一、人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究（论文文献综述）
韩梅[1]（2021）在《绵羊皮肤前体细胞分离培养》文中研究指明绵羊皮肤前体细胞（Skin-Derived Precursor Cells,SKPs）是一类位于真皮中具有自我更新能力,表达干细胞标志物具有多向分化潜能的前体细胞。已有科研人员采用急性酸胁迫体外处理成纤维细胞成功快速分离获得大量SKPs,并命名为p H-SKPs。这种分离方法为更加简便和快速地获得绵羊SKPs提供了新途径。但是目前尚未报道绵羊p H-SKPs的分离培养。因此,本研究采用组织块贴壁法从绵羊耳组织中分离获得成纤维细胞;P3代成纤维细胞通过汉克斯平衡盐（p H 5.7）急性酸胁迫处理15 min获得p H-SKPs;通过形态学观察、反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）和免疫荧光技术对成纤维细胞和p H-SKPs进行鉴定;在含15%胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS）的杜氏改良Eagle培养基-高葡萄糖（Dulbecco’s Modified Eagle Medium-High Glucose,DMEM）中诱导p H-SKPs分化为成纤维细胞;基于10×Genomics平台,采用单细胞转录组测序（Single-cell RNA-sequencing,sc RNA-seq）技术对p H-SKPs建库测序进一步鉴定。1.采用组织块贴壁法获得的绵羊成纤维细胞呈典型的梭形,酸胁迫处理成纤维细胞获得的p H-SKPs呈球形并悬浮生长。RT-PCR检测发现成纤维细胞中表达成纤维细胞特异性基因Vimentin;p H-SKPs中表达多能性标记基因NANOG、OCT4和SOX2,神经嵴标记基因PAX3和Nestin以及成纤维细胞标志基因Vimentin。免疫荧光检测发现成纤维细胞中成纤维细胞标志蛋白Fibronectin和Vimentin呈阳性表达,表明分离的细胞具有成纤维细胞特性;p H-SKPs中干细胞标志蛋白SOX2、NANOG和OCT4呈阳性表达,表明p H-SKPs具有干细胞特性;p H-SKPs分化后的细胞表达Vimentin基因和标志蛋白Vimentin,表明其具有分化为成纤维细胞的特性。2.pH-SKPs样本聚类为7个细胞亚群。SKPs标志基因SNAI1、SNAI2和SOX9在cluster0、cluster1、cluster2、cluster4、cluster5和cluster6中均有少量细胞低表达,成纤维细胞标志基因FAP和FBLN1在cluster3中较高表达,成肌细胞的标志基因ID1在cluster6中少量细胞较高表达;推测cluster1、cluster2和cluster5为细胞干性较强的p H-SKPs,cluster3开始分化为成纤维细胞,cluster6有分化为成肌细胞的潜能或者开始分化为成肌细胞。成纤维细胞和p H-SKPs两个样本的差异表达基因的KEGG主要富集在ECM-受体相互作用通路、黏着斑通路和细胞凋亡等通路,推测通过COL1A1、MYLK、FN1、IFI30和ATF4等基因调节ECM-受体相互作用通路、黏着斑通路和细胞凋亡等通路抑制成纤维细胞的生长,加速成纤维细胞中的少量SKPs增殖生长。本研究成功建立了绵羊成纤维细胞和pH-SKPs体外培养体系,鉴定获得了可稳定传代、状态良好的成纤维细胞和p H-SKPs,发现了p H-SKPs具有异质性,进一步明确了p H-SKPs的特性。为更优地将p H-SKPs应用于绵羊干细胞体外分化试验、体细胞核移植技术和优良品种的快速扩繁奠定了基础性工作。
盘婕[2]（2021）在《萨能奶山羊耳缘成纤维细胞分离培养及抗衰老研究》文中研究指明我国拥有丰富的畜禽遗传资源,畜禽遗传资源的保护和利用是国家种业创新,保护生物多样性、农业安全和生态安全的重要保证。在动物体细胞克隆技术不断发展和成熟的情况下,体细胞遗传资源保护和利用受到越来越多的关注。体细胞遗传资源的保护和利用对于优良家畜的扩繁、育种以及濒危动物的挽救和种质资源的保护都具有重要意义。亚精胺（Spermidine）是一种广泛分布于生物体内的多胺化合物,参与调控细胞生长和增殖、组织再生、DNA和RNA稳定、酶促调节反应、翻译调节、抗氧化、抗炎和自噬等多种生物学过程,其可通过诱导自噬基因相关转录物的显着上调,从而增强细胞自噬作用,改善细胞老化状态,延长生物体的寿命。本研究对萨能奶山羊耳缘皮肤组织进行体细胞分离和培养,利用亚精胺处理分离培养的奶山羊成纤维细胞,进行体细胞抗衰老方面的研究,旨在为奶山羊遗传资源的保护和利用提供技术积累和支撑。研究结果如下:1.试验使用组织块贴壁法成功分离培养奶山羊成纤维细胞并根据细胞传代时不同细胞胰蛋白酶敏感性的不同进行了细胞纯化。使用免疫荧光染色对纯化后的细胞进行成纤维细胞特异性标记物Vimentin的检测,结果显示细胞Vimentin呈阳性且纯度达到98.3%。通过上述试验成功获得了高纯度的奶山羊成纤维细胞。随后对奶山羊成纤维细胞进行了生物学特性研究,包括细胞生长曲线绘制、核型分析、微生物污染检测。使用细胞计数法绘制的细胞生长曲线呈“S”型,最大细胞增殖数目为1.33×105,观察细胞生长状况良好;核型分析结果显示染色体数目为2n=60,包括29对常染色体和1对性染色体,性染色体为XY型;微生物污染检测结果表明细胞未受到细菌、真菌及支原体污染。不同代数的成纤维细胞形态观察结果发现,随着传代次数的增加,细胞生长状态变差,细胞形态变得扁平且体积增大,老化现象明显。上述试验结果表明分离培养的奶山羊成纤维细胞状态良好且稳定可用于后续的利用,但随着传代次数的增加出现了细胞老化现象。2.对分离培养获得的奶山羊成纤维细胞,进行传代培养和D-Gal诱导衰老,分别设置P5（传代5代）、P13（传代13代）自然衰老组和D-Gal诱导衰老组3个组,以亚精胺处理P5和P13组细胞,分别处理24h和48h,并对培养的各组细胞进行细胞老化水平的检测,包括细胞衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性染色率、端粒长度、衰老相关基因p21、p53 m RNA表达水平、活性氧水平、周期G0/G1期比例和衰老相关分泌表型（SASP）。结果显示亚精胺处理组细胞的SA-β-Gal阳性染色率、衰老相关基因p21、p53 m RNA表达水平、活性氧水平、周期G0/G1期比例、衰老相关分泌表型较对照组显着降低,端粒长度较对照组显着升高。表明亚精胺处理改善了奶山羊成纤维细胞的老化状态。本研究成功分离培养了萨能奶山羊耳缘成纤维细胞,并通过亚精胺处理延缓了细胞的衰老,有利于萨能奶山羊体细胞遗传资源的保护和利用。
卞媛媛[3]（2021）在《脂肪间充质干细胞联合窄谱中波紫外线对小鼠白癜风模型及内质网应激信号通路的作用研究》文中进行了进一步梳理目的:白癜风是临床上常见的色素脱失性疾病,主要累及功能性表皮色素细胞和毛囊黑色素细胞,以皮肤乳白色的斑点或斑片为主要临床表现特征,常常累及头、面、颈、躯干、四肢等多个部位。白癜风的病理发生机制尚不清楚,有多个相关假说,其中最为常见的包括自身免疫性调节学说、氧化应激学说、遗传变异学说以及细胞毒性作用学说。有研究表明内质网应激可导致黑色素细胞钙超载,异常或持久的氧化应激反应会导致大量的活性氧簇（ROS）及氧化产物蓄积,刺激内质网内环境发生紊乱,氧化-抗氧化失衡,并导致黑色素细胞的损伤。窄谱中波紫外线（NB-UVB）照射是目前治疗白癜风的首选。NB-UVB照射治疗可以抑制白癜风患者机体氧化应激反应,促进黑色素细胞功能恢复。但是针对强烈紫外线辐射下数十年可能会致癌的作用学术界已经达成共识。近年来研究通过共培养发现,黑色素细胞的增殖、分化及迁移都可以被脂肪来源干细胞诱导,优于黑色素细胞单独培养。Nrf2/HO-1信号通路是细胞对抗外源性物质及氧化损伤的重要作用途径,过量的ROS蓄积诱发氧化应激反应,Nrf2的活性被激活,与胞浆伴侣蛋白Keapl解偶联,通过多种蛋白激酶的磷酸化作用被转移至细胞核内,结合核内抗氧化元件ARE,启动下游HO-1、Trx-1等抗氧化分子表达使其发挥抗氧化作用。本研究旨在观察NB-UVB、脂肪间充质干细胞以及二者联合应用在小鼠白癜风模型中的疗效,检测氧化应激及内质网氧化应激相关指标的变化,探讨Nrf2/HO-1信号通路在黑色素细胞损伤及修复中的作用机制,为临床白癜风临床防治提供实验依据。研究方法:1、脂肪间充质干细胞联合NB-UVB对莫诺苯宗诱导白癜风小鼠的疗效观察C57BL/6小鼠50只,随机分为5个组:空白对照组（control组）,白癜风模型组（VIT组）,中波窄谱紫外照射组+白癜风模型组（VIT+NB-UVB组）;干细胞移植+白癜风模型组（VIT+AMSCs组）,干细胞移植+中波窄谱紫外照射+白癜风模型组（VIT+AMSCs+NB-UVB组）,每组10只;C57BL/6小鼠用电动剃毛器将背部局部剃毛,大小约2cm×2cm2,空白对照组在备毛区涂甘油膏,每次25mg,每日2次;白癜风模型组、中波窄谱紫外照射组+白癜风模型组、干细胞移植+白癜风模型组及干细胞移植+中波窄谱紫外照射+白癜风模型组于备毛区外涂40%莫诺苯宗,每次25mg,每日2次,在涂抹40%莫诺苯宗前,局部先予以无菌水清洁擦拭,每日给药时间固定为9点、17点,连续用药50天（第0天17点,第1天9点、17点,第2天9点、17点,第50天9点）,造模期间每3天小鼠涂药区剃毛一次,至皮肤色素脱失完成造模;以每平方厘米浓度5×106/ml浓度脂肪来源干细胞注射至皮下,勿贯穿皮肤。