一、hERG通道细胞外侧S5-P环点突变对该通道的门控特性和离子通透性的变构影响(英文)（论文文献综述）
李思宇[1]（2021）在《基于冷冻电镜的离子通道门控调节机制分析》文中指出离子通道广泛地分布在人体的各个组织中,在众多生理过程中都起到了异常重要的作用。离子通道又可以具体划分为电压门控离子通道、配体门控离子通道和机械门控离子通道。离子通道的活性受到多种因素调节,除去电势变化、配体分子或表面张力这类固有的影响因素外,化学小分子和多肽类也可以对离子通道活性起到调控作用。对离子通道的活性调控研究是离子通道领域研究的基本科学问题之一,对我们理解离子通道的门控机制有着重要意义。在博士研究生阶段,我选择了电压门控离子通道KAT1和配体门控离子通道ASIC1a作为研究对象,借助结构生物学技术和膜片钳电生理技术,对上述离子通道的门控调节机制进行研究。本文的第一部分我们对KAT1的超极化激活机制进行了研究。KAT1是一个超极化激活的内向整流钾通道,存在于拟南芥中。我们解析了 KAT1的冷冻电镜结构,分辨率为3.2 A。这是第一个植物中的电压门控钾通道的电镜结构。我们发现,KAT1是一个同源四聚体,并且是“非结构域交换”的通道。其每一个单体都包含了六根螺旋形成的跨膜结构域、延伸到胞内区的C-linker结构域和C端的CNBD结构域。KAT1具有典型的钾离子选择性过滤器结构,能够选择性地渗透钾离子。通过结构分析我们发现,KAT1通道的孔道区处于关闭状态。KAT1是一个严格的超极化门控离子通道,我们对KAT1的S4螺旋上的带正电氨基酸进行分析,发现这些带正电氨基酸残基对电压感受非常重要。虽然KAT1结构中包含CNBD结构域,但是无论是结构分析或是功能实验,我们均发现cGMP不能对KAT1的通道活性进行调节。在KAT1通道中,S4-S5 linker是一段短loop结构,这个linker区域与C-linker之间的相互作用对通道的开放或关闭起到了重要的作用。如果将这两个结构域之间的相互作用削弱,则会导致通道不能正常开放。这表示S4-S5 linker和C-linker之间的相互作用是KAT1通道门控调节的关键。本文的第二部分,我们对多肽毒素如何结合并调控人源酸敏感离子通道ASIC1a活性进行了研究。人源酸敏感离子通道ASIC1a（hASIC1a）主要分布于中枢神经系统和外周神经系统中,ASIC1a通道主要参与疼痛感知、学习记忆等生理过程,是潜在的药物靶点。hASIC1a通道的活性受到质子浓度的调控,同时还有多种因素可以对通道活性进行调节,比如多肽毒素。非洲黑曼巴蛇毒Mambal对hASIC1a活性起到抑制作用。经过多重蛋白表达纯化优化步骤和结构解析方法的选择,我们最终利用冷冻电镜解析了 hASIC1a的apo状态和Mamba1-hASIC1a复合物的结构,分辨率分别为3.56A和3.9A。与已解析的鸡源ASIC1（cASIC1）结构相比,处于静息状态的hASIC1a与cASIC1通道具有相似的结构,是一个同源三聚体,其门控机制与cASIC1相似。Mamba1毒素主要结合于hASIC1a的胞外结构域,当毒素与通道结合后,通道局部发生了构象变化。Mamba1将hASIC1a锁定在关闭构象。我们发现虽然Mamba1对hASIC1a和cASIC1的亲和力相似,但毒素对hASIC1a的抑制作用强于对cASIC1通道的抑制作用。通过序列比对分析和结构比较,我们发现了对hASIC1a和cASIC1的抑制作用不同的关键氨基酸残基。Arg155和Glu102-Asp165对（分别对应于cASIC1中的Leu156和Arg103-Glu168）,导致了hASIC1a和cASIC1对Mamba1的反应不同。
李艳芬[2]（2021）在《SCN5A突变参与心肌致密化不全心律失常发生的分子机制研究》文中认为背景:电压门控钠离子通道是最重要的心肌细胞膜去极化阳离子通道之一。它决定了 0相动作电位的形成与幅度,心脏中的钠通道主要是SCN5A钠通道亚型（Nav1.5通道蛋白）,由 α亚基和β亚基组成,其中SCN5A基因编码合成Nav1.5通道的α亚基,α亚基决定通道的生物物理功能,β亚基起辅助调节通道功能作用。SCN5A离子通道广泛存在于心房肌、心室肌及蒲肯野氏纤维,是Ⅰ类抗心律失常药物的靶蛋白。心脏钠通道SCN5A基因发生突变可引起通道功能的增强或缺失。功能增强型突变（Gain of function）会导致3型长QT综合征（LQT3）,房颤（AF）的发生,而功能缺失突变（loss of function）则与多种心肌病有关,如Brugada综合征（BrS）、心脏传导型疾病、扩张型心肌病,病态窦房结综合征。SCN5A基因突变的临床特征不仅因突变直接影响通道生物物理功能而发生变化,也随年龄、性别、体温以及心脏各区域之间内在调控的变化而变化。这种临床表型多样性（基因突变外显率）使得基因型与表型之间的相关性研究变得困难。在以往的研究中,主要集中于SCN5A基因突变影响通道的生物物理功能,从而导致心脏离子通道疾病LQT3、房颤、病态窦房结综合征等的发生。但是,近几年研究表明,在一些‘结构型心肌病’如左心室致密化不全型心肌病（LVNC）的患者基因筛查中,也发现SCN5A的变异,并且携带变异的患者比例不低。由于LVNC的主要临床表现为恶性心律失常、猝死和易发生急性心力衰竭,我们推测,离子通道变异在这其中发挥了致病作用。因而我们对于SCN5A基因突变是否是LVNC患者发生心律失常的致病因素进行了深入研究。目的:探讨SCN5A基因突变参与心肌致密化不全心律失常发生的内在分子机制。方法:对27例进行心脏移植治疗的LVNC患者的心脏组织进行外显子组基因测序,我们发现了 7个杂合的单核苷酸SCN5A突变,通过分子克隆及点突变技术体外构建了 SCN5A野生型质粒和SCN5A突变质粒,运用脂质体转染技术和腺病毒载体将野生型SCN5A通道和突变的SCN5A通道分别表达于CHO-K1模式细胞和人诱导多功能干细胞分化的心肌细胞（iPS-CM）。通过膜片钳技术和CardioExcyte 96仪器检测突变体和野生型SCN5A离子通道之间电生理功能差异。结果:在27例散发的左心室致密化不全患者中,近半数（44.4%）患者携带心脏钠通道α亚单位基因（SCN5A）突变（H558R、G292S、P1090L、V1951L、R1193Q、R1195H、A1180V）。这些患者在临床后期均出现心律失常、心力衰竭等症状。我们发现表达于CHO-K1模式细胞上的SCN5A突变通道生物物理特性不同于iPS-CM细胞。这些突变通道是通过增强通道的激活（R1195H、V1951L）或破坏通道的快速失活（P1090L）而使得通道功能增强。此外,无论是在CHO-K1还是iPS来源的心肌细胞上表达这些突变通道,通道的慢失活均被减弱。突变通道表达于iPS来源的心肌细胞上时,通道的恢复功能削弱,心肌细胞的搏动频率发生变化,场电位发放频率增加,发放时程缩短,心肌细胞发生颤样的心律失常。暗示SCN5A基因突变造成通道电生理特征改变可能是LVNC患者合并发生心律失常或者心力衰竭的原因之一。此外,我们还发现LVNC患者左心室心肌组织SCN5A蛋白水平降低,而HCM心肌组织SCN5A蛋白水平升高。暗示LVNC心肌组织中SCN5A蛋白水平的降低可能也参与了 LVNC的发病机制。结论:SCN5A基因突变参与了LVNC心律失常发生的病理生理过程,是LVNC患者发生心律失常或心力衰竭的致病因素之一。
赵长胜[3]（2020）在《抗肿瘤19肽对细胞膜离子通道的影响及心脏安全初探》文中研究说明肿瘤抑素作为肺-肾综合征的自身抗原,在80年代作为胶原蛋白IV的α3链的非胶原区而被发现,有关肿瘤抑素相关肽研究的热点主要集中在抗肿瘤活性,而抗肿瘤肽作用机理及应用安全已经成为近年来的热点。随着膜片钳技术的不断发展进步已经演化出多种测量模式适合不同研究需要,并成为电生理学和现代膜生物研究的重要手段。利用该技术可直接测量细胞的局部膜片跨膜电流,进而反映细胞膜各个离子通道起闭情况。本实验利用大肠杆菌将重组载体pet32a-19肽-BL21（DE3）诱导表达,提取纯化复性获得抗肿瘤19肽,分别用细胞内液将其配制浓度为50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的溶液。通过利用吸附穿孔膜片钳制模式实验,结果显示抗肿瘤19肽对人肝癌细胞（SMMC-7721）膜有损伤作用,该损伤作用依抗肿瘤19肽浓度的升高逐渐加强,15min内的封接电阻阻值降低,证明细胞形成物理孔洞。同样实验方法和条件在家兔心室肌细胞膜未检测到200μg/ml抗肿瘤19肽形成物理孔洞。根据传统全细胞膜片钳制记录模式实验结果显示浓度为200μg/ml抗肿瘤19肽对SMMC-7721的延迟整流钾离子通道具有明显抑制作用,使其电流密度从87.27±4.49p A/p F下降至58.39±2.88pA/pF,峰值电流密度下降幅度为33.09%（n=5,P<0.05）。而对兔子心室肌的延迟整流钾通道却没有明显抑制效果,电流密度下降幅度仅为0.01%（n=5,P>0.05）。浓度为200μg/ml抗肿瘤19肽对SMMC-7721的钠离子通道也有抑制作用,电流密度从84.68±4.63p A/p F下降至52.18±2.92p A/p F,峰值电流密度下降幅度为38.38%（n=5,P<0.05）。比较加入抗肿瘤19肽前后SMMC-7721细胞的Na+、K+电流的改变为定量地判断细胞损伤程度提供电生理学依据,以上结果表明抗肿瘤19肽具有抗肿瘤细胞的功能,并且对正常细胞无损伤作用。进一步利用全细胞膜片技术研究抗肿瘤19肽对hERG钾通道的作用,结果显示抗肿瘤19肽在不同浓度25μg/ml至400μg/ml范围内对hERG钾通道无明显抑制作用,其中最高浓度为400μg/ml的抗肿瘤19肽使hERG电流下降幅度仅为5.6%（n=5,P>0.05）。
