一、抑制小鼠胚胎细胞NOR活性对胚胎器官发育的影响（论文文献综述）
程小翠[1]（2021）在《高糖对小鼠胚胎心脏发育的影响及Plagl1表达分析》文中研究表明目的:高浓度葡萄糖对小鼠生长发育产生不利影响,包括糖尿病、血管和神经畸形、先天性疾病。因为葡萄糖在体内代谢途径复杂,所以对机体造成的影响也是多方面的。之前研究多围绕高血糖对小鼠整体发育的不利影响,很少聚焦靶器官。本研究主要探究高血糖（27.5 m M）对小鼠胚胎心脏发育的影响,包括表型改变和机制探索。通过对体外培养胚胎和13.5 d胚胎模型的研究,旨在阐述在高浓度葡萄糖（27.5 m M）条件下,小鼠胚胎的心脏会发生怎样的变化和可能的作用机制。方法:使用体外受精（IVF）和胚胎体外培养,设置不同葡萄糖浓度,观察小鼠早期胚胎发育情况,包括各时期发育率以及囊胚期关键基因的表达。由于在胚胎上实现对基因的敲降和过表达比较困难,本实验选择在细胞水平上,通过对小鼠卵巢颗粒细胞（GRM02）中目标基因的敲降和过表达,研究高血糖（27.5 m M）对小鼠胚胎心脏发育表型和作用机制的影响。使用体式显微镜,通过体外培养、免疫荧光、q RT-PCR等实验方法检测小鼠胚胎植入前阶段各时期发育情况和相关基因的表达;通过小鼠13.5d基因组DNA/RNA抽提、亚硫酸氢盐测定（BSP）、免疫组化等方法检测高糖对13.5d小鼠胚胎关键基因表达、Plagl1启动子区甲基化水平和心脏表型的影响;通过对细胞GRM02的免疫荧光和Plakoglobin敲降,检测敲降后相关基因的表达情况。结果:小鼠植入前胚胎发育的研究显示,在高糖（27.5 m M）条件下,小鼠早期胚胎发育受到明显抑制,主要体现在囊胚率显着降低以及相关基因的表达发生改变,在高糖条件下,小鼠植入前胚胎中GATA4、Tbx2的表达显着上升。移植后的胚胎发育到13.5 d后进行体外研究,结果显示,高糖组的胚胎更难着床,且发育到13.5 d时畸形的发生率更高;与对照组相比,在高糖条件下,13.5 d胚胎中Plagl1和Plakoglobin表达量都呈升高趋势,心脏发育相关基因GATA4、Tbx2也呈差异性表达;与对照组相比,高糖胚胎的Plagl1启动子区呈高甲基化。利用STZ诱导的高糖小鼠模型,正常合笼后可产生新生儿小鼠,但此类新生儿小鼠心脏经HE染色后与正常新生儿心脏相比呈现明显畸形。对GRM02细胞中的Plakoglobin进行敲降后,Plagl1的表达量同步下降;而使细胞中的Plakoglobin过表达后,Plagl1的表达量显着升高。结论:本研究显示在胚胎的植入前和子宫内阶段的发育中,高糖（27.5 m M）都会对小鼠胚胎和心脏发育产生显着性影响。高糖能使母源印记基因Plagl1的表达量升高,并且,其可能的上游基因Plakoglobin也呈现相同的变化趋势。由于这两个基因都在胚胎心脏的发育中也扮演着重要的角色,因此,本研究提示plagkoglobin对plagl1的表达调节可能在高糖影响小鼠胚胎心脏发育中发挥了关键的作用。
张芬芬[2]（2021）在《甘草苷对酒精损伤小鼠胚胎的修复作用研究》文中提出自古以来,酒都是人们交往中非常重要的媒介,随着酿酒技术的优化,各种酒精制品饮料层出不穷,特别是在我国,酒文化已经渗透到人类生产生活等各个领域,各个地区也有各自特色的酒制品。酒不仅是一种文化的载体更成为人们用来释放压力和情绪的方式,很多人嗜酒成性,长期下来导致各种疾病的发生。随着社会发展,女性饮酒人数逐年升高,多个研究表明,女性妊娠期酒精暴露,会对胚胎造成多方位的损伤,孕妇饮酒后,增加了胚胎发育异常的比率,对于植入前胚胎及出生后的胎儿都造成了长远的不利影响。因此如何修复酒精所带来的胚胎损伤成为重要问题。而中药作为保胎多用复方汤药,单一活性成分的研究还较少,本研究拟通过中药药理学的方法来研究甘草的单一活性成分“甘草苷”对酒精损伤小鼠胚胎的修复作用。本研究利用体外受精的方法建立体外培养体系,在培养基中添加酒精,植入前胚胎暴露于1.0%酒精的培养基中,分析酒精在培养基中对小鼠胚胎发育的直接影响。通过添加100μmol/L甘草苷探究其是否对胚胎具有修复作用。实验分为五组:对照组、DMSO组、酒精/DMSO组、酒精/甘草苷/DMSO组和甘草苷/DMSO组。通过观察各组胚胎各时期的发育情况、统计囊胚发育率、检测胚胎发育过程中重要基因的表达和增殖情况等方法,研究植入前酒精处理及酒精处理后添加甘草苷这种条件下,植入前胚胎发育情况、植入后胚胎发育至13.5天时期胎儿的胎盘发育状况。以此来探究分析甘草苷对酒精损伤小鼠胚胎的修复作用及修复胎盘受损的可能性。研究结果表明,植入前胚胎的酒精暴露导致胚胎发育缓慢,囊胚发育率显着降低,胚胎细胞数量显着减少、增殖率下降,且植入前胚胎的酒精暴露导致Cdx2与Oct4的相互作用遭到破坏,表达失衡,导致后期胚胎发育过程出现异常,Caspase-3的表达量显着上升。而酒精处理后添加甘草苷能够恢复胚胎发育速度,显着提高囊胚发育率,提高植入前胚胎细胞数量及增殖能力。同时异常的Cdx2和Oct4表达失衡能够得到一定的恢复且能够在一定程度上抑制由酒精引起的胚胎损伤凋亡。同时植入前胚胎的酒精暴露也会导致植入后胚胎的着床率下降或者不着床,胎盘迷宫区绒毛数量减少,胎儿血管和母体血窦、管腔变小及血量变少。酒精处理后添加甘草苷能够修复胚胎质量,在一定程度上可以改善迷宫区绒毛数量的丰富度,改善由酒精引起的胎儿血管和母体血窦、管腔变小及血量变少情况。综上,甘草苷对修复胚胎酒精损伤方面具有重要作用,表现在可提高植入前胚胎的发育速度、提高囊胚发育率、促进胚胎细胞增殖、稳定胚胎发育重要基因的表达以及植入后提高着床率、改善胎盘重要血管相关损伤等多个方面。
张恩瑜[3]（2021）在《LncRNA AU016765在小鼠早期胚胎发育中的作用研究》文中研究指明植入前早期胚胎需要经过重编程,消除亲本印记,使胚胎建立起属于自己的基因表达模式。在胚胎重编程过程中,组蛋白修饰和DNA甲基化研究比较深入,非编码RNA的调控研究有待进一步深入。而随着单细胞转录组测序的应用,为lnc RNA在胚胎发育上的研究奠定了基础。本研究基于前期单细胞转录组测序结果,筛选得到可能对植入前早期胚胎发育具有重要作用的AU016765,为进一步揭示植入前早期胚胎发育的调控机制提供基础研究。本项研究以C57BL/6J和DBA2体外受精获得的BDF1胚胎作为研究对象,通过将小干扰RNA注入BDF1受精卵中,建立AU016765敲低模型,体外培养胚胎。对敲低胚胎进行研究,通过观察植入前早期胚胎的表型,通过定量PCR、RNA FISH、免疫荧光检测胚胎发育过程中的各项指标,初步研究AU016765在早期胚胎发育过程中的作用,为早期胚胎发育的调控机制奠定基础。本研究结果显示:1.通过对单细胞转录组测序结果进行分析,筛选得到AU016765,运用RT-q PCR和FISH发现其在胞质中存在,并在卵裂球中瞬时不对称分布,表达水平在不断降低,可能参与合子基因组激活。2.在2,4细胞期AU016765的表达变化导致合子基因组激活相关基因表达水平异常。AU016765敲低组中Dppa2、Zscan4基因表达水平下调,Dppa2蛋白表达水平并未发生变化。表明AU016765不通过Dppa2/4的调节网络机制,可能通过其他途径调控Zscan4,从而参与合子基因组激活。3.与阴性对照相比,AU016765被敲低后,抑制4细胞期胚胎转录活性,导致4细胞期不同卵裂球产生特异性基因表达模式,暗示其可能对不同卵裂球命运决定和分化潜能产生影响。4.在2,4细胞期,AU016765表达发生变化,对囊胚发育相关基因的表达并没有影响,但Oct4蛋白表达水平在4细胞前期时表达水平高表达;Sox17的蛋白表达水平在2细胞和4细胞后期时表达水平下将。且敲低AU016765以后胚胎仍能发育到囊胚期,Nanog、Sox17、Cdx2、Oct4的表达未受影响,但Oct4蛋白表达水平却显着提高。这表明AU016765在胚胎发育过程中主要调控Oct4的表达。5.敲低AU016765降低胚胎着床率并致使胎儿出现一定机率畸形。综上所述,AU016765在植入前早期胚胎中特定的时空表达,对植入前胚胎发育具有重要的作用。AU016765并未通过Dppa2/4调控网络途径,可能通过其他方式调控Zscan4的表达,参与合子基因组激活。AU01676通过调控Oct4和Dppa2蛋白表达,前期AU016765的表达变化影响植入前胚胎分子水平变化,从而影响植入后胚胎发育。
