作用,并通过荧光素酶方法验证其作用靶点。结果：经多个miRNA数据库交叉分析后,发现miR-512-5p可能的靶基因为端粒酶逆转录酶hTERT,在端粒酶阳性细胞中转染miR-512-5p质粒后,hTERT蛋白表达量明显下降,同时荧光素酶检测发现荧光素酶活性下降明显,揭示了miR-512-5p对hTERT的直接靶向和抑制作用。结论：miR-512-5p通过直接靶向抑制hTERT蛋白的表达从而抑制端粒酶活性。目的：探讨miR-512-5p对头颈部鳞癌细胞的抑制作用。方法：将miR-512-5p质粒转染肿瘤细胞后,观察肿瘤细胞端粒酶、端粒长度的改变,细胞凋亡以及细胞增殖的的变化情况。同时建立裸鼠荷瘤模型,在体内水平验证miR-512-5p对肿瘤的抑制作用。结果：miR-512-5p能有效降低端粒酶的活性、缩短端粒长度,同时促进肿瘤细胞凋亡发生率增加,体外实验结果证实导入miR-512-5p后瘤细胞增殖明显受限。同时裸鼠移植瘤体内实验也证实了miR-512-5p可以明显减慢肿瘤的生长速度和瘤内hTERT蛋白的表达。结论：miR-512-5p在体内或者体外均能抑制头颈部肿瘤的增殖,其作用机制可能与靶向抑制hTERT蛋白的表达导致端粒酶活性下降、端粒长度缩短和细胞凋亡增加有关。
二、hTERT的结构功能特点与应用前景（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、hTERT的结构功能特点与应用前景（论文提纲范文）
（1）沉默hTERT通过抑制肿瘤干细胞样特性增强鼻咽癌细胞株CNE-2R放射敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R的肿瘤干细胞样特性及端粒酶活性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第二部分 慢病毒介导稳定沉默hTERT的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R的构建及鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第三部分 沉默hTERT对鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R的肿瘤干细胞样特性及放射敏感性的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第四部分 Wnt/β-catenin信号通路在hTERT调节CNE-2R细胞肿瘤干细胞样特性及放射敏感性中的作用及机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 主要英文缩写及中英文对照表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）BDNF高表达永生化间充质干细胞细胞系的建立、分选及鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验场地及细胞 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 实验试剂的制备 |
| 2.5 实验方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 构建hTERT质粒 |
| 3.2 筛选传代细胞中高表达BDNF细胞亚群 |
| 3.3 质粒共转染 |
| 3.4 ELISA测转染组与未转染组各个MSC细胞系BDNF浓度 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）miR-1182通过靶向hTERT抑制卵巢癌的转移和增殖（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分: miR-1182在卵巢癌组织、细胞中的表达情况及其意义 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分: miR-1182在卵巢癌组织、细胞中靶基因的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三部分: 卵巢癌细胞中miR-1182和靶基因hTERT的相关性 |
| 1 前言 |
| 2 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第四部分: miR-1182抑制卵巢癌细胞的增殖和转移 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文和其他相关成果 |
| 致谢 |
（4）E1A基因修饰的间充质干细胞介导的CD3-HAC阻断PD-1/PD-L1对转移性乳腺癌的免疫治疗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 致谢 |
（5）基于金属纳米颗粒的肿瘤诊疗新方法研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1. 肿瘤的诊断和治疗现状 |
| 2. 纳米材料用于肿瘤诊断、治疗的研究 |
| 3. 本论文主要研究内容 |
| 参考文献 |
| 第一章 基于金纳米颗粒的端粒酶检测新方法研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于液态金属纳米颗粒的肿瘤细胞内mRNA检测新方法研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于适体/蛋白酶修饰的金纳米颗粒用于肿瘤治疗的新方法研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1. 核酸类肿瘤标志物的检测 |