竺爱琴[4]（2020）在《红头蜈蚣毒素RhTx2调节TRPV1离子通道的作用机制研究》文中研究指明目的:瞬时受体电位香草酸1型受体离子通道（transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1）是痛觉通路中的关键受体,广泛分布在哺乳动物的中枢和外周神经系统,可以被多种物理和化学刺激激活。由于TRPV1在体温调节方面的重要作用,很多小分子抑制剂在临床实验中失败,因其导致患者的体温异常。多肽毒素是研究离子通道的重要工具,还因其高亲和力和高选择性被广泛开发为药物。TRPV1已被证明是几种毒素的靶标。我们从中国红头蜈蚣的毒液中鉴定出了一种多肽毒素,将之命名为red-headed centipede toxin 2（RhTx2）,它能够选择性地激活TRPV1,并且可以使通道快速脱敏。在本研究课题中,我们希望通过研究RhTx2的结构和功能特性,为有关TRPV1的调节机制研究和新型镇痛药的开发提供新的思路。方法:1.我们首先利用凝胶色谱（GC）结合反相高效液相色谱（HPLC）从中国红头蜈蚣的毒液中分离纯化出毒素多肽,通过蛋白测序的方法获得其氨基酸序列。2.从生物公司合成纯度95%的线性毒素多肽,利用氧化还原的方法进行多肽的复性折叠,并进一步用HPLC分离纯化后冻干。3.利用电生理实验技术,全细胞结合单通道记录模式,在细胞水平上进行功能验证和结果分析。4.最后,通过Rosetta计算结构生物方法,模拟出多肽在通道上的结合构象和位置,探讨毒素结合和脱敏的结构机制。结果:1.我们从中国红头蜈蚣的棘突中鉴定出一种31个氨基酸的毒素多肽,分子内两对二硫键,分子量3458.8 D,命名为red-headed centipede toxin 2（RhTx2）,是之前发现的RhTx的一个变种。2.结构模拟显示,RhTx2有更大的正电性表面,“首尾”氨基酸形成氢键增加蛋白稳定性。3.RhTx2能够选择性激活TRPV1通道并快速脱敏,且脱敏较为彻底,不易恢复。4.RhTx2作用位置在胞外,且不能被辣椒平抑制。5.RhTx2的激活曲线较RhTx明显右移,EC50升高近100倍。6.单通道记录表明,RhTx2导致的TRPV1的电流脱敏涉及两种机制:同时降低通道的开放概率和单通道电导。7.分子对接实验表明,RhTx2在TRPV1上的结合位置随着通道的开放有所改变,通道处于关闭状态时结合在外孔区的边缘,当通道开放时移至选择性滤器中心。结论:我们的研究结果表明,RhTx2和TRPV1的相互作用是一种独特的作用机制。RhTx2不仅是研究TRPV1通道激活和脱敏机制的工具,也为研究以TRPV1为镇痛靶点的新型痛药物提供了思路。意义:在本研究中,我们从中国红头蜈蚣的毒液中发现了一种多肽毒素RhTx2,它快速激活和快速脱敏TRPV1的性质对于研究TRPV1的激活和脱敏机制起到了积极作用。此外,TRPV1离子通道是对多种疼痛刺激响应的多模态受体,是研究镇痛药的经典靶点。然而,由于TRPV1在体温调节中起关键作用,一些该通道的小分子抑制剂在临床试验中失败,因为它们常常会导致严重的副作用,如改变患者的体温和热感觉,使体温异常升高。因此,为了开发以TRPV1为靶点的新型镇痛药,需要有除抑制TRPV1活性之外的替代策略。我们的多肽毒素RhTx2可以快速脱敏TRPV1,有望在未来的动物模型中探究RhTx2是否具有镇痛作用。
罗天霞[5]（2020）在《Junctophilin2 MORN结构域对心肌小电导钙激活钾通道膜转运的调控》文中提出小电导钙激活钾通道（small conductance Ca2+activated K+channels,KCa2,SK）属于非电压依赖性的钙激活钾通道家族,主要分布于神经系统和心血管系统,对Ca2+的敏感性远高于大电导钙激活钾通道（big conductance Ca2+activated K+channels,BK）,可至亚微摩尔级。Ca2+通过与SK通道羧基端钙调蛋白（calmodulin,Ca M）结合激活通道,K+外流从而使细胞内钙离子稳态的变化转换成细胞膜电位变化。SK通道可分为三个亚型,SK1、SK2及SK3,其中SK2通道主要表达于心房,参与心肌细胞动作电位复极化形成,在生理和病理状态下起关键作用。敲除小鼠SK2通道可延长动作电位复极化的时程,房颤的易感性增加;过表达SK3通道可使动作电位复极化缩短,亦增加房颤发生。由此提示,SK通道可作为治疗房颤等心血管疾病的靶点,但其分子调控机制,目前所知甚少。Junctophilins（JPs）在哺乳动物可兴奋细胞中可维持内质网/肌质网（endoplasmic reticulum/sarcoplasmic reticulum,ER/SR）与质膜之间的紧密联系。哺乳动物体内有JP1-4四个亚型,其中JP1主要在骨骼肌表达,JP2存在于骨骼肌、心肌和平滑肌细胞,JP3和JP4主要定位在中枢神经系统。在神经系统中的研究显示,敲除JP3和JP4可使Ry R2通道失去对SK2通道的调控作用;在骨骼肌和心肌中,敲除JP1和JP2可使L型钙通道（L-type voltage-dependent calcium channels,LTCC）与Ry R2通道（ryanodine receptor2）失偶联,骨骼肌和心肌收缩异常。高分辨率光学显微镜下观察到JP2与Ry R2之间紧密联系,JP2通过与Ry R2通道直接作用调节通道门控。敲除JP2也可影响钠钙交换体（sodium Calcium Exchanger,NCX1）的定位及功能。此外,JP2和Caveolin1蛋白之间的结合为血管平滑肌的质膜与肌质网膜耦联的钙微区（Ca2+microdomain）提供结构和功能基础,并维持Ry R2和BK通道之间的功能耦联;JP2与Caveolin3蛋白直接相互作用可调控新生小鼠耦联膜复合体（junction membrane complex,JMC）的成熟发育。由此可见,JP2作为心肌细胞中的“桥梁”蛋白,其与离子通道之间有效的信号传导为钙诱导钙释放过程（calcium-induced calcium release,CICR）和心肌正常收缩奠定基础,具有重要的生理意义。位于JP2氨基端的MORN（membrane occupation and recognition nexus）结构域,是与质膜偶联的特定功能结构域,由MORN结构域I和II组成。对于MORN结构域与质膜相互作用的机制有不同的研究,可能通过与质膜磷脂分子直接结合,或通过与细胞膜蛋白分子等进行结合。我们实验室之前结果证实小鼠心肌JP2蛋白与SK2通道有相互作用,那么JP2是否通过MORN结构域与SK2发生相互作用,以及它与SK2通道结合的具体结构域,目前尚未见报道。本研究根据文献报道及JP2和SK2的结构特点,制备SK2和JP2的不同片段质粒,采用分子生物学和细胞生物学的方法,检测二者结合的具体区域;观察JP2 MORN结构域对SK2通道表面膜表达的影响及第一部分JP2蛋白与SK2通道相互作用区域的验证材料与方法1.免疫共沉淀和细胞免疫荧光检测SK2和JP2的定位及相互作用:大鼠心肌组织或细胞裂解液中加入JP2或SK2抗体,用protein A/G珠子制备免疫共沉淀复合物,分析SK2和JP2蛋白之间的相互作用。制备H9c2细胞爬片,细胞免疫荧光观察SK2和JP2蛋白在细胞中的分布。2.构建SK2和JP2片段真核表达载体:将SK2不同片段SK2-N（1-145）,SK2-M（141-390）和SK2-C（380-574）克隆至载体p IRES2-EGFP中,并在C末端插入Flag/HA标签。不同长度的JP2 c DNA:JP2-N1（1-253,包含MORN I结构域）,JP2-N2（216-350,包含MORN II结构域）,JP2-C（340-696）克隆至有His标签p EGFP-C1载体中。3.