张胜男[4]（2021）在《Toe1基因在小鼠植入前胚胎发育中的生物学功能及机制研究》文中提出早期胚胎发育阻滞是体细胞克隆、辅助生殖和动物胚胎工程中普遍存在的问题,解析发育阻滞的原因及其机制对于提高成功率具有十分重要的意义。为此,我们对不同供体来源的小鼠克隆胚胎进行了转录组分析,并筛选到了差异表达基因Toe1。Toe1编码非经典的去腺苷酶,参与端粒酶RNA组分Terc poly（A）尾巴的修剪,其双等位基因突变可导致7型脑桥小脑发育不全。然而,Toe1在早期胚胎发育中是否具有重要功能尚无研究报道。本项目研究Toe1在小鼠植入前胚胎发育中的生物学功能及其机制。本论文主要采用RNAi技术进行在小鼠受精卵内注射Toe1基因小干扰RNA（si RNA）以得到Toe1敲低的胚胎,并在体外培养发现胚胎发育到囊胚初期似乎发育延迟,细胞孵化实验结果显示敲低组囊胚不能突破透明带及顺利孵化。敲低组与实验组的囊胚期卵裂球计数、细胞增殖实验、p21（细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A）的差异表达显示胚胎内Toe1基因敲低会影响胚胎的细胞分裂;凋亡基因Trp53 m RNA、TUNEL凋亡检测及DNA损伤的标记产物γ-H2AX荧光信号共同说明Toe1敲低组的胚胎在囊胚阶段增加细胞凋亡;内细胞团标记蛋白OCT4、滋养外胚层标记蛋白CDX2的免疫荧光结果提示Toe1敲低组的谱系标记蛋白表达均显着性降低,结果表明Toe1会影响到囊胚的谱系分化。本论文从细胞分裂与分化的角度分析Toe1对小鼠早期胚胎发育的影响,得出结论:Toe1通过细胞增殖、细胞凋亡、谱系分化影响小鼠植入前胚胎发育;Toe1对细胞增殖、细胞凋亡的调控很可能是由于DNA损伤介导的。实验结果证明Toe1基因是小鼠早期胚胎发育所必需的。
张圆圆[5]（2021）在《牛EPSCs建立及TFAP2C基因打靶和过表达的研究》文中进行了进一步梳理扩展多能干细胞（extended pluripotent stem cells,EPSCs）是一种新型的多能干细胞,已经在小鼠、人和猪中获得,并可以通过形成嵌合体的方式分化为胚胎和胚外组织。但牛的EPSCs能否生成及其嵌合能力仍不清楚。本研究利用LCDM培养体系,将牛的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）转化为EPSCs,并检测这种细胞的多能性和异种嵌合能力。结果显示,EPSCs在LCDM培养液中,保持紧密的克隆状态,且碱性磷酸酶呈阳性。QPCR检测显示,与iPSCs相比,初始态（Na?ve）多能基因OCT4、NANOG、REX1、FGF4、KLF5和始发态（Primed）标记基因DNMT3B在EPSCs上调,而TBX3和MEIS1下调。免疫荧光染色显示,EPSCs表达OCT4、SOX2和NANOG,其中一部分细胞表达2-细胞期胚胎相关蛋白DPPA2和DPPA4。体外分化实验证明牛EPSCs具备分化为三胚层的能力。在嵌合能力的检测中,发现单个细胞即可嵌合到早期胚胎的内细胞团和滋养层,多细胞注射不仅可以嵌合到内细胞团和滋养层,还可嵌合到E6.5胚胎的胚胎外胚层和脏壁内胚层,E9.5的胎盘、卵黄囊和胎儿,以及E13.5的胎盘、卵黄囊和胎儿的多种组织。以上结果说明,LCDM培养体系支持牛EPSCs的建立。TFAP2C基因在人和小鼠原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）形成过程的复杂调控网络中,起着承上启下的重要作用,作为报告基因广泛地用于筛选人和小鼠的PGCs。为了获得用来特异性筛选牛PGCs的报告系统,依据牛的Rosa26基因序列设计了一段sg RNA,引导CRISPR/Cas9蛋白的发挥其切割作用。并将sg RNA连接到CRISPR/Cas9载体上。在切割位点上下游各选择1kb左右同源臂,利用PCR扩增后,与牛TFAP2C启动子区域分别连接到p Klrkt载体上,并命名为pGTlrkt。将CRISPR/Cas9和打靶载体同时转染牛EPSCs,经G418筛选,共获得29个单克隆细胞系,长片段PCR检测结果显示未获得打靶成功细胞系。为了探究TFAP2C过表达对牛EPSCs形成PGCs的影响,我们扩增了其c DNA,并连接到Piggy Bac转座子载体。将这个载体转入EPSCs后,TFAP2C基因的表达水平显着提高,而多能性基因和生殖谱系相关基因均出现不同程度的降低。综上所述,本研究发现,LCDM培养液有助于牛EPSCs的建立,并能维持其多能性,牛EPSCs在小鼠胚胎有较强的嵌合能力。同时设计并构建了pGTlrkt-TFAP2C打靶载体和TFAP2C过表达载体,并获得了TFAP2C过表达的细胞系,为牛EPSCs基因编辑和向生殖细胞分化研究奠定了基础。
奚婷[6]（2021）在《培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究》文中研究说明目的1 探究培元补肾安胎方治疗黄体功能不足（LPD）型复发性流产（RSA）的临床疗效和安全性。2 通过网络药理学和分子对接学探讨培元补肾安胎方治疗RSA的作用机制。3 探究孕酮诱导“种植窗期”子宫内膜急性衰老对胚胎着床的影响。4 以“种植窗期”子宫内膜急性衰老为切入点,探究培元补肾安胎方治疗RSA的分子机制,并对上述网络药理学预测机制进行验证。方法1 采用临床随机对照研究方法,收集脾肾两虚型LPD型RSA患者60例,随机分为两组:治疗组30例和对照组30例。治疗组予培元补肾安胎方和西药地屈孕酮片治疗,对照组予西药地屈孕酮片治疗。观察对比两组患者的一般情况、孕12周妊娠结局、治疗前后中医证候积分、血清E2、P和β-HCG、盆腔B超,及治疗前后肝肾功、血常规等安全性指标。2 采用网络药理学方法对培元补肾安胎方治疗RSA的作用机制进行分析,并运用分子对接学对结果进行初步验证,具体方法如下:通过检索TCM、TCMSP数据库得到培元补肾安胎方的化合物;通过TCMSP、Pubchem、CHEMBL得到化合物对应的靶点;利用Genecards和OMIM数据库收集RSA相关基因;利用R语言得到培元补肾安胎方治疗RSA的潜在靶点;string数据库构建PPI网络图;应用clusterProfiler包对共同靶点完成GO和KEGG富集分析;最后采用MOE软件分子对接评估培元补肾安胎方重要活性成分与关键靶点的结合活性。3 采用体内和体外实验相结合方法,体内实验:将ICR雌鼠随机分为PD0-PD9组、除衰组、对照组①、米非司酮（RU486）组、对照组②。PD0-PD9组分别于PD0-9天下午取材,除衰组、对照组①、RU486组、对照组②分别于PD5和PD9下午取材,观察对比胚胎着床数目,应用SA-β-gal染色、IHC、WB检测子宫内膜组织衰老标志物（SA-β-gal活性、P16蛋白）的表达。体外实验:不同浓度、时间点的甲羟孕酮（MPA）对2BS细胞进行干预,应用WB检测各组2BS衰老标志蛋白P53、P21、P16表达量,SA-β-gal染色检测2BS SA-β-al活性,光学显微镜观察2BS形态的改变,EdU检测2BS增殖功能,RT-PCR检测2BS SASP、PRL mRNA表达量。