| 2. 蛋白质类肿瘤标志物的检测 |
| 3. 肿瘤细胞的检测 |
| 4. 肿瘤成像 |
| 参考文献 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（6）人端粒酶逆转录酶基因修饰的内皮祖细胞改善糖尿病大鼠的勃起功能及机制研究（论文提纲范文）
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 人端粒酶逆转录酶基因重组慢病毒载体的构建及鉴定 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人端粒酶逆转录酶基因修饰大鼠内皮祖细胞 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 EPCs-hTERT对糖尿病ED大鼠勃起功能的作用及机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）H3N2亚型犬流感病毒保护性单抗的制备及宿主microRNA对病毒复制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 犬流感病毒的研究进展 |
| 1 犬流感病毒致病性研究 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 流感病毒对犬类的适应性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 犬流感的临床症状 |
| 1.5 犬流感病毒的跨宿主传播 |
| 1.6 犬流感的诊断 |
| 1.7 犬流感的治疗 |
| 1.8 犬流感的预防和控制 |
| 2 犬流感病毒宿主模型的研究 |
| 2.1 动物模型 |
| 2.2 宿主细胞模型 |
| 3 MicroRNA在宿主与病毒互作中的研究 |
| 3.1 MiRNA的作用机制 |
| 3.2 MiRNA在病毒感染过程中的调节作用机制 |
| 3.3 MiRNA作为抗病毒治疗靶标影响病毒复制 |
| 4 研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 H3N2亚型犬流感病毒单克隆抗体的制备及其特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞及实验动物 |
| 1.2 培养基及主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 抗原的制备 |
| 1.5 免疫小鼠 |
| 1.6 ELISA检测方法的建立 |
| 1.7 细胞融合 |
| 1.8 杂交瘤细胞的抗体检测 |
| 1.9 阳性杂交瘤细胞的亚克隆筛选 |
| 1.10 细胞的冻存与复苏 |
| 1.11 腹水型单克隆抗体的制备及纯化 |
| 1.12 单克隆抗体的鉴定 |
| 1.13 Western blot鉴定单抗所针对的抗原位点 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的扩增及纯化 |
| 2.2 小鼠免疫后的抗体效价 |
| 2.3 抗原抗体最佳包被浓度的确定 |
| 2.4 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 2.6 单克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 单克隆抗体对不同H3N2亚型流感病毒株感染的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物、细胞及毒株 |
| 1.2 培养基、试剂盒及主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 单克隆抗体D7对三株流感病毒毒株的血凝抑制试验及细胞中和试验 |
| 1.5 单抗对3株流感病毒株感染动物的交叉保护试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 单克隆D7针对三株流感病毒株的细胞中和效价和血凝抑制效价结果 |
| 2.2 单抗D7对三株流感病毒株在BALB/c小鼠临床症状和体重变化上的结果 |
| 2.3 小鼠血液、粪便及多种脏器的病毒RNA载量测定结果 |
| 2.4 小鼠肺、心和脑组织病理组织学结果和免疫组化结果 |
| 2.5 小鼠肺脏组织细胞因子检测结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 永生化犬细支气管上皮细胞系的建立及其特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物、质粒及实验器械 |
| 1.2 主要试剂、仪器和设备 |
| 1.3 犬细支气管组织的分离 |
| 1.4 原代犬细支气管上皮细胞的培养 |
| 1.5 真核表达载体pEGFP-hTERT的构建 |
| 1.6 永生化犬细支气管上皮细胞的制备 |
| 1.7 原代细胞的特性鉴定 |
| 1.8 细胞增长曲线的测定 |
| 1.9 细胞周期的分析 |
| 1.10 逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 1.11 Western blot检测 |
| 1.12 端粒酶活性检测 |
| 1.13 细胞核型分析 |
| 1.14 QRT-PCR检测相关基因的表达水平 |