免疫共沉淀检测SK2和JP2片段相互作用:分别将SK2-N,SK2-M及SK2-C与JP2-N1,JP2-N2及JP2-C两两按1:1比例瞬时转染HEK293细胞后提取各转染组细胞总蛋白,使用特异性标签Flag和His抗体,分析SK2片段与JP2片段是否结合。4.GST pull-down分析:分别将GST-JP2-N1,GST-JP2-N2,GST-JP2-C及对照GST原核表达载体转化BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达及纯化。将各组纯化蛋白与HEK293细胞中表达的SK2-X-HA片段蛋白孵育,谷胱甘肽洗脱液特异性洗脱后用Western blot检测复合物中HA标签表达。结果1.SK2和JP2可在大鼠心肌及H9c2细胞中形成免疫沉淀复合物,并且二者在H9c2细胞中分布于细胞膜及胞浆中,有明显的共定位。提示SK2通道和JP2蛋白可能存在相互作用。2.免疫共沉淀实验结果显示JP2-N1与SK2-C末端可直接相互作用,其余实验组及对照组均未出现免疫阳性条带。3.GST-pulldown实验结果显示大肠杆菌BL21中表达的GST-JP2-N1融合蛋白可与HEK293细胞中表达的SK2-C末端蛋白结合,该结果提示JP2通过MORN结构域I与SK2羧基端发生相互作用。第二部分JP2 MORN结构域Ⅰ增加细胞膜SK2通道的表达和定位材料与方法1.构建SK2+JP2-N1、SK2+JP2-N1mut点突变真核表达载体:将SK2和JP2-N1的c DNA亚克隆至p IRES2-EGFP中,得到SK2+JP2-N1质粒。采用点突变技术在SK2+JP2-N1质粒中构建N101R和Y141H两个突变位点。2.HEK293稳定转染细胞株表达筛选:分别将SK2,SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut质粒转染HEK293细胞,G418筛选,阳性克隆出现后采用有限稀释法扩大培养,提取总细胞RNA,RT-PCR检测目的基因。3.生物素提取细胞膜蛋白:将转染各组质粒的HEK293细胞表面生物素化,裂解细胞蛋白,生物素结合的蛋白与亲和素珠子孵育后还原洗脱蛋白复合物,W estern blot检测各组细胞的SK2通道蛋白表达。4.敲减JP2腺病毒构建及感染:将接种于培养皿中的H9c2细胞用携带阴性对照si RNA（Ad-NC）或JP2-si RNA（Ad-si JP2）的腺病毒感染。RT-q PCR和Western blot的方法分别测定各组感染细胞中JP2 m RNA和蛋白表达,并观察JP2敲减对SK2通道总蛋白及膜蛋白表达的影响。5.免疫共沉淀检测JP2 MORN结构域I突变对其与SK2通道结合的影响。6.电生理记录:选择稳定转染SK2和SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞作为研究对象,全细胞膜片钳记录SK2通道电流。结果1.建立HEK293稳定表达SK2、SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut细胞株,提取各转染细胞组SK2通道总蛋白和膜蛋白,Western blot结果显示,与单转SK2组相比,SK2+JP2-N1组SK2通道的总蛋白没有显着变化,膜蛋白显着增加;转染SK2和SK2+JP2-N1 mut两组比较,SK2总蛋白与膜蛋白均无显着差异。细胞免疫荧光实验结果显示,转染SK2的HEK293细胞,SK2通道分布于胞浆中;转染SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞,SK2通道的膜蛋白分布显着增加,该结果提示JP2 MORN结构域I可显着增加SK2通道的膜表达和定位。2.分别用JP2敲减si RNA及阴性对照si RNA感染H9c2细胞,提取H9c2细胞的总蛋白及膜蛋白,与阴性对照组相比,JP2敲减si RNA组SK2通道的总蛋白无明显变化,膜蛋白表达显着降低。3.分别取表达SK2+JP2和SK2+JP2mut稳定转染HEK293细胞株,用特异性SK2和JP2抗体进行免疫共沉淀实验,结果显示JP2突变显着降低其与SK2通道之间的结合。4.全细胞膜片钳记录不同稳转细胞组的SK2通道电流,与转染SK2质粒的HEK293细胞相比,转染SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞中SK2电流密度明显增加。第三部分JP2 MORN结构域Ⅰ调控细胞膜SK2通道表达的机制材料与方法1.RT-q PCR检测H9c2细胞中敲减JP2对SK2 m RNA表达的影响。2.细胞免疫荧光检测转染SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞中SK2通道在核内体及高尔基体中定位。3.Western blot方法检测伯氨喹处理转染SK2+JP2-N1或SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞中SK2通道膜表达。4.统计学分析:所有实验数据以均数±标准误表示,图形均使用Graph Pad Prism 5软件创建。以两样本均数t检验进行统计学处理,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.在稳定表达SK2+JP2-N1 mut质粒的HEK293细胞株中,SK2通道与早期核内体标记物Rab5、EEA1共定位明显,而与高尔基体标记物GM130共定位较弱。该结果提示JP2 MORN结构域I突变可能使SK2聚集于早期核内体致使其转运至细胞膜发生异常。2.用选择性抑制SK2通道循环转运途径的伯氨喹处理表达SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞,Western blot结果显示,与DMSO组比较,伯氨喹处理组的SK2通道膜蛋白均显着降低。进一步提示JP2 MORN结构域I可能通过影响逆向转运通路中的循环途径降低SK2通道膜表达。结论JP2 MORN结构域I通过与SK2羧基末端的相互作用直接调节SK2通道的功能和转运。
郄艮朝[6]（2019）在《Y403位点影响hERG钾通道门控机制的研究》文中指出hERG（Human ether-a-go-go-related gene）钾通道门控过程异常会形成各种疾病,如心律失常、长QT综合征等,许多中药化合物就是通过影响hERG钾通道的门控过程来发挥其抗心律失常的作用,如槐果碱、葛根素、钩藤碱、黄连素、莲心碱等植物提取物通过抑制hERG钾离子电流,延长复极时间来治疗心室加速和室颤。所以了解hERG钾通道的门控过程的机制十分重要,有报道指出Y403位点突变为丙氨酸会影响通道的门控过程,但其作用机制不清楚。本文主要通过构建离子通道突变体、膜片钳技术等方法研究Y403位点调控hERG钾通道门控的机制。首先将Y403突变为丙氨酸进行实验研究,结果表明Y403A突变会加速通道的激活过程和去激活过程;S631A通道基本不影响通道的激活过程,会消除通道的C型失活;这一部分重复前人的实验且与前人的实验结果一致,保证了实验的一致性和可信性,另外从实验结果猜测hERG钾通道内存在N型失活,Y403位点会影响这一过程。将Y403A与具有消除C型失活作用的S631A进行双突变来探究对门控过程的影响,结果表明Y403AS631A双突变通道减慢了通道的激活过程,但加快了通道的去激活过程。有研究报道N端138-373氨基酸链能够与通道口内侧的S620T突变体相互作用来减缓通道的去激活过程,S631A与S620T功能相同（都能消除C型失活）且位置相近（都位于通道口的内侧）,猜测S631A也会与N端138-373氨基酸链相互作用减缓通道的去激活过程。在Y403AS631A双突变通道的基础上分别去除N端的138-378氨基酸链、2-354氨基酸链和2-135氨基酸链进行实验,结果表明去除138-373氨基酸链会加速通道的激活过程而减缓通道的去激活过程,作为对照在野生型和S631A上也去除了 N端138-373氨基酸链,结果同样表明也会加速通道的激活过程而减缓通道的去激活过程。而去除2-354氨基酸链、2-135氨基酸链会加速通道的去激活过程。另外根据实验结果猜测hERG钾通道内可能存在N型失活,N端138-373氨基酸链会影响这一过程。N-型失活的机制为球链机制,即通道α亚基N-端的部分氨基酸（约为20个）结合在通道孔道区的内侧而导致通道失活。为了进一步探究是否存在N型失活,假设138-373长链作用的位点可能位于S6区,另外猜测Y403可能与S6结构域作用影响去激活作用。在S6结构域进行一些突变研究,实结果表明在Y403AS631A基础上将664位置的谷氨酰胺突变为丙氨酸之后,加速了通道的激活过程,减缓了Y403AS631A双突变通道的去激活过程,说明Y403能够与Q664相互作用影响通道的门控过程。根据实验猜测hERG钾通道内存在N型失活,Q664与去除N端138-373氨基酸链一样可能影响hERG钾通道的N型失活,他们可能以同一机制影响通道的门控过程。138-373长链氨基酸是“球”,664的位置可能是138-373长链结构作用的受体,两者相互作用起到一个链的作用,使138-373长链结构堵塞离子通道孔使离子通道失活。而Y403可能通过作用于S6结构域的664位置来影响N型失活。