紫外线照射:波峰311nm,0.5J/cm2为起始剂量;每次剂量增加0.05～0.1J/cm2,3次/周,于造模30天后干预至50天。肉眼观察各组小鼠白癜风的治疗反应;HE染色观察小鼠皮肤病理组织学改变。2、脂肪间充质干细胞联合NB-UVB对白癜风小鼠模型内质网应激的影响实验动物分组同方法1,ELISA检测各组小鼠血清中氧化应激因子含量;免疫荧光检测组织中ROS释放水平;Western blot和PCR检测小鼠组织中内质网应激相关蛋白GRP78、caspase-12、SERCA2a表达;免疫荧光观察钙离子超载分布。3、脂肪间充质干细胞联合NB-UVB激活Nrf2/HO-1信号通路改善白癜风内质网应激损伤选用人表皮黑色素细胞,在细胞中添加500μmmol/L的H2O2作用24h模拟类白癜风的黑色素细胞损伤,将细胞分为i)对照组（control）、ii)模型组（VIT）、iii)模型+脂肪间充质干细胞移植+紫外照射组（VIT+AMSCs+NB-UVB组）、iv)模型+脂肪间充质干细胞移植+紫外照射组+Nrf2抑制剂ML385组（VIT+AMSCs+NB-UVB+ML385）组。采用Western blot法来检测各组小鼠表皮中Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白的表达;采用H2O2诱导黑素细胞建立氧化应激损伤细胞模型,ELISA法检测各组细胞上清液中SOD、MDA、MPO、TYR、MIF、MAO含量;采用Western blot法检测各组细胞中内质网应激相关蛋白GRP78、caspase-12、SERCA2a表达;免疫荧光观察钙离子情况。流式细胞仪检测小鼠外周血淋巴细胞CD4、CD8T亚群的构成。结果:1、脂肪干细胞培养及疗效观察:分离培养的AMSCs细胞7天后,有大量细胞贴壁生长,形成大小不一的细胞集落,细胞呈长梭形,经免疫荧光鉴定结果显示干细胞表面标记物CD90和CD45均呈阳性,成脂诱导,油红O染色鉴定细胞内有大量脂肪滴形成。对各组小鼠病灶区进行效果评价,空白对照组小鼠病灶区未见明显变化,评价有效率为0;VIT组小鼠病灶区呈苍白及白斑样,总有效率为10%;与VIT组相比,VIT+NB-UVB组及VIT+AMSCs组小鼠部分得到改善,总有效率分别达50%、40%;联合治疗组总有效率为70%。2、HE染色结果:VIT组脱色处及周围皮肤组织淋巴细胞浸润最明显,VIT+NB-UVB组及VIT+AMSCs组浸润均减少,而VIT+AMSCs+NB-UVB组仅有少量淋巴细胞浸润。流式细胞检测结果分析也符合上述表现,以CD3T作为参照,VIT组CD4T比例较其他四组最低（26.776±4.783）,CD8T比例最高（18.106±4.562,P<0.05）;VIT+NB-UVB组及VIT+AMSCs组,两组间CD4T、CD8T比例变化没有统计学差异;VIT+AMSCs+NB-UVB组较其他四组CD4T比例最高（34.183±0.635）,CD8T比例最低（14.383±1.557,P<0.05）。3、ELISA检测血浆中酪氨酸酶（TYR）、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、单胺氧化酶（MAO）含量检测:与空白对照组相比,VIT组小鼠血浆中MAO（25.94±3.41）、MIF（28.41±4.47）表达均升高,TYP表达降低（157.18±19.64,P<0.05）;与VIT组相比,VIT+NB-UVB组及VIT+AMSCs组则相反,血浆中MAO、MIF表达显着降低,TYP表达显着升高（P<0.05）,但两组间没有统计学差异;VIT+AMSCs+NB-UVB组与其他三组比较（除对照组）血浆中MAO（12.49±2.51）、MIF（16.79±2.28）表达明显减低,TYP表达显着升高（302.84±44.01,P<0.05）。4、ELISA法检测小鼠血清超氧化歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）表达情况:空白对照组相比,VIT组大鼠MDA（14.91±0.86）、MPO（1120.65±131.11）表达明显增高,SOD表达明显减少（23.25±2.27,P<0.05）;与VIT组相比,VIT+NB-UVB组及VIT+AMSCs组,MDA、MPO表达明显降低,SOD表达明显升高（P<0.05）;两组间比较没有统计学差异;VIT+AMSCs+NB-UVB组与其他三组比较（除对照组）MDA（8.72±0.42）、MPO（669.52±76.95）表达最低,SOD表达最高（57.74±2.75,P<0.05）。5、免疫荧光检测皮肤组织ROS检测:VIT组大鼠ROS荧光强度较对照组增强;与VIT组相比,VIT+NB-UVB组及VIT+AMSCs组,ROS荧光强度有所减弱;但VIT+AMSCs+NB-UVB组ROS荧光强度最低,提示ROS释放受到明显抑制。6、通过Western blot和PCR检测内质网应激相关蛋白GRP78、caspase-12、SERCA2a表达及m RNA表达:VIT组与对照组相比,SERCA2a的表达降低,GRP78、caspase-12表达升高（P<0.05）;VIT+NB-UVB组及VIT+AMSCs组与VIT组比较,则相反SERCA2a的表达升高,GRP78、caspase-12蛋白表达降低;而VIT+AMSCs+NB-UVB组与其两组比较,SERCA2a的表达升高,GRP78、caspase-12蛋白表达降低,组间比较具有统计学差异（P<0.05）。7、Western blot检测Nrf2/HO-1信号通路的表达:结果发现四组中,对照组Nrf2、HO-1、Trx-1表达最低（P<0.05）,VIT+NB-UVB组及VIT+AMSCs组表达明显优于VIT组（P<0.05）,但两组间无统计学差别;VIT+AMSCs+NB-UVB组较其他三组表达最高,组间比较具有统计学差异（P<0.05）。8、增加Nrf2/HO-1拮抗剂（ML385）ELISA检测黑素细胞上清液中TYR、MIF、MAO、SOD、MDA、MPO含量,结果与对照组相比,VIT组细胞上清液中MAO、MIF、MDA、MPO含量均明显升高,TYP、SOD表达明显降低（P<0.05）;与VIT组相比,VIT+AMSCs+NB-UVB组细胞上清液中MAO（12.29±2.85）、MIF（14.76±5.58）MDA（8.59±0.44）、MPO（526.91±61.28）含量显着降低,TYP（250.67±35.99）、SOD（40.76±3.42）含量显着升高,组间比较具有统计学差异（P<0.05）;与VIT+AMSCs+NB-UVB组相比,VIT+AMSCs+NB-UVB+ML385组中MAO（18.55±6.13）、MIF（25.95±2.94）、MDA（13.21±1.22）、MPO（876.75±79.00）含量升高,TYP（132.46±37.40）、SOD（20.39±2.34）含量降低,组间比较具有统计学差异（P<0.05）,提示具有拮抗作用。9、增加Nrf2/HO-1拮抗剂（ML385）Western blot法检测各组细胞中内质网应激相关GRP78、caspase-12、SERCA2a蛋白表达:结果发现与VIT组相比,VIT+AMSCs+NB-UVB组细胞中SERCA2a表达升高,GRP78、caspase-12表达降低（P<0.05）;但是VIT+AMSCs+NB-UVB+ML385组中SERCA2a表达较VIT+AMSCs+NB-UVB明显降低,GRP78、caspase-12表达升高（P<0.05）,提示发生拮抗作用。10、免疫荧光检测细胞中钙离子,结果VIT组细胞中钙离子荧光强度增加,钙离子超载严重;与VIT组相比,VIT+AMSCs+NB-UVB组钙离子荧光强度降低明显,钙离子超载受到抑制;与VIT+AMSCs+NB-UVB组相比,VIT+AMSCs+NB-UVB+ML385组中钙离子荧光强度有所增强。结论:1、AMSCs联合NB-UVB对白癜风小鼠的作用优于单独使用效果,对白癜风治疗有一定疗效。2、AMSCs联合NB-UVB可以抑制白癜风小鼠内质网应激损伤。3、AMSCs联合NB-UVB通过激活Nrf2/HO1通路调控内质网应激改善白癜风损伤