收集MPA诱导2BS的衰老上清液与HTR-8/SVneo共培养,应用CCK8、EdU、划痕及Transwell实验分别检测HTR-8/SVneo的增殖、迁移和侵袭功能。4采用Clark经典复发性流产模型鼠造模方法造模,将CBA/J雌鼠随机分为12组。正常组B、模型组B、西药组B、中药低剂量组B、中药中剂量组B、中药高剂量组B在PD14取材计算胚胎丢失率;正常组A、模型组A、西药组A、中药低剂量组A、中药中剂量组A、中药高剂量组A在PD5下午取材,应用HE染色观察小鼠卵巢黄体面积,Elisa检测血清P水平,SA-β-gal染色检测内膜的SA-β-gal活性,WB和RT-PCR检测子宫内膜P16、P53、P21蛋白和mRNA表达,IHC检测子宫P16蛋白定位分布及表达。结果1培元补肾安胎方对LPD型RSA临床疗效1.1保胎结局:治疗组保胎成功率93.33%高于对照组70%（p<0.05）。1.2中医证候疗效:治疗组总有效率96.67%高于对照组60.00%（p<0.01）。1.3中医证候积分:治疗后两组患者脾肾两虚型中医证候总积分均明显低于治疗前（p<0.01）。治疗组改善LPD型RSA患者脾肾两虚型证候优于对照组（p<0.05）。1.4止血时间:治疗组平均止血时间4.29±0.46天短于对照组6.48±0.54天（p<0.05）。1.5腹痛消失时间:治疗组平均腹痛消失时间5.48±0.35天短于对照组8.63±0.84天（p<0.05）。1.6血清激素水平:治疗组在孕9、11、12周血清E2值高于对照组（p<0.05）;治疗组孕6、7、9、11、12周血清P值高于对照组（p<0.05）;治疗组孕8、9、10、11、12周血清β-HCG值高于对照组（p<0.01）。1.7 B超检查:治疗组胚胎发育与孕周相符22例,小于孕周6例,胎停育2例;对照组胚胎发育与孕周相符14例,小于孕周7例,停育9例。1.8不良反应:治疗组肝功异常1例,对照组肝功异常3例、皮疹1例,两组在安全性方面无差异（p>0.05）。2网络药理学和分子对接探讨培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制2.1培元补肾安胎方潜在化合物及作用靶点:潜在化合物186个,作用靶点136个。2.2 RSA疾病靶点:经过筛选去重共得到RSA靶点1658个。2.3共同靶点筛选及互作网络构建:共同靶标65个,潜在靶点分别至少与两个化合物相连接。2.4 PPI网络的构建和关键靶点的提取:PPI网络中有65个节点,其中VEGFA、IL6、EGFR、MPAK8、ESR1等是关键靶点。2.5 GO和KEGG富集:GO主要涉及转录因子活性、单加氧酶活性等。KEGG主要涉及 PI3K-Akt、MPAK、P53 等。2.6分子对接:核心化合物和潜在靶点分子对接得分均≤-5.0 kcal/mol。3孕酮诱导“种植窗期”内膜细胞衰老在胚胎着床中的作用研究3.1“种植窗期”内膜存在急性衰老的生理表现:IHC结果显示,P16蛋白在子宫内膜间质成纤维细胞、上皮细胞胞核呈阳性表达,PD0-PD5组随着怀孕天数的增加P16蛋白表达量逐渐增多,于PD5达到最大值,PD6-PD9组P16表达量逐渐减少。WB和β-gal染色也得出相同结果。3.2“种植窗期”内膜衰老有利于胚胎着床:清除衰老细胞后胚胎着床数目、SA-β-gal活性、内膜P16蛋白表达量少于对照组（p<0.01）。3.3孕酮可诱导成纤维细胞衰老:与空白组相比,各组MPA干预后2BS细胞SA-β-gal活性和衰老标志蛋白P16、P21、P53表达量增多（p<0.01）,细胞形态不规则、细胞核增大,其中MPA（8μM）作用16天,各指标变化显着（p<0.01）。EDU结果显示MPA干预后2BS增殖减慢（;p<0.01）。RT-PCR实验结果显示,MPA组CXCL-2、CXCL-1 等 SASP、PRL mRNA 表达高于空白组（p<0.01）。3.4孕酮诱导细胞衰老是胚胎着床的重要条件:RU486阻断孕酮作用后胚胎着床数目、内膜P16蛋白表达量及SA-β-gal活性小于对照组（p<0.01）。3.5孕酮诱导形成的衰老微环境有利于滋养细胞功能:Senescent CM共培养的HTR-8/SVneo细胞水平和垂直迁移、侵袭功能强于Young CM组（p<0.01）。4基于“种植窗期”内膜衰老探讨培元补肾安胎方治疗RSA的作用研究4.1胚胎丢失率:模型组胚胎丢失率高于正常组（p<0.01）,提示造模成功。中药各剂量组和西药组均低于模型组（p<0.05）。4.2血清P水平:模型组血清P水平低于正常组（p<0.05）。中药中剂量组和西药组血清P水平高于模型组（p<0.05）。4.3卵巢黄体面积:模型组黄体面积少于正常组（p<0.05）。中药中剂量组和西药组卵巢黄体面积多于模型组（p<0.05）。4.4 SA-β-gal染色:模型组内膜SA-β-gal活性少于正常组（p<0.01）。中药中、高剂量组和西药组内膜组织SA-β-gal活性多于模型组（p<0.01）。4.5内膜组织P16、P53、P21蛋白和mRNA表达:模型组P16、P53、P21蛋白和mRNA表达低于正常组（p<0.05）。中药低、中剂量组、西药组P16、P53、P21蛋白和mRNA表达高于模型组（p<0.05）。4.6免疫组化:P16蛋白在内膜成纤维细胞、上皮细胞的胞核中呈阳性表达,模型组内膜P16蛋白表达量低于正常组（p<0.01）,中药低、中剂量组、西药组内膜P16蛋白表达量高于模型组（p<0.01）。结论1培元补肾安胎方能明显改善脾肾两虚证候,减轻阴道流血、腹痛症状,提高血清E2、P、β-HCG水平,促进胚胎发育,提高LPD型RSA的保胎成功率。2通过网络药理学初步明确培元补肾安胎方治疗RSA的分子机制可能是通过调控P53信号通路,调节细胞衰老,从而治疗RSA。3“种植窗期”内膜急性衰老是胚胎着床的必要条件之一,其中足量足时间的孕酮是诱导内膜衰老的重要因素。4 P不足、“种植窗期”内膜急性衰老不足可能是LPD型RSA发病机制。培元补肾安胎方可能通过提高血清P和卵巢黄体面积,增加“种植窗期”内膜P53、P21、P16表达,促进“种植窗期”内膜衰老从而发挥保胎作用。
张恒业[7]（2021）在《丙酮酸对小鼠植入前胚胎母源mRNA降解的影响及机制初步研究》文中研究表明能量是植入前胚胎发育所需的最基本营养元素,能量失衡会导致胚胎发育阻滞,其主要原因可能在于能量失衡会导致母源向合子转换（MZT）过程的障碍甚至失败。而母源mRNA有序的阶段依赖性降解是确保MZT顺利进行的前提。考虑到能量失衡与母源mRNA降解异常都会导致植入前胚胎发育阻滞,可合理推测能量失衡可能干扰母源mRNA降解进程,但该假说目前还没有得到证实。因此,本研究以小鼠植入前胚胎为研究对象,初步探讨KSOM培养液中能量底物丙酮酸对小鼠植入前胚胎母源mRNA降解的影响及机制,主要的研究内容及结果如下:实验一:丙酮酸对小鼠植入前胚胎母源mRNA降解的影响为了探究丙酮酸对小鼠植入前胚胎母源mRNA降解的影响,首先采用不同丙酮酸浓度的KSOM培养液进行胚胎培养,发现低浓度丙酮酸（正常的0.2倍）导致胚胎停滞在2-细胞,同时胚胎线粒体含量、ROS水平下降,说明低浓度丙酮酸降低胚胎代谢活性并造成发育阻滞。通过实时定量RT-PCR检测发现低水平丙酮酸导致母源转录本Zar1、Lrrc17等在2-/4-细胞阶段降解受到抑制。此外,Btg4等调控母源mRNA降解的母源性调控（M-降解）因子转录本水平上调,而Tead4等调控母源mRNA降解的合子性调控（Z-降解）因子转录本水平下调。