孟佳[7]（2019）在《S1区对人类hERG通道失活的调控机制》文中提出人类hERG钾离子通道产生的快速延迟整流钾电流(Ikr)是心肌细胞动作电位复极化过程中的重要离子流,因此hERG在心肌动作电位复极化过程中发挥重要作用。对hERG的门控机制已有广泛且深入的研究,但通道跨膜螺旋段S1区作为通道电压传感域的一部分,对其研究并不充分。有研究表明S1区位点突变会影响hERG通道的门控过程,但其作用机制并不清楚。因此本文旨在采用点突变、N-末端截短突变等方法研究S1区调控hERG通道门控的机制。我们发现S1区位点Y403,W412,T421突变为丙氨酸后,不但通道激活电压依赖性发生了偏移,而且失活变快。选择其中的代表性位点Y403与S631进行双突变（Y403A-S631A）,发现在没有C-型失活存在的情况下,双突变hERG通道依然存在一个快速失活过程。当在Y403A-S631A双突变通道的基础上将N-末端保守区（eag结构域）、hERG通道独有的长链氨基酸（138-373）及全部N-末端截掉之后,我们发现138-373位氨基酸缺失之后,Y403-S631A双突变通道的快速失活现象消失。这表明双突变通道的快速失活现象的确与通道N-末端结构域相关。综上所述,本研究证明S1区调控hERG通道的一个类似于N-型失活的门控过程,并且通过hERG通道N-末端的独有长链氨基酸（138-373）区域对通道产生作用。
张璐[8]（2019）在《包含β2亚基nAChR点突变体构建及功能研究》文中研究说明烟碱型乙酰胆碱受体（Nicotinic acetylcholine receptor,nAChR）是一种配体型门控离子通道,呈五聚体结构,与配体结合部位集中在受体胞外N端区域。nAChRs按照组织分布可分为:神经型nAChRs和肌肉型nAChRs。按照亚基组成可分为:同型的五聚体nAChRs（α7）和异型的五聚体nAChRs（α3β2、α3β4、α4β2等）。神经型nAChRs与抑郁症、烟碱成瘾、阿尔茨海默症等神经生理病理过程相关,也是许多相关药物作用的重要靶点。α3β2和α3β4是两种重要的nAChR亚型,主要分布在中枢和外周神经系统,两者具有不同的神经病理和生理功能,其中α3β2 nAChR主要与疼痛相关,而α3β4 nAChR主要与烟碱成瘾、药物滥用、肺癌等生理和病理过程相关,β2与β4亚基是导致两种亚型在功能和结构上呈现差异的重要原因之一。β2与β4两种亚基的氨基酸序列具有较高的同源性,其胞外N端的Loop D、E、F是配体结合的主要区域。确定β2亚基配体结合区域的关键氨基酸位点,对于研究受体功能差异,筛选亚型特异性药物以及研究药物作用机理的分子机制都具有重要意义。本研究通过PCR介导的定点突变技术,对β2亚基上配体结合的三个关键区域Loop D、E、F中的关键氨基酸（12个位点）进行定点突变,将β2亚基上12个位点的氨基酸替换为β4亚基对应位点的氨基酸,构建12种突变体。同时利用nAChR特异的激动剂乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）和拮抗剂α-芋螺毒素（α-Conotoxin,α-CTx）RegILA和LvIA,通过双电极电压钳技术,对突变体的活性以及配体和受体结合的分子机制进行研究。结果表明:β2亚基Loop D中的第59位的苏氨酸（Thr,T）对应突变为赖氨酸（Lys,K）,虽然激动剂ACh对α3β2[T59K]突变体的活性没有改变,但是拮抗剂α-CTx RegIIA对α3β2[T59K]活性却显着增强,半阻断剂量（IC50）从本体的35 nM减小至3.1 nM,活性增强了11倍。拮抗剂α-CTx LvIA对α3β2[T59K]活性也显着增强,半阻断剂量（IC50）从本体的16 nM减小至3.2 nM,活性增强了 5倍。β2亚基Loop E中的第106位的苯丙氨酸（Phe,F）对应突变为缬氨酸（Val,V）,第108位的丝氨酸（Ser,S）对应突变为苏氨酸（Thr,T）,第111位的缬氨酸（Val,V）对应突变为异亮氨酸（Ile,I）,第1 13位的丝氨酸（Ser,S）对应突变为精氨酸（Arg,R）。突变后,激动剂ACh对α3β2[F106V]突变体的活性有所增强,半数有效浓度（EC50）由43μM变为22 μM,活性提高了 2倍。拮抗剂α-CTx RegIIA对α3β2[F106V]、α3β2[S108T]和 α3β2[VlllI]nAChR 的活性降低,IC50从本体的 35 nM分别增加至360 nM、440 nM、870 nM,活性分别降低了 10倍、13倍、25倍,但是对α3β2[S113R]的活性增强,IC50从本体的35 nM减小至3.2 nM,活性增强了 11倍。拮抗剂 α-CTx LvIA 对 α3β2[F106V]、α3β2[S108T]和 α3β2[V111I]nAChR 的活性降低,IC50从本体的16 nM分别增加至400 nM、1400 nM、340 nM,活性分别降低了 25倍、88倍、21倍,但是对α3β2[S113R]的活性增强,IC50从本体的16 nM减小至4.1 nM,活性增强了 4倍。当β2亚基Loop F中的第168位的丝氨酸（Ser,S）对应突变为异亮氨酸（lle,I）,激动剂ACh对α3β2[S1681]突变体的活性有所增强,EC50由43 μM变为26μM,活性提高了 1.6倍。拮抗剂α-CTx RegIIA对α3β2[S1681]nAChR的活性升高,IC50从本体的35 nM降低至1.0 nM,活性升高35倍。拮抗剂α-CTx LvIA对α3β2[S168I]nAChR的活性升高,IC50从本体的16 nM降低至0.7 nM,活性升高了 23倍。本研究利用PCR介导的受体定点突变技术,对β2亚基三个配体结合区的关键氨基酸进行了点突变,不仅优化了定点突变的方法,还建立了 α3β2 nAChR的12种突变体模型,确定了 β2亚基上106、108、113、168位4个新的关键氨基酸位点。本研究对研究nAChR亚基上的关键氨基酸位点进行了新的探索,建立的受体突变体模型也为研究配体和相关药物与α3β2 nAChR相互作用的分子机制提供了基础。
王燕峰[9]（2018）在《机械门控Piezo1通道激动剂的发现与机制研究》文中提出机械感受对生物有机体进行正常的生命活动具有非常重要的意义。机械门控离子通道作为重要的分子受体在机械感受过程中承担着重要的感受器的作用。它能够将机械刺激快速的转化成电化学信号,在低等到高等生物的生命活动中起着至关重要的作用。Piezo蛋白家族近来已经被证实是哺乳动物中长期寻找的首类真正意义上的机械门控阳离子通道。鼠源Piezo1通道蛋白每个亚基有2547个氨基酸,形成一个具有三个扇叶的螺旋桨结构的同源三聚体,包括中间的离子通透模块和外周的具有螺旋桨结构的机械传导模块以及中间连接的横梁区。Piezo1通道作为哺乳动物中机械敏感阳离子通道的原型,已被证实在众多机械传导过程中具有重要的生理学功能,比如血管发育、细胞迁移等。然而,它的机械门控和传导机制至今仍不是很清楚。得益于高通量药物筛选的方便快捷,我们鉴定到一系列新的Piezo1的小分子化合物激动剂,命名为Jedi.Jedi与已知的激动剂Yoda1不同,且经过化合物结构的优化与鉴定发现Jedi1的效果最好。通过单细胞钙成像和电生理实验发现Jedi能够激活Piezo1引起钙内流和产生电流。另外,表面等离子共振实验表明Jedi能够与Piezo1蛋白的机械传导模块结合而不是离子通透模块。结合Jedi的化合物性质及电生理实验结果,发现Jedi作用到Piezo1通道的胞外区。一系列胞外区删除的突变体的构建表达和测试发现,胞外区657-677和870-921删除取消了Jedi对Piezo1的激活作用,而Yoda1的作用正常。结合结构信息和交联质谱实验,我们定位出了横梁区的序列。经过横梁区一系列突变体的构建和鉴定,找到L1342和L1345两个重要位点,突变后能够取消Jedi和Yoda1的激活作用。电生理数据发现两个胞外区删除削弱了Piezo1的机械敏感性,氨基酸位点突变也降低了Piezo1的机械敏感性。然而胞外删除和突变都不影响Jedi与Piezo1蛋白的结合,暗示着长距离的别构调控。综上所述,本研究为Piezo作用机制的研究提供了新的研究工具,并提出类似杠杆作用的门控和传导机制,为深入理解哺乳动物中机械门控Piezo通道的作用机制奠定了基础。