| 1.15 软琼脂试验和裸鼠致瘤性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 犬原代细支气管上皮细胞的培养和特性分析结果 |
| 2.2 真核表达载体pEGFP-hTERT的酶切鉴定 |
| 2.3 永生化细胞hTERT-CBECs的鉴定 |
| 2.4 永生化细胞hTERT-CBECs的增殖能力检测结果 |
| 2.5 不同代次的永生化细胞hTERT-CBECs的特性分析结果 |
| 2.6 永生化细胞hTERT-CBECs和原代细胞CBECs的基因表达水平分析结果 |
| 2.7 永生化细胞hTERT-CBECs没有在体内或在体外表现出致瘤性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 CIV感染犬原代细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的microRNA表达谱分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂、仪器和设备 |
| 1.3 原代犬细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的制备 |
| 1.4 感染比和感染时间点的确定 |
| 1.5 流式细胞术定量检测细胞凋亡 |
| 1.6 Small RNA测序和miRNA基因芯片测序 |
| 1.7 差异表达miRNA的实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 原代犬细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的制备 |
| 2.2 感染比和感染时间的确定 |
| 2.3 原代犬细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的凋亡情况 |
| 2.4 细胞总RNA的提取及质控检测 |
| 2.5 Small RNA测序和miRNA测序的分析结果 |
| 2.6 差异表达miRNA所对应靶基因的功能分析 |
| 2.7 差异表达miRNA的qRT-PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 宿主细胞microRNA对H3N2亚型犬流感病毒复制的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、载体、病毒和抗体 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 慢病毒载体和腺病毒载体的构建 |
| 1.4 慢病毒和腺病毒的包装及扩大培养 |
| 1.5 稳定细胞系的建立 |
| 1.6 病毒滴度的测定 |
| 1.7 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测目的基因 |
| 1.8 Western blot检测目的蛋白 |
| 2 结果 |
| 2.1 慢病毒载体和腺病毒载体的构建 |
| 2.2 慢病毒载体对hTERT-CBECs和DH82细胞的感染效率 |
| 2.3 稳定细胞系的建立 |
| 2.4 病毒滴度的测定结果 |
| 2.5 QRT-PCR的检测结果 |
| 2.6 Western blot的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 博士期间发表的论文 |
| 博士期间申请的国家发明专利 |
| 致谢 |
（8）人端粒酶（hTERT）表达促进剂的筛选及其抗衰老活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 端粒 |
| 1.1.1 端粒概述 |
| 1.1.2 端粒长度的测定方法 |
| 1.1.3 端粒酶的组成及作用 |
| 1.2 衰老 |
| 1.2.1 衰老概述 |
| 1.2.2 衰老的特征 |
| 1.2.3 衰老的研究方法 |
| 1.2.4 抗衰老药物的分类 |
| 1.3 端粒、端粒酶与衰老的关系 |
| 1.3.1 端粒与衰老的关系 |
| 1.3.2 端粒酶与衰老的关系 |
| 1.4 端粒、端粒酶与肿瘤的关系 |
| 1.5 本课题的研究内容和研究意义 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 小分子化合物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要溶液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 质粒转化 |
| 2.2.4 质粒的提取 |
| 2.2.5 质粒的转染 |
| 2.2.6 荧光素酶报告实验 |
| 2.2.7 蛋白免疫印记技术 |
| 2.2.8 端粒长度检测 |
| 2.2.9 细胞增殖检测方法 |
| 2.2.10 细胞划痕实验 |
| 2.2.11 细胞周期检测 |
| 2.2.12 β-gal染色 |
| 2.2.13 DNA Ladder |
| 2.2.14 总RNA的提取 |
| 2.2.15 RNA反转录成cDNA |
| 2.2.16 RT-PCR |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 从小分子化合物库中筛选人端粒酶转录促进剂 |
| 3.1.1 人端粒酶转录促进剂(hTERT)的初步筛选 |
| 3.1.2 hTERT小分子表达促进剂的验证 |
| 3.1.3 hTERT小分子表达促进剂对细胞衰老的影响 |