转录激活标记p S2、p S5的检测结果显示低水平丙酮酸引起胚胎转录活性的下降,说明低水平丙酮酸抑制早期胚胎转录活性。上述研究结果表明低水平丙酮可能通过干扰M-和Z-降解途径抑制母源mRNA的降解导致胚胎发育异常。实验二:丙酮酸对小鼠植入前胚胎表观修饰的影响为了探究能量底物是否通过表观修饰介导植入前胚胎母源mRNA降解,本研究采用免疫荧光染色对2-细胞小鼠胚胎DNA甲基化、组蛋白甲基化、RNA m6A甲基化修饰水平进行检测。结果显示低水平丙酮酸导致2-细胞小鼠胚胎5m C、H3K4me2、H3K9me2、H3K27me2修饰水平下降,而m6A甲基化修饰水平上升。采用实时定量RT-PCR检测上述表观修饰相关基因表达水平,发现低水平丙酮酸导致相关基因表达异常,进一步说明表观修饰受到干扰。上述结果说明低水平丙酮酸导致小鼠植入前胚胎表观修饰异常,可能是丙酮酸介导母源mRNA降解的潜在机制。综上所述,本研究结果揭示了丙酮酸在小鼠植入前胚胎发育中起到保障M-与Z-降解协调参与的母源mRNA有序阶段依赖性降解的作用。并初步阐明丙酮酸可能通过表观修饰介导植入前胚胎母源mRNA降解。本研究结果扩展了目前对植入前胚胎发育能量需要的理解,为优化胚胎体外培养系统提供了实践意义和理论依据。
张倩[8]（2021）在《小鼠雌性胚胎干细胞中DNA甲基化和组蛋白修饰对印记基因Igf2表达的调节研究》文中研究指明Igf2-H19印记基因簇在调控胎儿及胎盘正常生长发育中发挥重要作用。研究表明,DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA参与调节印记的建立、维持和表达调控。本研究通过CRISPR/dCas9技术改变雌性小鼠胚胎干细胞中Igf2-H19基因簇内印记调控区（Imprinting control region,ICR）第三和第四个差异甲基化区域（m3和m4）的DNA甲基化修饰,研究印记基因表达调节中DNA甲基化和组蛋白修饰的协同作用。1.小鼠胚胎干细胞系Igf2-H19位点的DNA甲基化小鼠囊胚内细胞团在2i/L培养体系中培养后分离建立9株mESCs,获得的mESC系克隆形态呈“dome”状,碱性磷酸酶染色阳性,染色体数目正常;细胞表达多能性基因Nanog、Oct4和Sox2,增殖能力较强,具有三胚层分化潜力;DNA甲基化测序显示,雌性mESC中Igf2-H19基因簇内m3和m4区域的DNA甲基化水平低于雄性mESC。通过CRISPR/dCas9-Dnmt3a技术分别靶向修饰Igf2-H19基因簇内m3和m4的DNA甲基化,结果表明,靶向m3的修饰可提高该区域DNA甲基化水平,但Igf2和H19表达均未发生变化;靶向m4的修饰同样可提高该区域DNA甲基化,同时Igf2表达升高,H19表达降低;同时靶向修饰m3和m4区域后,相应区域DNA甲基化水平升高,Igf2表达升高,H19的表达降低。对比DNA去甲基化药物5-Aza-dC的作用,当使用20μM最适浓度处理细胞后,m4区域DNA甲基化水平降低,Igf2表达降低,H19表达升高。结果表明,m4区域DNA甲基化的改变对Igf2和H19的表达调节具有作用。2.H19 ICR区域DNA甲基化与组蛋白修饰的协同作用为进一步探究DNA甲基化和组蛋白修饰的协同作用对Igf2-H19基因座的调节,本研究利用siRNA方法对雌性m ESC中H3K9me3的甲基转移酶Setdb1进行干扰。免疫荧光和ChIP-qPCR均表明,干扰Setdb1表达后组蛋白H3K9me3修饰显着降低,m3和m4区域内DNA甲基化水平也降低,同时H19的表达升高,Igf2表达没有变化。另外,本研究分析了CRISPR/dCas9-Dnmt3a靶向DNA甲基化后组蛋白修饰的变化。ChIP-qPCR结果表明,DNA甲基化升高的m3和m4区域H3K9me3略有升高,H3K4me3无变化;而5-Aza-dC降低DNA甲基化后两者均没有变化。在干扰Setdb1和5-Aza-dC处理后,TET3在m3和m4区域的富集没有变化。综上所述,本研究分离鉴定的mESC中Igf2-H19基因簇内m3和m4区域的DNA甲基化水平在雌性细胞低于雄性细胞,CRISPR/dCas9-Dnmt3a系统可以靶向增加DNA甲基化。m4区域DNA甲基化的改变影响Igf2和H19的表达,m3和m4区域内DNA甲基化水平随H3K9me3降低而降低,同时H19的表达升高;但H3K9me3并未严格随DNA甲基化的改变而变化。上述表明,DNA甲基化和组蛋白修饰协同作用于印记基因Igf2的表达调节。
刘青云,康陈萍,肖倩倩,郝卫东[9]（2021）在《利用全胚胎和微团培养模型评价硝酸铈的发育毒性》文中进行了进一步梳理目的:利用大鼠植入后全胚胎培养模型和微团培养模型模拟胚胎发育早期和中、晚期过程,评价硝酸铈的发育毒性,以期为进一步开展体内实验研究及合理制定人群稀土接触的健康指导值提供科学依据。方法:取孕9.5 d的SD大鼠胚胎,分别在含0.00、0.50、0.75、1.00 mmol/L硝酸铈的大鼠即刻离心血清中37℃旋转培养,48 h后根据Brown’s评分法对胚胎的生长发育及形态功能进行评分,结合BALB/c 3T3细胞毒性结果,利用欧洲替代方法验证中心（ECVAM）全胚胎预测模型评价硝酸铈胚胎早期发育毒性。分离孕13 d的SD大鼠胚胎肢芽原代细胞进行微团培养,分别用0.03、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00和3.00 mmol/L硝酸铈进行染毒,培养5 d后利用中性红活细胞摄取染色法测定50%细胞增殖受抑制时的浓度(IC50),利用阿利新蓝染色法测定50%细胞分化受抑制时的浓度(ID50),根据ECVAM微团培养预测模型评价硝酸铈胚胎中、晚期发育毒性。结果:全胚胎培养模型中硝酸铈对胚胎生长的无可见有害作用水平（NOAEL）为0.50 mmol/L,0.75 mmol/L以上浓度硝酸铈可显着降低胚胎卵黄囊直径和顶臀长（P<0.05）,抑制胚胎生长,并可致胚胎体节数目减少（P<0.05）,胚胎发育畸形。微团培养模型中硝酸铈对肢芽细胞增殖活性的NOAEL为0.25 mmol/L,对肢芽细胞分化为软骨细胞的NOAEL为0.12 mmol/L,其IC50和ID50分别为1.23和0.76 mmol/L。结论:经全胚胎培养预测模型和微团培养模型评价硝酸铈为弱发育毒性化学物。
相立峰[10]（2020）在《人胚胎原肠前动态发育研究》文中认为伴随工业水平的进步和生活水平的提高,不良的生活环境、不健康的饮食习惯和日益增加的生存压力等导致育龄夫妇的精子与卵子质量急速下降,不孕不育已成为威胁生殖健康的一个重要问题。当胚胎发育至第7天,人胚胎需植入母体的子宫中才能继续存活和发育。这个阶段胚胎在子宫体内发生的变化以及导致这些变化的关键细胞和分子事件,由于材料的无法获得以及缺乏相应技术导致这些问题仍处在黑匣子状态。胚胎植入失败以及在此阶段的发育异常是导致早期流产的主要原因。因此,对人胚胎原肠前发育过程的研究将为我们理解生命起源、探索早期胚胎发育动态变化过程和分子调控机制提供重要的理论依据。2016年的两篇报道在小鼠胚胎体外培养的基础上,建立了着床后人胚胎体外2D培养体系,该体系能够将胚胎在体外培养至13天,并观察到一些谱系分离的现象。然而2D条件下胚胎存在一些重要缺陷,如2D培养的胚胎是扁平的,缺乏体内3D的拓扑结构;虽然2D培养胚胎的滋养外胚层12天后仍在继续存活,但整个胚胎结构发生了坍塌和出现了发育的紊乱,导致很多细胞类型（羊膜上皮）、腔（羊膜腔、卵黄囊）和结构（基底膜、前后轴、原条）无法在2D培养的胚胎中清楚地观测到。因此,这些缺陷限制了2D体系很难真正模拟体内胚胎的发育,无法揭示胚胎在该阶段的发育事件和机制。