李夏[10]（2018）在《BK通道中与癫痫相关的新发突变对通道功能影响的研究》文中研究指明癫痫是一种常见的神经性疾病,以反复的、自发的癫痫发作为临床特征。癫痫发作是由大脑皮层神经元的超同步异常放电导致脑功能暂时性紊乱的一种现象。癫痫具有很高的发病率和致死率,然而癫痫的病因和发病机理还不是很清楚。可能导致癫痫的病因有很多,比如遗传因素、后天获得因素以及刺激因素等等。单基因突变可以导致特发性癫痫,而这些单基因中有很大一部分是编码离子通道的基因,其中包括电压门控型的钾离子通道、钠离子通道和钙离子通道,还有烟碱型乙酰胆碱受体和GABAA型受体等等。之前,我们实验室报道了KCNMA1基因上的一个突变p.D434G可以导致全身性癫痫和阵发性运动障碍（GEPD）,第一次把KCNMA1基因和癫痫关联了起来。KCNMA1基因编码的BK通道是一种可以同时被钙离子和电压激活的大电导钾离子通道。BK通道广泛表达于机体的各种组织和细胞中,参与了许多重要的生理过程,比如神经递质的释放,平滑肌的收缩和耳蜗毛细胞的调谐等等。BK通道的电压敏感器位于S4跨膜片段,钙离子敏感位点存在于胞质内的两个RCK结构域中。p.D434G突变导致GEPD的分子机制是,它通过提高BK通道的钙离子敏感性进而增强了通道的激活特性。本次研究中,我们一共收集到了四个KCNMA1基因的突变,c.2984A>G（p.N995S）、c.3476A>G（p.N1159S）、c.1967A>C（p.E656A）和c.1554G>T（p.K518N）,它们分别是从五名相互独立的癫痫患者中被鉴定出来的,这些病人没有阵发性运动障碍。其中c.2984A>G（p.N995S）这个突变分别以新发突变（de novo mutation）的形式发生在两个独立的癫痫患者中,从遗传学的角度而言,强力支持该突变和癫痫存在关联。然而,突变基因的功能研究对于判断一个突变到底是否能够致病尤为重要,所以我们把这些突变分别引入到BK通道的表达质粒上,然后转染到HEK293细胞中进行表达,运用膜片钳技术,通过记录宏观电流和单通道电流来研究这些突变型通道的电生理性质,从而揭示BK突变导致癫痫的分子机制。结果表明,在10μM的胞内钙离子浓度下,p.N995S突变可以使BK通道的激活GV曲线朝着负电压的方向偏移59 mV,但是另外三个突变对BK通道的功能并没有影响。而且,在BK通道的β4亚基存在的情况下,p.N995S突变依然可以使BK通道的激活GV曲线朝着负电压的方向偏移71 mV。这说明了p.N995S这个突变应该是通过增强BK通道的激活特性引发癫痫,而另外三个突变只是良性的变异,和癫痫之间应该没有什么关联。考虑到之前的p.D434G突变是通过增加通道的钙离子敏感性来增强通道的激活特性,并且p.N995S突变位于通道的RCK2结构域,所以我们接下来对p.N995S突变型通道的钙离子敏感性进行了研究。结果表明,p.N995S突变对BK通道激活的增强程度在不同的钙离子浓度下是类似的,并且当通道的钙离子结合位点被突变掉之后（p.2D2A/p.5D5N）,p.N995S依然可以增强通道的激活特性。这些结果说明了p.N995S突变并不影响BK通道的钙离子敏感性。之后,我们通过分析单通道电流,发现p.N995S突变可以增加BK通道的单通道开放机率和单通道开放驻留时间。从我们的实验数据推测出,p.N995S可以增强BK通道的电压激活和孔道开关之间的变构耦合作用,并且可以稳定通道的开放态构象。另外,BK通道的选择性抑制剂蕈青霉素对野生型和p.N995S突变型通道皆有阻断作用,这个结果指出了BK通道的抑制剂可以被用来设计药物,治疗那些由BK通道活性异常增强而导致的癫痫。总结,我们在BK通道上鉴定出了可以引起癫痫的第一个新发突变p.N995S。与之前的p.D434G突变相比,携带p.N995S突变的患者只表现出癫痫,并没有阵发性运动障碍。虽然这两个突变都可以增强BK通道的激活特性,但是却有着不同的分子机制。p.D434G突变是通过增加钙离子敏感性来增强通道的激活特性,而p.N995S突变是通过增加单通道开放机率和单通道开放驻留时间来增强通道的激活特性,并且p.N995S突变不影响通道的钙离子敏感性。我们的研究结果进一步验证了BK通道和癫痫的相关性,为癫痫的遗传诊断提供了理论依据,并且指出了电生理研究对于判断通道突变是否致病的重要性。我们建议,可以把BK通道作为药物靶点,从BK通道的抑制剂中来筛选设计抗癫痫药物,另外可以把p.N995S突变当作工具来研究BK通道的结构和门控机制。
二、hERG通道细胞外侧S5-P环点突变对该通道的门控特性和离子通透性的变构影响(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、hERG通道细胞外侧S5-P环点突变对该通道的门控特性和离子通透性的变构影响(英文)（论文提纲范文）
（1）基于冷冻电镜的离子通道门控调节机制分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 离子通道综述 |
| 1.1 电压门控离子通道 |
| 1.1.1 电压门控钾通道 |
| 1.1.2 电压门控钠通道 |
| 1.1.3 电压门控钙通道 |
| 1.2 配体门控离子通道 |
| 1.2.1 五聚体配体门控离子通道 |
| 1.2.2 四聚体配体门控离子通道 |
| 1.2.3 三聚体配体门控离子通道 |
| 1.3 机械门控离子通道 |
| 1.4 课题目的与意义 |
| 工作一 内向整流钾通道KAT1超极化激活机制分析 |
| 第2章 KAT1蛋白背景介绍 |
| 2.1 植物中钾离子通道简介 |
| 2.2 KAT1通道功能与生理作用 |
| 2.3 KAT1研究进展 |
| 2.4 超极化激活HCN1通道介绍 |
| 2.5 本课题意义 |
| 第3章 KAT1表达纯化优化及结构解析 |
| 3.1 KAT1克隆及病毒扩增 |
| 3.1.1 KAT1分子克隆以及重组质粒构建 |
| 3.1.2 用于转染昆虫sf9细胞的KAT1病毒扩增 |
| 3.2 KAT1蛋白纯化过程 |
| 3.3 KAT1纯化条件优化 |
| 3.4 KAB1辅助蛋白 |
| 3.5 KAT1-KAB1冷冻电镜数据收集与处理 |
| 3.6 KAT1-KAB1模型搭建 |
| 3.7 电生理功能实验对通道功能进行验证 |
| 3.7.1 KAT1转染HEK293T细胞实验流程 |
| 3.7.2 HEK293T记录KAT1电流实验流程 |
| 第4章 KAT1结构分析与讨论 |
| 4.1 KAT1整体结构 |
| 4.1.1 KAB1对KAT1功能验证 |
| 4.1.2 KAT1整体结构 |
| 4.2 KAT1选择性过滤器和孔道结构域分析 |
| 4.2.1 KAT1钾离子选择性的结构基础 |
| 4.2.2 KAT1的孔道区处于关闭状态 |
| 4.3 KAT1电压感受结构域分析 |
| 4.3.1 KAT1处于去极化状态 |
| 4.3.2 KAT1中S4螺旋的电荷分布 |
| 4.4 KAT1电压感受结构域与孔道结构域的偶联 |
| 4.5 KAT1超极化激活模型 |
| 4.6 本课题小结 |
| 工作二 蛇毒多肽Mamba1结合并抑制人源酸敏感离子通道ASIC1a机制分析 |
| 第5章 酸敏感离子通道ASIC背景介绍 |
| 5.1 酸敏感离子通道ASIC生理意义 |
| 5.1.1 ASIC通道的分类和分布 |
| 5.1.2 ASIC通道生理意义 |
| 5.2 ASIC通道的药理学研究 |
| 5.2.1 神经肽 |
| 5.2.2 有机化合物 |
| 5.2.3 二价和三价阳离子 |
| 5.2.4 动物毒素多肽 |
| 5.3 ASIC通道目前结构研究进展 |
| 5.4 本课题意义 |
| 第6章 hASIC1a表达纯化优化及结构解析 |
| 6.1 hASIC1a克隆及病毒扩增 |
| 6.1.1 hASIC1a分子克隆以及重组质粒构建 |
| 6.1.2 用于转染昆虫sf9细胞的hASIC1a病毒扩增 |
| 6.2 hASIC1a蛋白纯化及Mamba1-hASIC1a复合物组装过程 |
| 6.3 hASIC1a~(△C)及复合物结构解析尝试 |
| 6.3.1 晶体法解析hASIC1a~(△C)及复合物结构 |
| 6.3.2 冷冻电镜解析hASIC1a~(△C)及复合物结构 |
| 6.4 hASIC1a~(△C)及hASIC1a~(△C)-Mamba1冷冻电镜数据收集与处理 |
| 6.5 hASIC1a~(△C)及hASIC1a~(△C)-Mamba1模型搭建 |
| 6.6 电生理功能实验对蛋白功能进行验证 |
| 6.6.1 hASIC1a转染CHO细胞实验流程 |