| 3.2 外界环境因子对hTERT启动子活性的影响及其抗衰老活性的研究 |
| 3.2.1 外界环境因子对hTERT启动子活性的影响 |
| 3.2.2 咖啡因、乙酸、乙酸乙酯促进hTERT启动子活性的验证 |
| 3.2.3 咖啡因、乙酸、乙酸乙酯抗衰老活性研究 |
| 3.3 hTERT小分子促进剂抗衰老机制的研究 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（9）重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERT-E1a对结肠癌抑制作用的实验研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 转移性结直肠癌临床治疗进展 |
| 2.1.1 转移性结直肠癌靶向治疗进展 |
| 2.1.2 CRC腹膜种植转移研究进展 |
| 2.1.3 转移性CRC的治疗指南系统回顾 |
| 2.2 溶瘤病毒研究进展 |
| 2.2.1 临床应用进展 |
| 2.2.2 最小化肝脾对溶瘤病毒的隔离作用 |
| 2.2.3 逃避血清因子的中和作用 |
| 2.2.4 选择性地增强肿瘤血管通透性 |
| 2.2.5 靶向于肿瘤血管内皮的病毒 |
| 2.2.6 增强溶瘤病毒在肿瘤内的扩散 |
| 2.2.7 通过基因重组修饰技术或者化学增敏剂的作用促进病毒增殖 |
| 2.2.8 增强病毒在肿瘤内的扩散: |
| 2.2.9 肿瘤特异选择溶瘤病毒的结构 |
| 2.2.10 控制适应性免疫反应同时清除溶瘤病毒: |
| 2.2.11 增强抗肿瘤免疫力 |
| 2.2.12 溶瘤病毒适应征 |
| 2.2.13 溶瘤病毒介导免疫治疗的机制 |
| 2.2.14 腺病毒的临床应用前景与挑战 |
| 2.2.15 病毒临床试验的相关因素 |
| 2.2.16 其它相关因素 |
| 第3章 研究内容 |
| 3.1 重组腺病毒的制备及对结肠癌细胞SW1116的抑制作用 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 实验结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 重组腺病毒对结肠癌细胞SW1116的抑制方式 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.2.3 讨论 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 重组腺病毒对结肠癌细胞SW1116的抑制途径 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.3.3 讨论 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 重组腺病毒的体内抑瘤作用研究 |
| 3.4.1 材料与方法 |
| 3.4.2 结果 |
| 3.4.3 讨论 |
| 3.4.4 小结 |
| 第4章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）调控头颈鳞癌端粒酶miRNAs的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英汉缩略名词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 调控端粒酶miRNAs的筛选及验证 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 第二部分 miR-512-5P调控端粒酶作用机制的研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 第三部分 miR-512-5p对头颈鳞癌细胞抑制作用研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表文章情况 |
| 致谢 |
四、hTERT的结构功能特点与应用前景（论文参考文献）
- [1]沉默hTERT通过抑制肿瘤干细胞样特性增强鼻咽癌细胞株CNE-2R放射敏感性的机制研究[D]. 陈凯华. 广西医科大学, 2019(08)
- [2]BDNF高表达永生化间充质干细胞细胞系的建立、分选及鉴定[D]. 蒋喆. 南华大学, 2019(01)
- [3]miR-1182通过靶向hTERT抑制卵巢癌的转移和增殖[D]. 侯小赛. 武汉大学, 2018(01)
- [4]E1A基因修饰的间充质干细胞介导的CD3-HAC阻断PD-1/PD-L1对转移性乳腺癌的免疫治疗研究[D]. 杨圆圆. 北京协和医学院, 2018(02)
- [5]基于金属纳米颗粒的肿瘤诊疗新方法研究[D]. 杨育才. 南京医科大学, 2017(05)
- [6]人端粒酶逆转录酶基因修饰的内皮祖细胞改善糖尿病大鼠的勃起功能及机制研究[D]. 张岩. 华中科技大学, 2016(08)
- [7]H3N2亚型犬流感病毒保护性单抗的制备及宿主microRNA对病毒复制的影响[D]. 谢星. 南京农业大学, 2016(12)
- [8]人端粒酶（hTERT）表达促进剂的筛选及其抗衰老活性研究[D]. 牛星. 天津科技大学, 2016(05)
- [9]重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERT-E1a对结肠癌抑制作用的实验研究[D]. 杨国华. 吉林大学, 2015(06)
- [10]调控头颈鳞癌端粒酶miRNAs的研究[D]. 李俊. 武汉大学, 2015(03)