王明月[4]（2020）在《潞党参通过IL-15及其受体调控光老化小鼠皮肤炎症反应作用机制》文中指出目的:本研究通过观察中药潞党参对小鼠皮肤组织IL-6、TNF-α、IL-15及其受体、MAPK/ERK1/2信号通路、PI3K/Akt信号通路的影响。探讨潞党参调控小鼠皮肤光老化过程中的作用机制,为医美领域研发新的中药抗衰老产品提供新的实验依据。材料与方法:将90只SPF级昆明小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、潞党参高剂量组、潞党参中剂量组、潞党参低剂量组、VE对照组、Anti-IL-15组、MAPK抑制剂组、PI3K抑制剂组。除了空白对照组之外,其余8组均需进行光老化造模。造模采用UVA+UVB光源,即40w UVA灯管2根,40w UVB灯管2根,将4根灯管并列穿插安装到自制模拟日光箱中,照射小鼠背部皮肤制备光老化模型。用剃毛器将小鼠背部约为1.5×1.5cm2的长毛及绒毛剔除,每隔两至三日剃毛一次,将剃毛后的小鼠放入笼中,同时照射UVA、UVB。每周照射3次,共计14周。造模成功后,采用灌胃给药途径,连续给药4周,每日一次。空白对照组和模型对照组均灌注生理盐水,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）灌服不同浓度的潞党参,VE组灌服维生素E作为阳性对照物,Anti-IL-15组、MAPK抑制剂组、PI3K抑制剂组三组灌服相应的制剂。于第19周断颈处死全部小鼠,取下小鼠背部正中全层皮肤,置于冰箱内冷冻（-70℃）保存待测。酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠皮肤组织中IL-6、TNF-α、IL-15水平;免疫荧光法（IF）检测小鼠皮肤组织中IL-15、IL-15R水平以及IL-15与IL-15R共表达的情况;Western-blot法和免疫组化法（IHC）检测小鼠皮肤组织中IL-15、IL-15R、MAPK、P-MAPK、PI3K、P-PI3K、ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt的蛋白表达水平。结果:1光老化模型制备UVA辐照强度累计为261.79J/cm2,UVB辐照强度累计为6.54J/cm2,照射强度值均符合皮肤光老化动物实验的紫外线照射强度要求。照射14周后小鼠出现身体疲乏倦怠、经常收缩一团、运动量降低、皮肤干枯、表皮粗糙、纹理加粗加深、皮肤颜色出现暗红,偶有瘀斑等现象,比照光老化模型标准已经完全符合,造模成功。2 ELISA法检测结果:空白对照组中IL-6、TNF-α、IL-15呈现低水平表达。（1）IL-6水平:与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-6的表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-6的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组IL-6的表达显着升高（P<0.01）;潞党参中剂量组IL-6的表达变大（P<0.05）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。（2）TNF-α水平:与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中TNF-α的表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中TNF-α的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组TNF-α的表达显着升高（P<0.01）;潞党参中剂量组TNF-α的表达升高（P<0.05）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。（3）IL-15水平:与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15的表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-15的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组IL-15的表达显着升高（P<0.01）;潞党参中剂量组IL-15的表达升高（P<0.05）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。3 IF法检测结果（1）IL-15、IL-15R、IL-15与IL-15R共表达在各组内均有阳性表达。（2）IL-15水平:小鼠皮肤组织中IL-15在空白对照组的表达水平较低;与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-15的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组、潞党参中剂量组IL-15的表达显着升高（P<0.01）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。（3）IL-15R水平:小鼠皮肤组织中IL-15R在空白对照组的表达水平较低;与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15R表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-15R的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组、潞党参中剂量组IL-15R的表达显着升高（P<0.01）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。（4）IL-15与IL-15R共表达水平:小鼠皮肤组织中IL-15与IL-15R共表达在空白对照组的表达水平较低;与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15与IL-15R共表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-15与IL-15R共表达的水平显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组、潞党参中剂量组IL-15与IL-15R共表达的水平显着升高（P<0.01）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。4 Western-blot法检测结果（1）IL-15、IL-15R蛋白表达（1）IL-15蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组IL-15的蛋白表达显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15的蛋白表达升高（P<0.05）。（2）IL-15R蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15R的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组IL-15R的蛋白表达显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15R的蛋白表达升高（P<0.05）。（2）MAPK、P-MAPK蛋白表达（1）MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组MAPK的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组MAPK的蛋白表达显着下降（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组MAPK的蛋白表达显着升高（P<0.01）。（2）P-MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-MAPK的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组P-MAPK的蛋白表达显着下降（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-MAPK的蛋白表达显着升高（P<0.01）。（3）PI3K、P-PI3K蛋白表达（1）PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组PI3K的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组PI3K蛋白表达显着下降（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组PI3K的蛋白表达显着升高（P<0.01）。（2）P-PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-PI3K的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组P-PI3K蛋白表达显着下降（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-PI3K的蛋白表达显着升高（P<0.01）。