| 6.6.2 CHO记录hASIC1a电流流程 |
| 第7章 hASIC1a结构分析与讨论 |
| 7.1 hASIC1a~(△C)结构分析 |
| 7.1.1 hASIC1a~(△C)整体结构 |
| 7.1.2 hASIC1a处于静息状态 |
| 7.2 hASIC1a~(△C)-Mamba1结构分析 |
| 7.3 Mamba1将hASIC1a锁定在关闭构象 |
| 7.4 Mamba1对hASIC1a和cASIC1抑制效果不同机制研究 |
| 7.5 本课题小结 |
| 第8章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（2）SCN5A突变参与心肌致密化不全心律失常发生的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| (一) LVNC合并发生心律失常的发病机制研究现状 |
| (二) 心脏SCN5A钠通道亚型与抗心律失常药物 |
| (三) SCN5A钠通道结构简介 |
| (四) SCN5A基因变异与心肌病 |
| 研究目的 |
| 研究方法 |
| (一) 实验试剂与仪器 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器 |
| 3. 主要试剂配制方法 |
| 4. PH值的调节 |
| 5. 器械准备 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 心肌组织样本收集 |
| 2. 心肌组织的获取及保存 |
| 3. 构建Nav1.5突变体分子克隆 |
| 4.质粒小量抽提实验 |
| 5. 质粒中量抽提实验 |
| 6. 常规细胞的培养、冻存、复苏和转染 |
| 7. Nav1.5 WT及mutants过表达腺病毒载体包装及感染 |
| 8. 制备石蜡切片 |
| 9. 免疫组织化学染色 |
| 10. 细胞免疫荧光 |
| 11. 组织蛋白的提取 |
| 12. BCA法蛋白浓度测定 |
| 13. Western blot检测 |
| 14. 人心肌细胞培养与复苏(用于膜片钳电生理实验) |
| 15. 腺病毒感染CardioEasy(?)人心肌细胞 |
| 16. 多功能干细胞诱导的人心肌细胞的搏动频率及胞外场电位的检测 |
| 17. 全细胞电生理记录 |
| (三) 数据处理与分析 |
| (四) 实验整体流程图 |
| 研究结果 |
| (一) Western blot分析Nav1.5蛋白在正常组和LVNC组、HCM组、ARVC组心肌组织中蛋白水平的表达量 |
| (二) 细胞免疫荧光分析iPS-CM细胞中Nav1.5蛋白的表达和定位 |
| (三) 免疫组织化学分析正常和LVNC心肌组织中Nav1.5蛋白的表达和定位 |
| (四) SCN5A基因在LVNC患者人群中的基因变异研究 |
| (五) SCN5A过表达腺病毒重组载体的酶切鉴定及测序分析 |
| (六) SCN5A突变通道电生理功能研究(表达于CHO-K1细胞) |
| 1. 突变通道影响野生型钠通道的激活功能 |
| 2. 突变通道影响野生型钠通道的快失活功能 |
| 3. 突变通道影响野生型钠通道的慢失活功能 |
| 4. 突变通道影响野生型钠通道的恢复功能 |
| (七) LVNC相关的SCN5A突变通道电生理功能研究(ips-CM) |
| 1. 突变通道造成iPS-CM细胞上表达的Nav1.5通道的激活功能改变 |
| 2.突变通道影响iPS-CM细胞上Nav1.5通道的快失活功能 |
| 3. 突变通道影响iPS-CM细胞上表达的Nav1.5通道的慢失活功能 |
| 4. 突变通道影响iPS-CM细胞上表达的Nav1.5通道的恢复功能 |
| (八) SCN5A突变通道影响ips-CM细胞的收缩力与场电位的发放频率 |
| 1. 突变通道造成人干细胞诱导的心肌细胞收缩能力增强 |
| 2. 突变通道造成人干细胞诱导的心肌细胞场电位发放频率增加 |
| 3. 突变通道造成人干细胞诱导的心肌细胞场电位时程缩短 |
| 讨论 |
| 结论与创新性 |
| 参考文献 |
| 图表索引 |
| 附录1: SCN5A CDS序列 |
| 文献综述：心脏钠通道基因SCN5A突变临床表型多样性研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）抗肿瘤19肽对细胞膜离子通道的影响及心脏安全初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肿瘤抑素-抗肿瘤19肽 |
| 1.2 生物活性肽的嵌膜机制 |
| 1.3 膜片钳技术及在活性肽嵌膜机制研究中的应用 |
| 1.4 离子通道类型及一些基本特征 |
| 1.5 离子通道与细胞凋亡 |
| 1.6 hERG钾通道与心脏疾病 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 第二章 抗肿瘤19肽蛋白的表达、纯化与复性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 19肽对SMMC-7721和家兔心室肌细胞膜离子通道影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 抗肿瘤19肽对hERG通道的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）红头蜈蚣毒素RhTx2调节TRPV1离子通道的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 主要溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 毒液收集,毒素纯化和蛋白质测序 |
| 2.2 建立cDNA文库和DNA分子克隆 |
| 2.3 毒素合成,重折叠和HPLC纯化 |
| 2.4 质粒转化和提取 |
| 2.5 细胞培养和转染 |
| 2.6 电生理实验 |
| 2.7 分子对接 |
| 2.8 数据统计和分析 |
| 实验结果 |
| 1 红头蜈蚣毒素RhTx2的分离和鉴定 |
| 1.1 RhTx2的分离 |
| 1.2 RhTx2的鉴定 |
| 1.3 RhTx2合成肽 |
| 1.4 RhTx2蛋白构象模拟 |
| 2 RhTx2对TRPV1通道的功能具有很强的调节性 |
| 2.1 RhTx2激活TRPV1通道 |
| 2.2 RhTx2在胞外起作用 |
| 2.3 RhTx2的激活作用不能被辣椒平抑制 |
| 2.4 Rh Tx2对TRPV1的激活曲线比RhTx右移 |
| 2.5 RhTx2使TRPV1通道快速脱敏 |
| 2.6 RhTx2对TRPV1具有选择性 |
| 3 RhTx2使TRPV1通道脱敏的机制 |
| 4 RhTx2结合TRPV1通道的潜在结构 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（5）Junctophilin2 MORN结构域对心肌小电导钙激活钾通道膜转运的调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分:JP2蛋白与SK2通道相互作用区域的验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分:JP2 MORN结构域Ⅰ增加细胞膜SK2 通道的表达和定位 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分:JP2 MORN结构域Ⅰ调控细胞膜SK2 通道表达的机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 钾离子通道转运在相关疾病中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 读博期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）Y403位点影响hERG钾通道门控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 离子通道简介 |
| 1.2 钾通道简介 |
| 1.2.1 钾通道分类 |
| 1.3 hERG钾通道 |
| 1.3.1 编码hERG钾通道的基因序列及hERG钾通道蛋白 |
| 1.3.2 hERG钾通道在筛选药物化合物方面的作用 |
| 1.3.3 黄连作用于hERG钾通道失活过程来治疗心律失常 |
| 1.3.4 hERG钾通道的失活与去激活 |
| 2 本研究介绍 |