为了克服以上这些缺陷,我们开展了本论文的研究。我们在获得严格的伦理允许和病人知情同意的条件下,利用临床上捐献的胚胎,通过改善培养基和培养方法,开发了一个三维（3D）人囊胚培养体系,并采用该体系首次将人囊胚在3D条件下培养到原条原基阶段。这些3D胚胎能高度地模拟体内胚胎的发育,经历不同形态的发育并自发组装成2D条件下无法产生的3D结构,包括胚胎双层胚盘、羊膜（amnion）、基底膜（basal membrane）、初级和灵长类独特的次级卵黄囊、前后轴和原条前体。利用这个体系,我们揭示了人原肠前胚胎的关键发育事件:（1）通过单细胞转录表达谱的分析,揭示了上胚层细胞、下胚层细胞和滋养层细胞谱系分化和发育的动态和分子调控网络。（2）羊膜上皮细胞（AME）是上胚层细胞分离出来的第一类细胞系,不同于啮齿类动物,人AME发生于原条形成之前,但其特性和分子机制不清楚。我们发现:与上胚层细胞相比,AME显着地下调多能性基因,其形成与基底膜的缺失显着相关,并有独特的分子表达谱。（3）首次阐明细胞滋养层（cytotrophoblast）、绒毛外细胞滋养层（extravillous cytotrophoblast）和合胞体滋养细胞（syncytiotrophoblast）在胚胎着床后的分化以及引起分化的信号和转录因子,揭示了绒毛外细胞滋养层在早期胚胎中不同于中、后期胎盘的功能。（4）揭示了上胚层细胞（PSCs,多能干细胞）着床后将很快从naive到primed状态的转变。PSCs从着床至第14天期间保持相对的稳定状态,而其发育和转化是由不同的多能因子协调作用所决定的。（5）通过人和非人灵长类胚胎的转录组分析,发现非人灵长类和人上胚层细胞在代谢上具有明显差异,而在维持干细胞多能性以及发育的关键分子和信号通路上具有保守性。本论文利用独创的人胚胎体外3D培养体系详细阐述了胚胎在发育过程中谱系的分离、羊膜腔的形成、羊膜上皮的分离、卵黄囊的形成、胚胎极性的产生和原条的形成等发育学事件。本论文回答了EPI多能性的维持和转化、羊膜上皮的形成机制、滋养层分化发育的机制等科学问题。本研究成果为胚胎的早期发育和干细胞的相关研究提供了新的模型,为组织再生和器官再生提供了研究的理论基础,为研究胚胎因素的着床失败和早期流产提供了理论支持,为不孕症治疗和辅助生殖技术中现存问题的解决提供了研究思路和研究方向。
二、抑制小鼠胚胎细胞NOR活性对胚胎器官发育的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抑制小鼠胚胎细胞NOR活性对胚胎器官发育的影响（论文提纲范文）
（1）高糖对小鼠胚胎心脏发育的影响及Plagl1表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 研究目的与意义 |
| 2 国内外研究现状 |
| 2.1 高糖对心脏发育的影响 |
| 2.2 印记基因Plagl1(ZAC1)在胚胎发育和心脏形成中的重要角色 |
| 2.3 Plagl1 的上游基因Plakoglobin在疾病中的作用机制 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验中主要的试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外受精(IVF) |
| 2.2 胚胎体外培养 |
| 2.3 胚胎移植 |
| 2.4 13.5d胚胎材料的获取 |
| 2.5 亚硫酸盐测序(BSP)检测小鼠胚胎甲基化情况 |
| 2.6 RNA抽提 |
| 2.7 qRT-PCR技术检测小鼠胚胎发育关键基因的表达 |
| 2.8 免疫荧光技术检测小鼠胚胎细胞中Oct4和Cdx2 的表达 |
| 2.9 免疫组化 |
| 2.10 利用链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠高血糖(急性造模) |
| 2.11 细胞培养 |
| 2.12 细胞转染 |
| 2.13 组织中总蛋白的提取 |
| 3 统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 高糖对早期胚胎发育的影响 |
| 2 高糖对植入前胚胎发育关键基因表达的影响 |
| 3 高糖对13.5d小鼠胚胎心脏发育的影响 |
| 3.1 高糖对13.5d小鼠胚胎发育的表观影响 |
| 3.2 高糖对13.5d小鼠胚胎心脏发育相关基因表达的影响 |
| 4 高糖对小鼠新生儿心脏发育的影响(高糖造模小鼠) |
| 5 高糖对Plagl1 启动子区甲基化的影响 |
| 6 高糖对小鼠胚胎发育影响的机制研究 |
| 6.1 细胞中Plakoglobin敲降后对Plagl1 表达的影响 |
| 6.2 细胞中Plakoglobin过表达对Plagl1 表达的影响 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 1 讨论 |
| 2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件1 实验常用仪器 |
| 附件2 实验常用试剂耗材 |
| 致谢 |
| 在校期间公开发表的论文和着作情况 |
（2）甘草苷对酒精损伤小鼠胚胎的修复作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 甘草概述 |
| 1.2 甘草苷药理作用研究 |
| 1.2.1 抗抑郁作用 |
| 1.2.2 对神经的保护作用 |
| 1.2.3 对心脏的保护作用 |
| 1.2.4 对肝损伤的保护作用 |
| 1.2.5 对皮肤损伤的保护作用 |
| 1.2.6 对肿瘤的防治作用 |
| 1.2.7 对肺损伤的保护作用 |
| 1.2.8 抗炎、抗氧化、抗凋亡作用 |
| 1.2.9 其他作用 |
| 1.3 甘草及其活性成分的开发应用 |
| 1.4 酒精对生物体的不利影响 |
| 1.4.1 酒精在体内的代谢 |
| 1.4.2 酒精的毒理作用 |
| 1.4.3 女性饮酒现状 |
| 1.4.4 酒精对发育的影响 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 实验内容 |
| 2.4.1 小鼠MII卵收集、体外受精、体外培养 |
| 2.4.2 药品称量、分组情况 |
| 2.4.3 前期探索甘草苷的最佳修复浓度 |
| 2.4.4 观察各组胚胎发育速度、统计囊胚发育率 |
| 2.4.5 囊胚RNA提取及定量PCR分析 |
| 2.4.6 EDU囊胚细胞增殖检测 |
| 2.4.6.1 EDU操作步骤 |
| 2.4.7 E13.5 假孕鼠、小鼠胎盘获得 |
| 2.4.7.1 雄鼠结扎 |
| 2.4.7.2 假孕鼠模型建立、囊胚子宫移植、胎盘剥离 |
| 2.4.8 E13.5 胎盘H&E染色 |
| 2.4.8.1 石蜡切片的制作 |
| 2.4.8.2 H&E染色 |
| 2.4.9 数据统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 结果 |
| 3.1.1 甘草苷各剂量组对酒精损伤胚胎的修复效果 |
| 3.1.2 实验各组小鼠植入前胚胎发育速度的比较 |
| 3.1.3 囊胚期关键基因的表达研究 |
| 3.1.3.1 胚胎发育关键基因表达 |
| 3.1.3.2 炎症凋亡相关基因表达 |
| 3.1.4 囊胚EDU免疫荧光染色结果 |
| 3.1.5 子宫解剖结果 |
| 3.1.6 胎盘H&E染色 |
| 3.2 讨论 |