（4）ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达（1）ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中ERK1/2的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中ERK1/2蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中ERK1/2的蛋白含量的表达水平显着升高（P<0.01）。（2）P-ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中P-ERK1/2的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-ERK1/2蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-ERK1/2的蛋白含量的表达水平显着升高（P<0.01）。（5）Akt、P-Akt蛋白表达（1）Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中Akt的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中Akt的蛋白含量的表达水平显着升高（P<0.01）。（2）P-Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中P-Akt的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-Akt的蛋白含量的表达水平显着升高（P<0.01）。5 IHC法检测结果（1）IL-15、IL-15R蛋白表达（1）IL-15蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组IL-15的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15的平均光密度值升高（P<0.05）。（2）IL-15R蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15R的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组IL-15R的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15R的平均光密度值升高（P<0.05）。（2）MAPK、P-MAPK蛋白表达（1）MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组MAPK的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组MAPK的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组MAPK的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（2）P-MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-MAPK的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组P-MAPK的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-MAPK的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（3）PI3K、P-PI3K蛋白表达（1）PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组PI3K的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组PI3K的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组PI3K的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（2）P-PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-PI3K的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组P-PI3K的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-PI3K的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（4）ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达（1）ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组ERK1/2的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组ERK1/2、的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组ERK1/2的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（2）P-ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-ERK1/2的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组P-ERK1/2的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组P-ERK1/2的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（5）Akt、P-Akt蛋白表达（1）Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组Akt的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组Akt的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与PI3K抑制剂组比较,中药剂量组Akt的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（2）P-Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-Akt的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组P-Akt的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与PI3K抑制剂组比较,中药剂量组P-Akt的平均光密度值显着升高（P<0.01）。结论:1皮肤光老化过程中有较多炎症因子产生,其中IL-15及其受体通过MAPK和PI3K信号转导通路分别激活蛋白激酶ERK1/2、Akt,导致MMPs表达增加,同时下调转化生长因子β/smad传导通路,可能是导致皮肤发生光老化的主要机制。2中药潞党参具有抗皮肤光老化的作用,其可能的作用机制之一是潞党参可以降低光老化小鼠皮肤组织中相关炎症因子的表达,直接或间接降低炎症因子及其受体对MAPK和PI3K信号转导通路相关基因和蛋白的影响。
丁羚涛[5]（2020）在《新型PI3K/mTOR双重抑制剂GDC-0084抗皮肤鳞状细胞癌（cSCC）细胞作用及分子机制研究》文中进行了进一步梳理目的:皮肤鳞状细胞癌（c SCC）是人群中常见的癌症之一,占皮肤恶性肿瘤的20-30%。大多数患者的癌症转移风险较低;然而,侵袭性c SCC与非常高的死亡率和发病率相关。虽然c SCC可以单独或联合放射和化学治疗来手术切除,但转移性c SCC患者的预后较差。在c SCC中检测到PI3K-Akt-m TOR信号传导的异常激活,GDC-0084是一种新型有效的小分子PI3K-m TOR双重抑制剂。本项目旨在明确GDC-0084在体内和体外抗c SCC细胞的相关作用,为c SCC的分子靶向治疗进行新的探索并提供新的治疗靶点。研究方法和内容:通过细胞集落形成试验法和CCK-8法检测c SCC细胞存活（不同浓度GDC-0084处理后）;Brd U ELISA法和Ed U染色法检测不同浓度GDC-0084处理后对c SCC细胞增殖的影响;PI-FACS方法检测GDC-0084处理后对c SCC细胞周期的影响;通过Caspase-3/9试剂盒、Annexin V-PI流式细胞仪、组蛋白DNA ELISA法检测GDC-0084对c SCC细胞凋亡的影响,蛋白印迹（Western blot）法检验促凋亡蛋白cleaved-Caspase-3/9的表达变化（GDC-0084处理后的）;运用Western blot的方法,观察GDC-0084处理c SCC细胞后,PI3K-Akt-m TOR、MEK-ERK和DNA依赖蛋白激酶（DNA-PK）催化亚单位（DNA-PKcs）信号通路的变化;导入持续活化的DNA-PKcs（ca DNA-PKcs,S2056D）,观察ca DNA-PKcs对GDC-0084诱导的人c SCC细胞凋亡的影响;建立SCID鼠荷A431移植瘤模型,观察GDC-0084给药后在体抗c SCC活性;分离431移植瘤组织,观察GDC-0084给药后PI3K-Akt-m TOR、DNA-PKcs信号通路的变化。