| 2.1 研究内容 |
| 2.2 研究目的与意义 |
| 2.3 常用实验材料及实验方法 |
| 2.3.1 离子通道突变体的构建 |
| 2.3.2 获得转染hERG及突变体的细胞 |
| 2.3.3 膜片钳实验 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Y403A,S631A单突变对hERG钾通道的影响 |
| 3.1.1 Y403A,S631A单突变对hERG钾通道去激活过程的影响 |
| 3.1.2 Y403A,S631A单突变对hERG钾通道激活电压依赖性的影响 |
| 3.1.3 Y403A,S631A单突变对hERG钾通道激活动力学的影响 |
| 3.1.4 小结与讨论 |
| 3.2 Y403AS631A双突变对hERG钾通道的影响 |
| 3.2.1 Y403AS631A双突变对hERG钾通道去激活过程的影响 |
| 3.2.2 Y403AS631A双突变对hERG钾通道失活恢复动力学的影响 |
| 3.2.3 Y403AS631A双突变对hERG钾通道激活电压依赖性的影响 |
| 3.2.4 Y403AS631A双突变对hERG钾通道激活动力学的影响 |
| 3.2.5 小结与讨论 |
| 3.3 Y403AS631A双突变去除N端氨基酸链对hERG钾通道的影响 |
| 3.3.1 Y403AS631A双突变去除N端氨基酸链对hERG钾通道去激活过程的影响 |
| 3.3.2 Y403AS631A双突变去除N端氨基酸链对hERG钾通道失活恢复动力学的影响 |
| 3.3.3 Y403AS631A双突变去除N端138-373氨基酸链对hERG钾通道激活电压依赖性的影响 |
| 3.3.4 Y403AS631A双突变去除N端138-373氨基酸链对hERG钾通道激活动力学的影响 |
| 3.3.5 小结与讨论 |
| 3.4 S6结构域对hERG钾通道的影响 |
| 3.4.1 S6结构域突变对hERGY403AS631A双突变通道激活的电压依赖性的影响 |
| 3.4.2 hERGY403AS631AQ664A对hERG钾通道去激活过程的影响 |
| 3.4.3 hERGY403AS631AQ664A对hERGY403AS631A双突变通道失活恢复动力学的影响 |
| 3.4.4 S6结构域对hERGY403AS631A双突变通道激活动力学的影响 |
| 3.4.5 小结与讨论 |
| 4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）S1区对人类hERG通道失活的调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.文献综述 |
| 1.1 离子通道 |
| 1.2 钾离子通道 |
| 1.2.1 钾离子通道的分类 |
| 1.3 电压门控钾离子通道(KV) |
| 1.3.1 电压门控钾离子通道的结构 |
| 1.3.2 电压门控性钾离子通道的失活 |
| 1.4 hERG钾离子通道 |
| 1.4.1 hERG钾离子通道的结构和功能 |
| 1.4.2 hERG钾离子通道的失活 |
| 1.4.3 N-末端在hERG通道门控中的作用 |
| 1.4.4 S1 区在hERG通道门控中的作用 |
| 1.5 本研究介绍 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究目的与意义 |
| 2.常用实验材料及实验方法 |
| 2.1 分子实验 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 实验药品和试剂 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.1.4 实验相关试剂配制方法 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 细胞实验 |
| 2.2.1 实验细胞株 |
| 2.2.2 实验药品和试剂 |
| 2.2.3 实验仪器和设备 |
| 2.2.4 实验相关试剂配制方法 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.3 膜片钳实验 |
| 3.单突变对hERG通道的影响 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 实验细胞和质粒 |
| 3.1.2 实验药品和试剂 |
| 3.1.3 实验仪器和和设备 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 S1 区位点突变对hERG通道激活的电压依赖性的影响 |
| 3.2.2 S1 区位点突变对hERG通道激活动力学的影响 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 4.双突变对hERG通道的影响 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.1.1 实验细胞和质粒 |
| 4.1.2 实验药品和试剂 |
| 4.1.3 实验仪器和和设备 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 双突变对hERG通道激活的电压依赖性的影响 |
| 4.2.2 双突变对hERG通道激活动力学的影响 |
| 4.2.3 双突变对hERG通道失活速率的影响 |
| 4.2.4 双突变对hERG通道失活恢复速率的影响 |
| 4.2.5 双突变对hERG通道复活的影响 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 5.N-端截短对双突变hERG通道的影响 |
| 5.1 实验材料和方法 |
| 5.1.1 实验细胞和质粒 |
| 5.1.2 实验药品和试剂 |
| 5.1.3 实验仪器和和设备 |
| 5.1.4 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 N-端截短对hERG双突变通道激活的电压依赖性的影响 |
| 5.2.2 N-端截短对双突变hERG通道激活动力学的影响 |
| 5.2.3 N-端截短对hERG双突变通道失活速率的影响 |
| 5.2.4 N-端截短对hERG双突变通道失活恢复速率的影响 |
| 5.2.5 N-端截短对hERG双突变通道复活的影响 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 6.结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）包含β2亚基nAChR点突变体构建及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 烟碱型乙酰胆碱受体结构 |
| 1.2 包含β亚基的nAChRs药理学研究进展 |
| 1.2.1 包含β2亚基nAChRs药理作用研究 |
| 1.2.2 包含β4亚基nAChR药理作用研究 |
| 1.3 配体与nAChR相互作用研究 |
| 1.3.1 激动剂与nAChR相互作用的研究 |
| 1.3.2 拮抗剂与nAChR相互作用的研究 |
| 1.4 定点突变技术在受体功能研究中的进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验试剂和溶液配制 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 应用软件 |
| 2.2 β2、β4亚基之间的序列对比 |
| 2.3 突变体引物的设计与合成 |
| 2.4 PCR介导的定点突变 |
| 2.4.1 模板质粒的提取 |
| 2.4.2 PCR扩增 |
| 2.4.3 PCR产物的转化 |
| 2.4.4 突变体质粒提取及鉴定 |
| 2.5 受体及突变体RNA的制备 |
| 2.5.1 受体、突变体质粒的提取 |
| 2.5.2 受体质粒模板的酶切及纯化 |
| 2.5.3 受体及突变体基因体外转录 |
| 2.5.4 受体及突变体cRNA纯化 |
| 2.6 nAChR及突变体在非洲爪蟾卵母细胞表达模型的构建 |
| 2.6.1 非洲爪蟾卵母细胞的获取 |
| 2.6.2 显微注射 |
| 2.6.3 受体及突变体活性的检测 |
| 2.7 配体与突变体相互作用分子机制的研究 |
| 2.7.1 激动剂ACh与突变体相互作用的研究 |
| 2.7.2 拮抗剂α-CTx的制备 |