| 3.3 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件1 实验常用试剂 |
| 附件2 实验常用仪器 |
| 致谢 |
| 在校期间公开发表论文及着作情况 |
| 参与项目申请 |
（3）LncRNA AU016765在小鼠早期胚胎发育中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 小鼠植入前早期胚胎发育过程的重要阶段 |
| 1.1 合子基因组激活 |
| 1.2 致密化 |
| 1.3 囊胚形成 |
| 2 表观遗传修饰在植入前胚胎发育过程中的研究 |
| 2.1 组蛋白修饰 |
| 2.2 DNA甲基化修饰 |
| 2.3 非编码RNA调控 |
| 3 lncRNA在胚胎发育过程中的研究进展 |
| 4 研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠体外受精胚胎的收集 |
| 2.2 小鼠体内受精胚胎的收集 |
| 2.3 荧光原位杂交 |
| 2.4 荧光定量PCR |
| 2.5 显微注射 |
| 2.6 免疫荧光 |
| 2.7 结扎 |
| 2.8 移植 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 单细胞转录组测序数据分析 |
| 1.1 筛选小鼠胚胎潜在功能性lnc RNA |
| 1.2 测序结果验证 |
| 2 AU016765在胚胎中的定位 |
| 3 AU016765对合子基因组激活的影响 |
| 3.1 AU016765 siRNA序列确定 |
| 3.2 AU016765敲低验证 |
| 3.3 AU016765对合子基因组激活标志基因的影响 |
| 4 AU016765对多能性相关基因的影响 |
| 5 AU016765对胚胎转录活性的影响 |
| 6 AU016765对囊胚发育的影响 |
| 6.1 AU016765对2,4细胞期囊胚发育相关基因的影响 |
| 6.2 AU016765对2,4细胞前、中、后期囊胚发育相关蛋白的影响 |
| 6.3 AU016765对囊胚发育相关蛋白的影响 |
| 7 AU016765对植入后胚胎发育的影响 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 1 讨论 |
| 2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在校期间公开发表论文及着作情况 |
（4）Toe1基因在小鼠植入前胚胎发育中的生物学功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 小鼠早期胚胎发育过程 |
| 1.1.1 母体向合子的转化(MZT) |
| 1.1.2 极化和致密化 |
| 1.1.3 小鼠植入前胚胎谱系分化 |
| 1.2 Toe1 基因相关背景及研究现状 |
| 1.3 目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠各期体内胚胎的收集 |
| 2.2.2 Toe1 基因沉默方法 |
| 2.2.3 免疫荧光方法 |
| 2.2.4 荧光定量PCR |
| 2.2.5 细胞孵化实验 |
| 第3章 结果分析 |
| 3.1 Toe1 在小鼠植入前胚胎中的表达 |
| 3.2 通过RNAi建立Toe1 基因敲低小鼠胚胎模型 |
| 3.3 Toe1 基因敲低胚胎发育表型 |
| 3.4 Toe1 基因敲低影响囊胚期的细胞分裂 |
| 3.5 Toe1 基因敲低在囊胚期增加细胞凋亡 |
| 3.6 Toe1 基因敲低对胚胎谱系分化的影响 |
| 第4章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在校期间公开发表的论文和着作情况 |
（5）牛EPSCs建立及TFAP2C基因打靶和过表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 一、文献综述 多能干细胞建立及诱导形成原始生殖细胞的研究进展 |
| 前言 |
| 1 多能干细胞建立和分类 |
| 1.1 胚胎干细胞建立 |
| 1.2 诱导多能干细胞建立 |
| 1.3 多能干细胞的两种状态 |
| 2 扩展多能干细胞的研究进展 |
| 2.1 小鼠和人扩展多能干细胞的研究进展 |
| 2.2 其他物种扩展多能干细胞的研究进展 |
| 3 多能干细胞向原始生殖细胞分化的研究进展 |
| 3.1 小鼠和人多能干细胞向原始生殖细胞分化的研究进展 |
| 3.2 其他物种多能干细胞向原始生殖细胞分化的研究进展 |
| 4 总结 |
| 二、实验部分 牛EPSCs建立及TFAP2C基因打靶和过表达的研究 |
| 前言 |
| 1.1 牛EPSCs的建立 |
| 1.2 TFAP2C基因的打靶与过表达 |
| 2 试剂与设备 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2 实验设备及仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 牛EPSCs的建立与鉴定 |
| 3.1.1 牛EPSCs的建立方法 |
| 3.1.2 碱性磷酸酶染色 |
| 3.1.3 染色体数目分析 |
| 3.1.4 EB形成和分化实验 |
| 3.2 嵌合体的形成与检测 |
| 3.2.1 嵌合体的制备 |
| 3.3.2 牛EPSCs在胚胎中嵌合能力的检测 |
| 3.3 PCR和 QPCR |
| 3.3.1 细胞和组织基因组提取 |
| 3.3.2 细胞总RNA提取 |
| 3.3.3 反转cDNA的获取 |
| 3.3.4 PCR |
| 3.3.5 QPCR |
| 3.4 免疫荧光染色 |
| 3.5 构建TFAP2C基因打靶和过表达载体 |
| 3.5.1 靶位点的选择及其对应sgRNA的设计 |
| 3.5.2 3`同源臂、5`同源臂和TFAP2C启动子的引物设计与PCR |
| 3.5.3 目的片段连接T载体 |
| 3.5.4 pGTlrkt载体的构建与鉴定 |
| 3.5.5 过表达载体的构建 |
| 3.5.6 牛EPSCs转染打靶质粒与鉴定 |
| 3.5.7 牛EPSCs转染过表达质粒与鉴定 |
| 3.5.8 过表达细胞相关基因的检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 牛EPSCs的建立与鉴定 |
| 4.1.1 牛EPSCs的建立 |
| 4.1.2 碱性磷酸酶染色和染色体数目分析 |
| 4.1.3 多能性基因的QPCR检测 |
| 4.1.4 多能性蛋白的免疫荧光染色检测 |
| 4.2 牛EPSCs体外分化能力的鉴定 |
| 4.3 牛EPSCs嵌合能力的检测 |
| 4.3.1 牛EPSC在早期胚胎中嵌合能力的检测 |
| 4.3.2 牛EPSCs在 E3.5 胚胎中嵌合能力的检测 |
| 4.3.3 牛EPSCs在 E6.5 胚胎中嵌合能力的检测 |
| 4.3.4 牛EPSCs在 E9.5 胚胎中嵌合能力的检测 |
| 4.3.5 牛EPSCs在 E13.5 胚胎中嵌合能力的检测 |
| 4.3.6 牛iPSCs嵌合能力的检测 |
| 4.4 TFAP2C基因打靶和过表达 |
| 4.4.1 pGTlrkt打靶载体的构建 |
| 4.4.2 pGTlrkt载体打靶牛EPSCs |
| 4.4.3 TFAP2C过表达载体的构建 |
| 4.4.4 牛EPSCs过表达TFAP2C基因 |