研究结果GDC-0084有效地抑制c SCC细胞系细胞（A431,SCC-13和SCL-1）和原代培养人c SCC细胞的存活和增殖;GDC-0084诱导人c SCC细胞凋亡;GDC-0084诱导人c SCC细胞周期G1-S阻滞;与其他已知的PI3K-Akt-m TOR抑制剂相比,GDC-0084对c SCC细胞毒性作用更强;GDC-0084对正常人皮肤成纤维细胞/人皮肤角质细胞无显着细胞毒性作用;人c SCC细胞中,GDC-0084处理阻断PI3K-AKT-m TOR和DNA-PKcs通路的活化;导入持续活化的DNA-PKcs（S2056D）部分抑制GDC-0084诱导的人c SCC细胞凋亡;GDC-0084不影响人c SCC细胞中MEK-ERK通路的活化;GDC-0084灌胃显着抑制A431异种移植肿瘤在SCID小鼠中的生长;GDC-0084给药抑制SCID小鼠A431移植瘤中的PI3K-Akt-m TOR和DNA-PKcs活化。研究结论:GDC-0084阻断PI3K-Akt-m TOR和DNA-PKcs信号通路的活化,抑制人c SCC细胞在体外和体内生长。
夏唯杰[6]（2020）在《瞬时受体电位通道TRPC3在增生性瘢痕中的表达及作用》文中进行了进一步梳理背景和目的:增生性瘢痕（Hypertrophic scars,HTS）常导致机体功能障碍,目前的临床治疗效果不理想。瘢痕的形成过程是一种动态平衡,即胶原蛋白的合成和降解,当这种平衡被打破,则会形成病理性瘢痕,包括HTS。既往研究证实皮肤烧伤后的增生性瘢痕组织中肌成纤维细胞增多,肌成纤维细胞的增殖开始于肉芽组织形成阶段及活化的肌成纤维细胞聚集后,而这些作用在细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积、过度上皮化和最终的伤口愈合过程中都起着重要作用。HTS的主要成分是collagen-1（Col1a1）和纤连蛋白（fibronectin）,它们是参与细胞外基质的主要成分,而α平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin,αSMA）主要参与调节肌成纤维细胞的收缩。成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞在创面愈合过程中起着重要作用,探索HTS发生的分子机制有助于增生性瘢痕的防治。转化生长因子β（TGFβ）是一种细胞因子,研究表明哺乳类动物中含有TGFβ1-TGFβ3的表达。TGFβ在调节细胞增殖、分化以及组织纤维化中发挥重要作用,可促进皮肤创面愈合过程中肌成纤维细胞的转分化。此外,TGFβ还参与了αSMA的形成过程,在伤口愈合过程中调节伤口收缩和增加ECM、胶原蛋白和纤粘连蛋白的表达等。包括在慢性溃疡中,TGFβ1同样参与调节皮肤角质细胞和成纤维细胞的增殖。既往文献证实,Smad蛋白作为TGFβ的下游蛋白在细胞内信号转导发挥最重要的作用,研究发现肾脏、肺和肝脏中TGFβ1可通过细胞膜上异二聚体受体使转录因子Smad2/Smad3磷酸化发挥作用。线粒体内Ca2+摄取对调节众多细胞过程和能量代谢至关重要,Ca2+是ROS产生的重要调节物,线粒体基质中的Ca2+超载会损害线粒体功能导致过量的ROS生成,而线粒体内过低的Ca2+浓度可导致ATP生成减少,这提示Ca2+信号和ROS及ATP间存在功能性的联系。线粒体作为最早被认识的钙库,其线粒体的外膜对Ca2+有较好的通透性,内膜具有高度的选择通透性,在维持线粒体膜电位和氧化磷酸化中发挥着重要作用。线粒体丙酮酸脱氢酶（PDH）和数个电子转运复合物与维持线粒体Ca2+内稳态的改变有关。NADPH氧化酶（Nox）4利用NADPH中的离子生成过氧化物,抑制Nox4可减少多种组织损伤模型中肌成纤维细胞的形成和纤维化。最近研究表明TGFβ介导的肌成纤维细胞转分化已被证明与ROS生成增多激活Nox4有关。然而,线粒体内Ca2+超载通过ROS和Nox4/Smad3信号通路在调节肌成纤维细胞转分化中的作用仍不清楚。瞬时受体电位（Transient Receptor Potential Channel,TRP）通道在调控细胞内钙稳态、细胞增殖、迁移和炎症中发挥重要作用。TRP通道是一类对钠、钙等阳离子通透的非选择性阳离子通道,它分为TRPCs,TRPVs及TRPMs等亚型,其中TRPC3是TRPCs亚家族成员之一。研究显示TRP通道与成纤维细胞转分化及创伤愈合伤口收缩有关。TRPC6可激活细胞内Ca2+反应蛋白钙调磷酸激酶,从而诱导肌成纤维细胞转分化及皮肤创面愈合,而TRPA1可促进心肌梗死后心肌成纤维细胞的转分化。我们之前的研究揭示TRPC3表达增加与单核细胞迁移增加及促进线粒体Ca2+摄取和ROS生成增加,这一系列的反应与高血压血管重构有关。既往研究还显示,TRPC6参与血小板活化与糖尿病高血糖激活TRPC6促进血小板钙内流增加有关。也有研究表明TRPC3表达于血管平滑肌细胞线粒体内膜上,参与调控钙库操纵的钙内流（Store Operate Calcium Entry,SOCE）及线粒体Ca2+稳态。但TRPC3在增生性瘢痕中的表达及调控肌成纤维细胞转分化的作用尚不甚清楚。此外,目前对创伤时TGFβ1调控TRPC3介导线粒体钙摄取和ROS生成,调控肌成纤维细胞分化的机制也尚不明确,有待进一步深入阐明。本研究包括两个部分:1.TRPC3在人增生性瘢痕中的表达。2.TRPC3调控成纤维细胞线粒体功能对肌成纤维细胞转分化的作用及机制。我们对门诊就诊的需要做皮肤增生性瘢痕切除术的患者纳入本临床研究,并签署知情同意书,采集患者的一般资料及对皮肤增生性瘢痕进行《改良版温哥华瘢痕量表评分》。患者行增生性瘢痕切除术时收集新鲜的瘢痕组织标本及酌情采集其周围正常的皮肤组织或行整形美容手术切取的多余正常皮肤组织,采用免疫组化、qRT-PCR及Western Blot等技术,明确TRPC3和TGFβ1在增生性瘢痕组织和正常皮肤组织中的表达水平。同时,采用人和TRPC3基因敲除小鼠(Trpc3-/-)及野生型小鼠(Trpc3+/+)的原代培养的皮肤成纤维细胞,检测成纤维细胞的胞浆钙离子浓度([Ca2+]i)和线粒体钙摄取([Ca2+]m),检测细胞及线粒体ROS及ATP生成,阐明TRPC3在增生性瘢痕中的作用,明确TRPC3通过调控NOX4/pSmad信号通路促进成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞的机制,揭示TRPC3参与增生性瘢痕形成的机制。本研究为皮肤增生性瘢痕的防治提供新的干预靶点。材料和方法:整个研究包括离体实验和整体实验。第一部分离体实验,临床纳入皮肤增生性瘢痕的患者,并对皮肤瘢痕进行《改良版温哥华瘢痕量表评分》。手术时收集患者的瘢痕组织及临近的正常皮肤组织或行整形美容手术切取的多余正常皮肤组织为研究对象,采用免疫组化、qRT-PCR等技术,明确TRPC3在人增生性瘢痕及正常皮肤组织中的表达,及TRPC3的表达与瘢痕评分的相关性。第二部分整体实验以Trpc3-/-小鼠和Trpc3+/+小鼠作为研究对象,创建开放性背部皮肤伤口模型,于创伤愈合过程中采集创面肉芽组织,阐明创面愈合过程TRPC3调控新生肉芽组织的肌成纤维细胞αSMA蛋白表达及对增生性瘢痕相关信号分子的作用及机制。细胞实验采用人或Trpc3-/-小鼠和Trpc3+/+小鼠原代培养的皮肤成纤维细胞,明确TRPC3调控线粒体钙摄取及ROS生成的作用,阐明TRPC3调控NOX4/pSmad信号通路在创伤愈合过程中肌成纤维细胞转分化的作用及机制。实验主要方法如下:1.利用qRT-PCR、免疫印迹、免疫组化和免疫荧光染色等分子生物学技术,检测TRPC3、αSMA、TGFβ1、Fibronectin、Col1a1和Nox4/pSmad相关蛋白的表达及分布。2.采用原代培养的人或Trpc3-/-小鼠和Trpc3+/+小鼠成纤维细胞作为研究对象,以TRPC3特异性抑制剂Pyr3和TGFβ1作为药物干预手段,利用全波长酶标仪检测细胞内胞浆钙离子浓度和线粒体钙摄取的变化。3.采用高分辨率线粒体功能测定仪及氧化还原试剂盒,测定成纤维细胞线粒体呼吸功能、ATP及ROS生成的情况。4.以Trpc3-/-小鼠和Trpc3+/+小鼠作为研究对象,在背部创建开放性皮肤伤口模型,在伤口愈合过程中采集创面肉芽组织,采用免疫组化和免疫印迹法检测TRPC3、αSMA、TGFβ1、fibronectin、Col1a1和Nox4/pSmad2/3通路的变化及作用机制。结果:1.与人正常皮肤组织相比较,人增生性瘢痕皮肤组织中TRPC3和TGFβ1蛋白及mRNA表达水平均显着增高,且TRPC3与TGFβ1的mRNA表达水平呈显着正相关。2.