| 2.7.3 拮抗剂α-CTx LvIA和RegIIA对突变体相互作用的研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 β2亚基定点突变结果 |
| 3.1.1 模板质粒提取 |
| 3.1.2 PCR介导的β2亚基定点突变 |
| 3.1.3 突变体质粒提取和鉴定 |
| 3.1.4 突变体cRNA的制备和纯化 |
| 3.2 激动剂与α3β2 nAChR突变体相互作用的研究 |
| 3.3 拮抗剂与α3β2 nAChR突变体相互作用的研究 |
| 3.3.1 α-CTx LvIA和RegIIA的合成、纯化和鉴定 |
| 3.3.2 α-CTx LvIA与受体突变体相互作用的研究 |
| 3.3.3 α-CTx RegIIA与受体突变体相互作用的研究 |
| 3.3.4 α-CTx LvIA、RegIIA与受体突变体结合活性研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 定点突变技术中问题与解决方法 |
| 4.2 nAChR与激动剂ACh的结合作用 |
| 4.3 nAChR与拮抗剂α-CTx的结合作用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）机械门控Piezo1通道激动剂的发现与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 机械感受与生命活动息息相关 |
| 1.2 机械门控离子通道的研究概述 |
| 1.2.1 原核生物大肠杆菌中的机械门控离子通道 |
| 1.2.2 低等真核生物中的机械门控离子通道 |
| 1.2.3 哺乳动物中的机械门控离子通道 |
| 1.2.4 机械门控离子通道研究思路与方法 |
| 1.3 机械门控Piezo通道的研究进展 |
| 1.3.1 Piezo蛋白家族的发现 |
| 1.3.2 Piezo通道的电生理学特性 |
| 1.3.3 Piezo通道的结构 |
| 1.3.4 Piezo通道的离子通透 |
| 1.3.5 Piezo通道的门控机制 |
| 1.3.6 Piezo通道的调控分子 |
| 1.3.7 Piezo通道的生理功能 |
| 1.3.8 Piezo通道与人类疾病 |
| 1.3.9 Piezo通道作为潜在的药物靶点 |
| 1.4 机械门控Piezo通道门控机制研究目的与策略 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 分子实验 |
| 2.1.2 细胞实验 |
| 2.1.3 生化和功能实验 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 分子克隆 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 蛋白表达 |
| 2.3.4 蛋白纯化 |
| 2.3.5 生化鉴定 |
| 2.3.6 细胞表面生物素化反应 |
| 2.3.7 高通量实时荧光检测 |
| 2.3.8 单细胞钙成像 |
| 2.3.9 表面等离子共振实验 |
| 2.3.10 化学交联质谱法 |
| 2.3.11 膜片钳 |
| 第3章 小分子化合物Jedi激活Piezo1 通道 |
| 3.1 高通量筛选出Jedi |
| 3.1.1 高通量筛选体系的建立与优化 |
| 3.1.2 筛选化合物、毒素及抗体库的收集 |
| 3.2 Jedi激活Piezo1 的特性研究 |
| 3.2.1 Jedi激活Piezo1 引起钙内流 |
| 3.2.2 Jedi激活Piezo1 通道产生电流 |
| 3.2.3 Jedi调节Piezo1 通道的机械敏感电流 |
| 3.2.4 Jedi作用效果的表征EC50 |
| 3.3 Jedi化合物分子结构的优化与功能鉴定 |
| 3.3.1 Jedi结构的修饰与改造 |
| 3.3.2 Jedi结构改造后的功能验证 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 Jedi结合到Piezo1 的机械传导模块 |
| 4.1 小分子化合物与蛋白结合体系的建立 |
| 4.2 Jedi结合到Piezo的1-2190 片段 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第5章 Jedi作用机制的研究 |
| 5.1 胞外区657-677和870-921对Jedi激活Piezo1 至关重要 |
| 5.1.1 胞外区删除的Piezo1 通道表达正常且上膜 |
| 5.1.2 Jedi不能激活胞外区删除的Piezo1 通道 |
| 5.1.3 胞外区删除的Piezo1 通道蛋白的纯化与鉴定 |
| 5.1.4 Jedi能结合胞外区删除的Piezo1 蛋白 |
| 5.2 横梁区L1342和L1345 位点对Jedi激活Piezo1 至关重要 |
| 5.2.1 横梁区序列的确定 |
| 5.2.2 横梁区重要氨基酸的突变与功能检测 |
| 5.2.3 L1342和L1345 突变体表达正常且上膜 |
| 5.2.4 Jedi不能引起L1342和L1345 突变的Piezo1 通道钙内流 |
| 5.2.5 Jedi不能调节L1342和L1345 突变的Piezo1 通道电流 |
| 5.2.6 Jedi能结合L1342和L1345 突变的Piezo1 通道蛋白 |
| 5.3 Piezo1 通道拥有类似杠杆作用机制的机械传导通路 |
| 5.3.1 胞外区657-677和870-921 影响Piezo1 通道的机械传导 |
| 5.3.2 横梁区L1342和L1345 位点影响Piezo1 通道的机械传导机制 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 论文展望 |
| 6.2.1 Jedi作用的分子机制的进一步探究 |
| 6.2.2 Piezo机械传导机制和通路的深入研究 |
| 6.2.3 基于Piezo结构的新型激动剂和抑制剂的筛选 |
| 6.2.4 Piezo通道门控和离子通透机制的体外研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（10）BK通道中与癫痫相关的新发突变对通道功能影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 癫痫简介 |
| 1.2 离子通道概述 |
| 1.3 BK通道概述 |
| 2 实验技术 |
| 2.1 HEK293细胞的培养、转染和滴片 |
| 2.2 分子生物学技术 |
| 2.3 膜片钳技术 |
| 3 BK通道中与癫痫相关的新发突变对通道功能影响的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法和材料 |
| 3.3 实验结果和分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 全文总结及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
四、hERG通道细胞外侧S5-P环点突变对该通道的门控特性和离子通透性的变构影响(英文)（论文参考文献）
- [1]基于冷冻电镜的离子通道门控调节机制分析[D]. 李思宇. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [2]SCN5A突变参与心肌致密化不全心律失常发生的分子机制研究[D]. 李艳芬. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]抗肿瘤19肽对细胞膜离子通道的影响及心脏安全初探[D]. 赵长胜. 吉林农业大学, 2020
- [4]红头蜈蚣毒素RhTx2调节TRPV1离子通道的作用机制研究[D]. 竺爱琴. 青岛大学, 2020(01)
- [5]Junctophilin2 MORN结构域对心肌小电导钙激活钾通道膜转运的调控[D]. 罗天霞. 郑州大学, 2020(02)
- [6]Y403位点影响hERG钾通道门控机制的研究[D]. 郄艮朝. 浙江农林大学, 2019
- [7]S1区对人类hERG通道失活的调控机制[D]. 孟佳. 浙江农林大学, 2019(01)
- [8]包含β2亚基nAChR点突变体构建及功能研究[D]. 张璐. 海南大学, 2019(06)
- [9]机械门控Piezo1通道激动剂的发现与机制研究[D]. 王燕峰. 清华大学, 2018(04)
- [10]BK通道中与癫痫相关的新发突变对通道功能影响的研究[D]. 李夏. 华中科技大学, 2018(05)