| 5 讨论 |
| 5.1 牛EPSCs的建立 |
| 5.2 TFAP2C基因的打靶与过表达 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一 复发性流产的西医研究进展 |
| 1 复发性流产的病因研究 |
| 2 复发性流产的治疗现状 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗复发性流产的研究进展 |
| 1 中医病因病机 |
| 2 复发性流产的中医证型分布状况 |
| 3 复发性流产的中医治疗现状 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 子宫细胞衰老与女性生殖功能 |
| 1 衰老细胞 |
| 2 子宫的生理解剖及功能 |
| 3 子宫衰老细胞对女性生殖功能的影响 |
| 4 子宫衰老细胞的治疗现状 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 培元补肾安胎方治疗黄体功能不足型复发性流产临床疗效观察 |
| 前言 |
| 1 研究材料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于网络药理学和分子对接探讨培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第四章 孕酮诱导“种植窗期”子宫内膜细胞衰老在胚胎着床中的作用研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于“种植窗期”内膜衰老探讨培元补肾安胎方对复发性流产作用机制的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 研究总结 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）丙酮酸对小鼠植入前胚胎母源mRNA降解的影响及机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 重要术语词英文对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 哺乳动物植入前胚胎发生的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物胚胎的发生过程 |
| 1.2 哺乳动物胚胎生产技术与意义 |
| 1.3 影响植入前胚胎体外培养的条件 |
| 1.4 植入前胚胎体外培养基的研究进展 |
| 2 能量与哺乳动物植入前胚胎发育 |
| 2.1 能量底物在胚胎发育过程中的作用 |
| 2.2 能量底物在体内环境的动态条件 |
| 2.3 植入前胚胎的能量底物动态需求 |
| 2.4 能量失衡与胚胎发育阻滞 |
| 3 哺乳动物植入前胚胎母源向合子转换 |
| 3.1 哺乳动物胚胎的母源向合子转换 |
| 3.2 母源mRNA降解 |
| 3.3 合子基因组激活 |
| 3.4 母源mRNA降解、ZGA、胚胎发育的关系 |
| 第二章 丙酮酸对小鼠植入前胚胎母源mRNA降解相关影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 实验耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物及其处理方法 |
| 1.2.2 胚胎的收集与体外培养 |
| 1.2.3 线粒体活性检测 |
| 1.2.4 ATP含量检测 |
| 1.2.5 活性氧水平的检测 |
| 1.2.6 引物合成 |
| 1.2.7 QRT-PCR |
| 1.2.8 免疫荧光染色 |
| 1.2.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 丙酮酸对小鼠植入前胚胎发育能力的影响 |
| 2.2 丙酮酸对小鼠植入前胚胎MZT时期胚胎发育的影响 |
| 2.3 丙酮酸对小鼠植入前胚胎线粒体分布与活性的影响 |
| 2.4 丙酮酸对小鼠植入前胚胎氧化应激的影响 |
| 2.5 丙酮酸对小鼠植入前胚胎母源mRNA降解的影响 |
| 2.6 丙酮酸对小鼠植入前胚胎母源性调控的母源mRNA降解因子的影响 |
| 2.7 丙酮酸对小鼠植入前胚胎合子性调控的母源mRNA降解因子的影响 |
| 2.8 丙酮酸对小鼠植入前胚胎转录活性的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 低丙酮酸水平对胚胎的表观修饰水平影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 实验耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物及其处理方法 |
| 1.2.2 胚胎的收集与体外培养 |
| 1.2.3 DNA甲基化免疫荧光染色 |
| 1.2.4 组蛋白甲基化与RNA m~6A甲基化免疫荧光染色 |
| 1.2.5 引物合成 |
| 1.2.6 QRT-PCR |
| 1.2.7 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 丙酮酸对小鼠植入前胚胎DNA修饰水平的影响 |
| 2.2 丙酮酸对小鼠植入前胚胎组蛋白H3K4me2 修饰的影响 |
| 2.3 丙酮酸对小鼠植入前胚胎组蛋白H3K9me2 修饰的影响 |
| 2.4 丙酮酸对小鼠植入前胚胎组蛋白H3K27me2 修饰的影响 |
| 2.5 丙酮酸对小鼠植入前胚胎RNA m~6A甲基化修饰水平的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 3 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（8）小鼠雌性胚胎干细胞中DNA甲基化和组蛋白修饰对印记基因Igf2表达的调节研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 综述 |
| 引言 |
| 1.1 印记基因的种类及其在发育中的作用 |
| 1.1.1 印记基因在胎儿胎盘生长中的作用 |
| 1.1.2 印记基因在大脑和神经元发育中的作用 |
| 1.1.3 基因组印记在睡眠和生物钟中的作用 |
| 1.1.4 印记异常与疾病 |
| 1.2 印记基因的调节机制 |
| 1.2.1 印记基因的表达受差异甲基化区域的调控 |
| 1.2.2 组蛋白修饰对印记基因的表达调控 |
| 1.2.3 mi-RNA对印记基因的表达调控 |
| 1.3 多能干细胞中印记基因的状态 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 小鼠胚胎干细胞中Igf2-H19基因位点的DNA甲基化 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 2i/L干细胞培养液的配制 |
| 2.2.2 囊胚收集 |
| 2.2.3 干细胞的传代、冻存和复苏 |
| 2.2.4 性别鉴定 |
| 2.2.5 DNA甲基化检测 |
| 2.2.6 细胞计数 |
| 2.2.7 碱性磷酸酶染色(AP染色) |
| 2.2.8 细胞核型分析 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 免疫荧光染色 |
| 2.2.11 畸胎瘤的制备 |