成纤维细胞有TRPC3表达,TGFβ1干预可显着上调成纤维细胞TRPC3和αSMA蛋白表达,促进肌成纤维细胞转分化,TRPC3抑制剂Pyr3可逆转TGFβ1的这种作用。3.TGFβ1干预可显着增加成纤维细胞胞浆钙离子浓度([Ca2+]cyt)和线粒体钙([Ca2+]mito)摄取,增加线粒体ROS生成,减少ATP合成,导致线粒体氧化磷酸化和电子传递减弱。TRPC3抑制剂Pyr3干预可削弱TGFβ1的这种作用,改善线粒体呼吸功能。4.与Trpc3+/+小鼠相比较,Trpc3-/-小鼠创面肉芽组织肌成纤维细胞的标志物αSMA表达显着减少。Trpc3-/-小鼠原代培养的成纤维细胞TGFβ1诱导的钙离子内流也显着减少。Trpc3-/-小鼠创面肉芽组织αSMA、TGFβ1、Fibronectin、Col1a1和NOX4/pSmad2/3蛋白表达均显着减少,提示TRPC3基因敲除可减少肌成纤维细胞转分化及增生性瘢痕形成。结论:1.人增生性瘢痕皮肤组织TRPC3和TGFβ1表达增加。2.TRPC3在成纤维细胞中表达,TGFβ1可上调成纤维细胞TRPC3表达增加线粒体钙摄取和ROS生成,促进肌成纤维细胞转分化。抑制TRPC3能够部分逆转TGFβ1的这种作用。3.TRPC3基因敲除能够抑制TGFβ1诱导的SOCE,减少增生性瘢痕。TRPC3介导的Nox4/pSmad2/3信号通路是创伤后增生性瘢痕形成的机制之一。
杨玉花[7]（2020）在《人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究》文中提出背景:体细胞重编程可以产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）。产生的患者特异性干细胞不仅能模拟人类疾病过程,研究发病机制,还能用于药物开发和筛选,以及为个性化再生细胞疗法提供新的机会。目的:探索一种快速简便、不损伤细胞活性、能高效产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）的方法,并评价应用该法获得的iPSCs在体外诱导为皮肤黑素细胞的可能性,为临床治疗色素性疾病提供研究基础。方法:1.分离酶消化修剪后包皮,获得表皮片,一部分做组织培养,另一部分进一步消化成细胞悬液培养。健康个体包皮来源的表皮片平铺在基质胶包被的培养板上培养3周,获得KCs,并进行KSCs标志物K15免疫荧光染色,证实表皮中KSCs的存在。胰酶消化表皮获得表皮KCs悬液,接种在预先IV型胶原包被的六孔培养板,留取15min内贴壁的细胞继续培养。培养24 h后,采用K15抗体、SOX2和OCT4抗体以及干细胞活细胞染料CDy1,进行染色。未染色孔的细胞用胚胎干细胞培养基继续培养1周,观察细胞形态,70%融合后传代培养。15 min未贴附的细胞也同步培养,作为对照研究。拔取的毛囊放入基质胶包被的培养板进行体外培养,分析毛囊KCs的OCT4和NANOG的DNA甲基化水平,与表皮中的KCs相比较。2.用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒转染富集的表皮KSCs获得iPSCs。观察和记录产生的克隆的形态和时间,采用干细胞标记物的相应抗体、碱性磷酸酶检测试剂盒、干细胞活细胞CDy1染料进行检测。分析OCT4和NANOG启动子区域的DNA甲基化水平,RT-PCR检测多潜能基因表达。采用含有不同因子的诱导培养基,诱导iPSCs分别分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs等。用携带4种转录因子的慢病毒转染毛囊KCs,观察iPSCs的形成。将iPSCs种植到SCID小鼠的后肢皮下,观察畸胎瘤的形成,获取畸胎瘤后,进行组织病理和免疫组化检测。从畸胎瘤中获取细胞,分别在KCs培养基、M254培养基和DMEM培养基中培养,观察细胞形态。3.分离酶消化修剪后包皮获得表皮片,通过不同培养方法分别获得KCs、MCs、成纤维细胞（fibroblasts,FBs）。用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒分别转染KCs、MCs并获得相应的iPSCs,FBs通过长时间胰酶消化获得Muse细胞。透射电镜观察人皮肤KCs、MCs及重编程产生的iPSCs和Muse细胞的超微结构。结果:1.表皮片贴附在基质胶包被的培养板底部,产生外向性生长的KCs,中心区域细胞体积小,表皮片外缘的细胞体积逐渐变大,细胞呈多边形。K15抗体染色显示,皮片中心区域阳性细胞密集,周边区阳性数目减少,证实KSCs的存在和大致分布。用胰酶消化未培养的表皮片,获得细胞悬液,这些细胞接种到IV型胶原包被的培养板后,15 min内大约有20～30%的细胞贴壁。快速贴壁的细胞体积较小。24 h后,细胞黏附牢固,部分开始增殖,K15染色和干细胞活细胞染料CDy1染色,明显阳性。而针对干性特异性标志物SOX2和OCT4的染色呈弱阳性。用胚胎干细胞培养基继续培养快速贴壁细胞1周,可见大小不等的克隆形成。相比之下,同步培养的慢贴壁细胞也有克隆形成,但比快速贴壁细胞的克隆小。拔取的毛囊很容易贴附到基质胶上,从毛外根鞘处爬出很多KCs,其中许多呈克隆样生长。传代培养的毛囊KCs和表皮KCs的SOX2和OCT4的甲基化水平相近。2.获得的表皮KSCs传代培养后,进行细胞转染。最早在第7天出现第一个克隆,在10天可见很多典型的iPSCs。干细胞特异性标记物SOX2、OCT4、NANOG和SSEA3染色阳性。干细胞活细胞CDy1染料呈阳性,碱性磷酸酶染色细胞呈紫红色。与亲本KCs相比,获得的iPSCs显示OCT4和NANOG启动子DNA去甲基化。RTPCR检测结果示:iPSCs中SOX2、OCT4、NANOG基因表达水平高于亲本的KCs,而亲本KCs的KLF4基因表达水平高于iPSCs。拟胚体在明胶包被的培养板生长良好,自分化培养可出现外胚层、中胚层和内胚层细胞。用不同分化培养基,诱导iPSCs逐渐分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs,特异性染色相应为AFP（+）、油红O染色（+）、βIII-微管蛋白（+）、神经丝（+）、HMB45（+）和TYR（+）。用四种因子转染毛囊KCs,同样可获得iPSCs。将产生的iPSCs注射到4周龄SCID小鼠后肢皮下,第8周肿瘤长到足够大小,切取畸胎瘤组织进行病理和免疫病理学检查。结果显示:Vimentin（+）、CK（pan）（+）和KI-67（+）阳性,GFAP和AFP染色为阴性。从畸胎瘤组织获得的单细胞,在KCs培养基中生长3周细胞小而圆体,核浆比大,细胞荧光仍然很强,培养6周后细胞排列紧密,细胞活力好,增殖快速。在DMEM培养基中生长3周时细胞主要是圆形,部分有突起,培养6周的细胞,细胞显出扁平形,类似纤维细胞的形态。在M254培养基中生长3周以细小圆形细胞为主,可见部分细胞有少量突触样结构,培养6周的细胞显示出细长的树突,类似MCs的形态。3.透射电镜显示KCs胞体大致呈方形,细胞核大,有一个核仁。MCs呈椭圆形,并且细胞核染色质聚集性差,胞质中可见膜包裹的黑素小体。MCs和KCs重编程产生的iPSCs的超微结构大致相同,细胞呈圆形,具有多个核仁,细胞质稀少,核浆比高,可见发育不良的内质网和高尔基复合体。FBs胞体呈梭型或不规则形,细胞核呈椭圆形或圆形,染色质丰富,细胞器较多。Muse细胞核质比高,细胞核有较多突起,核仁体积较大,细胞质内细胞器较少,相对幼稚。结论:1.KCs混悬液接种在IV型胶原包被的培养板中,15 min内贴壁的细胞富含KSCs。拔取毛发可获得大量的KCs,与表皮来源的KCs类似,包含大量的KSCs。2.用携带四种转录因子的慢病毒转染表皮KSCs,可高效率和较短时间出现iPSCs。这些细胞具有多能性,并可被诱导分化成为不同类型细胞。拔取毛发获的KCs可被重编产生iPSCs。iPSCs接种到SCID小鼠皮下,可产生肿瘤。畸胎瘤细胞在不同培养基中生长呈现不同形态。3.透射电镜显示KCs重编程产生得iPSCs的超微结构与MCs来源的iPSCs超微结构以及Muse细胞的超微结构近似,核浆比高,多个核仁,细胞浆中细胞器较少,且发育不成熟。
刘振兴[8]（2020）在《p75NTR在NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化中的作用及机制研究》文中认为研究背景皮肤损伤是临床上的常见病、高发病,损伤后的创面愈合问题更是给患者的生理和心理带来巨大的影响。皮肤的创面愈合一直以来都是国内外临床研究的热点与难点,它是一个复杂、有序、动态的修复过程,分为凝血期、炎症期、肉芽组织形成期以及组织重构期4个相互连贯的阶段。成纤维细胞是创面肉芽组织中主要组成细胞。在正常创面愈合的过程中,成纤维细胞能够被活化并逐渐转分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞能高表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,同时可合成并分泌大量的胶原蛋白、多种生长因子及酶类,在创面愈合过程中皮肤组织的重塑及纤维化形成中起关键作用。p75神经营养因子受体（p75 neurotrophinreceptor,p75NTR）是神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）的低亲和力受体,具有多向性功能,参与调控多种细胞的增殖、凋亡、分化、生存、迁移等多种生物学过程。p75NTR生物学功能的发挥主要取决于其配体类型、衔接蛋白及激活的信号传递通路等因素。早期对p75NTR的研究主要集中于神经系统,早期研究发现,其在神经元的发生发育、神经损伤后的修复、再生及神经保护方面具有重要作用。近年来发现,p75NTR还参与调控多种非神经系统组织的功能。研究发现,皮肤损伤时,创面组织中NGF和p75NTR的表达均明显上调,说明其在皮肤创面愈合过程中可能起重要作用。NGF是最为常见的一种神经营养因子,可由神经细胞或非神经细胞合成。在正常的生理状态下,皮肤组织中NGF可由角质形成细胞产生,并积极参与皮肤稳态的维持。在皮肤创面愈合的过程中,NGF可由感觉神经末梢、角质形成细胞及成纤维细胞以旁分泌或自分泌方式产生,并与其受体原肌球蛋白相关激酶A（tropomyosinreceptorkinaseA,TrkA）和/或 p75NTR结合,进而调控细胞的增殖、凋亡及分化等生物学过程。早期研究已证实NGF具有加速成纤维细胞迁移、促进创面再上皮化的作用,其局部应用可明显促进正常创面及糖尿病创面等各类创面的愈合。此外,NGF还可诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,但其作用的分子机制仍不明确。本课题组前期研究发现,p75NTR可以通过促进表皮干细胞的增殖、迁移及分化而加快皮肤创面的愈合。那么p75NTR是否参与调控NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化过程呢?其具体的调控机制是什么?我们通过检测p75NTR的表达模式初步推测其在皮肤组织成纤维细胞中的功能,并通过过表达及敲低p75NTR来进一步探讨其在NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化过程中的调控机制。研究目的1.通过检测p75NTR在小鼠皮肤组织成纤维细胞中的表达模式,初步探索其功能;2.通过检测p75NTR对成纤维细胞行为的影响,进一步明确其在成纤维细胞中的主要功能以及其在NGF诱导下成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化中的作用;3.通过过表达、抑制表达等分子生物学手段进一步揭示p75NTR在NGF诱导的肌成纤维细胞转分化过程中的调控机制。材料和方法1.p75NTR在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达模式（1）小鼠皮肤成纤维细胞的原代培养:取C57BL/6乳鼠的背部皮肤,分别采用组织块法和酶消化法来原代培养小鼠皮肤组织成纤维细胞,并采用胰蛋白酶消化-再贴壁法来纯化成纤维细胞。在倒置相差显微镜下来对比观察两种方法获得的原代及传代成纤维细胞的形态特点,进行初步形态学鉴定。分别以小鼠NIH/3T3成纤维细胞、角质形成性细胞作为阳性与阴性对照,采用Western-blot检测Vimentin及Keratin的表达情况,以鉴定所获得的细胞。选用第3代细胞,采用计数法检测并绘制细胞的生长曲线以对比两种方法获得细胞的增殖情况。（2）p75NTR在小鼠皮肤组织成纤维细胞中的表达:分别培养组织块法与酶消化法原代提取的小鼠皮肤组织成纤维细胞及小鼠NIH/3T3成纤维细胞,采用免疫荧光染色、Western-blot检测p75NTR在小鼠成纤维细胞中的表达情况。2.建立p75NTR过表达/敲低稳定转染的成纤维细胞株将构建好的p75NTR过表达/敲低表达的慢病毒载体来转染小鼠NIH/3T3成纤维细胞,用2μg/ml嘌呤霉素来筛选转染后的成纤维细胞,以获得稳定转染的细胞株,并采用免疫荧光染色、Western-blot检测p75NTR在稳定转染的细胞株中的表达情况。3.p75NTR对小鼠成纤维细胞的生物学特性及肌成纤维细胞转分化的影响（1）p75NTR对小鼠成纤维细胞的生物学特性的影响:分别培养构建好的p75NTR过表达、p75NTR敲低表达及正常的小鼠成纤维细胞,检测并分析p75NTR对小鼠成纤维细胞增殖、细胞周期及迁移等生物学特性的影响。采用CCK-8法来检测p75NTR对小鼠成纤维细胞增殖的影响;采用流式细胞术来检测p75NTR对小鼠成纤维细胞周期的影响;采用Transwell技术检测p75NTR对小鼠成纤维细胞迁移的影响。（2）NGF对小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的诱导作用:配制不同NGF浓度的（0,0.1,1,10,100 ng/ml）的培养基,分别诱导小鼠NIH/3T3成纤维细胞,采用Western-blot检测细胞中α-SMA的表达情况,对比分析最佳的诱导浓度。于最佳的诱导浓度下,采用Western-blot、qRT-PCR等实验手段在转录及翻译水平上,检测不同诱导时间（0h,24h,48h,72h）对α-SMA表达的影响。（3）NGF对小鼠成纤维细胞TrkA和p75NTR受体表达的影响:分别于0h、24h、48h及72h四个时间点下,以100 ng/ml NGF刺激小鼠成纤维细胞,采用Western-blot、qRT-PCR检测细胞中TrkA和p75NTR受体在转录及翻译水平上的表达情况。（4）p75NTR对NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的影响:分别培养构建好的p75NTR过表达、p75NTR敲低及正常的小鼠成纤维细胞,并应用100ng/ml NGF诱导其向肌成纤维细胞转分化,采用免疫荧光染色、Western-blot、qRT-PCR检测细胞中α-SMA在转录及翻译水平的表达情况。（5）p75NTR对NGF诱导的I型胶原合成的影响:分别培养构建好的p75NTR过表达、p75NTR敲低及正常的小鼠成纤维细胞,并应用100ng/ml NGF诱导小鼠成纤维细胞,采用Western-blot、qRT-PCR检测细胞中I型胶原在转录及翻译水平的表达情况。4.p75NTR调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的机制研究（1）p75NTR对NGF诱导的肌成纤维细胞转分化中F-actin、MRTF-A表达的影响:以100 ng/mlNGF诱导p75NTR过表达、p75NTR敲低及正常的小鼠成纤维细胞,采用免疫荧光染色检测F-actin、MRTF-A及α-SMA的表达变化情况,采用Western-blot技术检测MRTF-A蛋白的表达情况。（2）CCG-203971对NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的抑制作用:采用CCK-8法测定MRTF-A抑制剂CCG-203971的IC50,绘制曲线并计算IC50值。应用100 ng/ml NGF、30μM CCG-203971刺激小鼠成纤维细胞,采用免疫荧光染色、Western-blot检测α-SMA表达情况。5.统计学分析本实验所得数据均使用GraphPad Pro.Prism 7.0软件来进行统计学分析,数据使用均数±标准差（x±s）来表示,每组实验重复3次。数据间比较:两样本之间数据的比较采用单因素方差分析t检验,多样本间的数据比较采用ANOVA检验。P<0.05代表差异具有统计学意义。结果1.p75NTR在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达模式（1）采用两种方法原代培养的细胞经纯化后具有相同的增值能力,经Western-blot鉴定均表达成纤维细胞特征性蛋白Vimentin。相比较而言,酶消化法更为方便、快捷。（2）免疫荧光染色和Western-blot检测结果显示:p75NTR在原代获得的小鼠皮肤成纤维细胞及小鼠NIH/3T3成纤维细胞系中表达水平相似。2.建立p75NTR过表达/敲低的稳定转染细胞株免疫荧光染色和Western-blot结果显示:成功构建了 p75NTR过表达/敲低的稳定转染细胞株。3.p75NTR对小鼠成纤维细胞的生物学特性及肌成纤维细胞转分化的影响（1）CCK-8法结果显示:p75NTR对小鼠成纤维细胞的增值能力无明显影响;流式细胞术分析结果显示:p75NTR对小鼠成纤维细胞周期无明显影响;Transwell检测结果显示:p75NTR的表达水平与小鼠成纤维细胞的迁移能力呈正相关。（2）Western-blot检测结果显示:NGF诱导下α-SMA蛋白的表达与NGF的浓度呈正相关,其中100 ng/ml NGF具有显着的诱导效果。同时,qRT-PCR和Western-blot检测结果显示:α-SMA的转录和表达均在48h开始进入平台期。（3）qRT-PCR和Western-blot检测结果显示:NGF诱导下小鼠成纤维细胞p75NTR的转录和表达随时间的延长而增多,而TrkA受体的转录和表达随时间的延长无明显变化。