| 2.2.12 构建CRISPR/dCas9靶向修饰载体 |
| 2.2.13 脂质体转染 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠胚胎干细胞的分离及H19 ICR区域的DNA甲基化 |
| 2.3.2 小鼠胚胎干细胞系的鉴定 |
| 2.3.3 CRISPR-dCas9靶向修饰H19 ICR区域m3的DNA甲基化 |
| 2.3.4 CRISPR-dCas9靶向修饰H19 ICR区域m4的DNA甲基化 |
| 2.3.5 共同修饰H19 ICR区域m3和m4的DNA甲基化 |
| 2.3.6 去甲基化药物5-Aza-dC处理雌性细胞 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 H19 ICR区域DNA甲基化与组蛋白修饰的协同作用 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 干扰Setdb1后H3K9me3和H3K4me3的变化 |
| 3.2.2 干扰Setdb1后m3和m4的DNA甲基化和基因表达 |
| 3.2.3 靶向修饰m3和m4后组蛋白标记H3K9me3和H3K4me3的变化 |
| 3.2.4 去甲基化药物5-Aza-dC处理后组蛋白标记H3K9me3和H3K4me3的变化 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）利用全胚胎和微团培养模型评价硝酸铈的发育毒性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物与细胞 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 植入后全胚胎培养试验 |
| 1.3.1 全胚胎培养 |
| 1.3.2 BALB/c 3T3细胞增殖活性检测 |
| 1.3.3 发育毒性预测 |
| 1.4 微团培养试验 |
| 1.4.1 微团培养 |
| 1.4.2 微团细胞增殖分化检测 |
| 1.4.3 胚胎毒性预测 |
| 1.5 数据统计和分析 |
| 2结果 |
| 2.1利用全胚胎培养模型评价硝酸铈的发育毒性 |
| 2.1.1硝酸铈对胚胎生长的影响 |
| 2.1.2硝酸铈对胚胎发育的影响 |
| 2.1.3全胚胎培养模型对硝酸铈发育毒性的评价 |
| 2.2 利用微团培养模型评价硝酸铈的发育毒性 |
| 2.2.1硝酸铈对肢芽细胞增殖和分化的影响 |
| 2.2.2微团培养模型对硝酸铈发育毒性的评价 |
| 3 讨论 |
（10）人胚胎原肠前动态发育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环境因素与生殖健康 |
| 1.1.1 环境污染与生殖健康 |
| 1.1.2 生活方式与配子发生 |
| 1.1.3 胚胎体外培养环境压力与表观遗传改变 |
| 1.2 早期胚胎发育概述 |
| 1.2.1 早期胚胎发育 |
| 1.2.2 多能干细胞与胚胎发育 |
| 1.3 着床前胚胎发育 |
| 1.3.1 辅助生殖技术现状 |
| 1.3.2 着床前胚胎发育过程 |
| 1.3.3 着床前胚胎基因调控 |
| 1.4 着床后胚胎发育 |
| 1.4.1 胚胎2D体外培养体系的建立 |
| 1.4.2 着床后胚胎发育过程 |
| 1.4.3 着床后胚胎发育转录因子调控 |
| 1.4.4 人类胚胎干细胞模型 |
| 1.5 信号通路在胚胎发育及干细胞中的研究 |
| 1.5.1 Wnt信号通路与胚胎发育 |
| 1.5.2 TGF-β/Activin/Nodal信号通路对胚胎发育的作用 |
| 1.6 论文的立题依据及主要研究内容 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料来源 |
| 2.1.2 主要试剂及配制方法 |
| 2.1.3 使用抗体 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胚胎样品的准备 |
| 2.2.2 胚胎体外培养 |
| 2.2.3 Matrigel浓度的选择 |
| 2.2.4 全胚染色 |
| 2.2.5 胚胎冰冻切片及切片染色 |
| 2.2.6 共聚焦显微镜拍照 |
| 2.2.7 单细胞消化分离 |
| 2.2.8 细胞测序过程 |
| 2.2.9 测序结果分析 |
| 第三章 人胚胎原肠前动态发育研究实验结果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 人胚胎体外3D培养体系的建立 |
| 3.2.1 人胚胎体外培养体系探索 |
| 3.2.2 着床后胚胎发育过程是谱系动态变化的过程 |
| 3.3 EPI动态发育研究 |
| 3.3.1 EPI发育过程是naive向 primed转变的过程 |
| 3.3.2 EPI发育阶段互相联系又各自表达不同基因 |
| 3.3.3 人类与非人灵长类EPI发育既有差异又有保守性 |
| 3.4 着床后胚胎关键结构的形成 |
| 3.4.1 羊膜上皮是从EPI中迁移出来的一群独特的细胞 |
| 3.4.2 胚胎前后轴及原条前体的形成 |
| 3.5 滋养层细胞发育是分化发育的过程 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 人胚胎体外培养体系的突破 |
| 4.2 本研究填补了着床后人胚胎发育分子机制的空白 |
| 4.3 胚胎发育过程是多能性细胞从naive到 primed态转变过程 |
| 4.4 人类胚胎与其他物种胚胎发育的差异 |
| 4.5 人胚胎发育过程中特殊结构的形成 |
| 4.6 滋养层细胞发育分化 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 论文的创新性 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间取得的科研成果及奖励 |
| 附录 B 医学伦理证明 |
四、抑制小鼠胚胎细胞NOR活性对胚胎器官发育的影响（论文参考文献）
- [1]高糖对小鼠胚胎心脏发育的影响及Plagl1表达分析[D]. 程小翠. 阜阳师范大学, 2021(12)
- [2]甘草苷对酒精损伤小鼠胚胎的修复作用研究[D]. 张芬芬. 阜阳师范大学, 2021(12)
- [3]LncRNA AU016765在小鼠早期胚胎发育中的作用研究[D]. 张恩瑜. 阜阳师范大学, 2021(12)
- [4]Toe1基因在小鼠植入前胚胎发育中的生物学功能及机制研究[D]. 张胜男. 阜阳师范大学, 2021(12)
- [5]牛EPSCs建立及TFAP2C基因打靶和过表达的研究[D]. 张圆圆. 内蒙古大学, 2021
- [6]培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究[D]. 奚婷. 北京中医药大学, 2021(01)
- [7]丙酮酸对小鼠植入前胚胎母源mRNA降解的影响及机制初步研究[D]. 张恒业. 广西大学, 2021(12)
- [8]小鼠雌性胚胎干细胞中DNA甲基化和组蛋白修饰对印记基因Igf2表达的调节研究[D]. 张倩. 内蒙古大学, 2021(12)
- [9]利用全胚胎和微团培养模型评价硝酸铈的发育毒性[J]. 刘青云,康陈萍,肖倩倩,郝卫东. 癌变·畸变·突变, 2021(03)
- [10]人胚胎原肠前动态发育研究[D]. 相立峰. 昆明理工大学, 2020(04)