（4）qRT-PCR、Western-blot及免疫荧光染色检测结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞中α-SMA的转录及蛋白表达水平显着高于对照组,而敲低组显着低于对照组。（5）qRT-CR和Western-blot检测结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞I型胶原的转录及蛋白表达水平显着高于对照组,而敲低组显着低于对照组。4.p75NTR调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的机制研究（1）免疫荧光染色结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞中F-actin、MRTF-A蛋白的表达水平及MRTF-A蛋白核转位水平显着高于对照组,而敲低组显着低于对照组,且其表达变化与α-SMA相一致。Western-blot检测结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞中MRTF-A蛋白的表达水平显着高于对照组,而敲低组中显着低于对照组。（2）免疫荧光染色和Western-blot结果显示:NGF+CCG-203971组成纤维细胞的α-SMA的表达水平明显低于NGF组。结论1.p75NTR在原代培养小鼠皮肤成纤维细胞和小鼠NIH/3T3成纤维细胞中表达水平相似,值得进一步深入研究。2.100 ng/ml NGF在24、48h时可显着诱导小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,且p75NTR可调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化及I型胶原蛋白的合成过程。3.NGF通过p75NTR-F-actin-MRTF-A信号通路诱导小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。
苏浩[9]（2020）在《利用人表皮干细胞和成纤维细胞3D打印皮肤组织的初步研究》文中指出3D 打印皮肤组织表皮层的种子细胞常用人角质形成细胞系和分离自皮肤组织的角质形成细胞。人角质形成细胞系为转化细胞,其性状和基因表达与正常的角质形成细胞有差异;分离自皮肤组织的角质形成细胞则扩增次数有限。表皮干细胞（Epidermal stem cells,EpSCs）能不断增殖,并分化成表皮层各种细胞,是3D打印组织工程理想的种子细胞,具有很好的应用前景。目前以EpSCs为种子细胞打印皮肤组织的报道很少。目的以人EpSCs和成纤维细胞为种子细胞,微挤压3D打印皮肤组织。方法1.用中性蛋白酶和胰蛋白酶消化人皮肤组织,快速贴壁法分离EpSCs。用免疫荧光染色和流式细胞术检测EpSCs标志分子（β1整合素、CK19、CD71和α6整合素）。用Ⅱ型胶原酶分离人真皮成纤维细胞,免疫荧光染色检测成纤维细胞标志分子（Vimentin）。2.通过MTT实验检测成纤维细胞在KGM2和DMEM培养基中的增殖情况,选择培养打印皮肤组织的培养基。3.以纤维蛋白原和明胶为支架材料,EpSCs和成纤维细胞为种子细胞,微挤压打印真皮层和表皮层,凝血酶交联。探索打印表皮层支架材料中纤维蛋白原和打印真皮层时成纤维细胞的合适浓度。4.通过活/死细胞实验检测打印皮肤组织中细胞的活性。5.通过苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色、免疫荧光染色观察打印皮肤组织的结构与细胞组成。6.通过甲苯胺蓝渗透试验检测打印皮肤组织的屏障功能。结果1.分离和培养的人皮肤EpSCs经免疫荧光染色显示CK19、或β1整合素阳性的细胞达90%以上;流式细胞仪检测显示高表达α6整合素、同时低表达CD71的细胞占90.73%。分离和培养的成纤维细胞经免疫荧光染色显示Vimentin阳性细胞占98%以上。证明分离和培养的EpSCs和成纤维细胞纯度较高。2.成纤维细胞在KGM2完全培养基中的增殖比在DMEM完全培养基中快,选择前者作为打印皮肤组织的培养基。3.当支架材料中的纤维蛋白原浓度在真皮层和表皮层分别为5mg/ml和10 mg/ml,成纤维细胞和EpSCs浓度分别为4×106/ml和5× 106/ml时,打印的皮肤组织在培养后细胞生长良好。HE染色和免疫荧光染色显示培养的打印组织表皮层和真皮层分层良好,表皮层厚度为74.72±5.25 μm,与正常皮肤组织表皮层厚度类似。4.甲苯胺蓝渗透试验显示气液培养7天的打印皮肤组织,其屏障功能和正常皮肤组织类似。结论以人EpSCs和成纤维细胞为种子细胞,纤维蛋白原和明胶为支架材料,微挤压打印含真皮、表皮层的皮肤组织,获得表皮层厚度及屏障功能和正常人皮肤组织类似的组织工程皮肤。
郭晓瑞[10]（2020）在《人源内皮克隆形成细胞（ECFCs）旁分泌对成熟血管和皮肤细胞生物学影响的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:2型糖尿病（T2D）是最常见的代谢性疾病之一,其主要特征是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而出现慢性高血糖。慢性创伤具有特征性的病理联系,不能通过有序和及时的修复来恢复结构和功能的完整性。在糖尿病患者中,每年有2%-3%的患者发生足部溃疡。糖尿病足是一种严重的T2D并发症,常导致疼痛、痛苦和生活质量低下。内皮克隆形成细胞（Endothelial colony-forming cells,ECFCs）被认为晚期内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,在创伤修复中的作用受到广泛关注。ECFCs是一种来源于骨髓的原始细胞,在一定的条件下可诱导分化成为成熟的内皮细胞（endothelial cells,ECs）。该细胞不仅参与胚胎时期的血管生成,而且在人体出生后的血管新生、血管损伤的内皮修复以及功能维持中仍然有重要的作用。干/祖细胞对创面的修复机制可概括为:（1）分化为成熟内皮细胞;（2）旁分泌产生多种生物活性的细胞因子促进创面的血管新生及神经再生。为此,我们推测内皮克隆形成细胞通过旁分泌机制可促进糖尿病患者慢性创面的愈合以及破损处血管再生。本实验通过探讨ECFCs条件培养基（Conditioned medium,CM）对人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）和人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts,HDFs）的作用功能,为ECFCs对于糖尿病患者创面修复作用提供新思路和理论支持。方法:1.ECFCs的提取、分离培养及鉴定1.1 ECFCs细胞提取及分离培养:采集健康志愿者脐带血,采用密度梯度离心法获得单个核细胞,将人纤维蛋白加入六孔细胞培养板中,置于37℃培养箱中孵育3h进行包被,接种到包被人纤维蛋白的细胞培养板中进行培养;1.2 ECFCs细胞鉴定:将培养的ECFCs细胞,采用流式细胞仪及免疫荧光法检测ECFCs细胞表面抗原,Matrigel成管实验对ECFCs细胞进行体外检测,共聚焦法检测ECFCs细胞对于Dil-acLDL和FITC-UEA-I的摄取结合能力。2.ECFCs-CM制备与细胞因子检测2.1细胞条件培养基ECFCs-CM的制备:对数生长期的ECFCs细胞于无血清的M199基础培养液中置于常氧和低氧条件下持续培养24h和48h,收集上清液,即为条件培养液（ECFCs-CM）;2.2.细胞条件培养基（ECFCs-CM）细胞因子检测:采用抗体芯片及ELISA法检测ECFCs-CM细胞因子表达;3.ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞的生物学作用3.1 CCK-8法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞增殖能力的影响;3.2细胞划痕法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.3 Transwell间接共培养法检测ECFCs对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.4流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞周期的影响;3.5流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞凋亡的影响;4.丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶的制备结果:1.ECFCs细胞提取及培养:ECFCs原代培养第4天,见少量呈纺锤形贴壁细胞,呈集落样生长集落中间可见圆形细胞,周边为梭形细胞,其结构与形状和血岛极其相似,ECFCs原代培养第8天,细胞集落开始接触融合;ECFCs原代培养第14天,细胞呈典型的“铺路石”样生长;2.ECFCs细胞的鉴定:流式细胞仪检测显示KDR、CD144（vWF）高表达,CD34部分表达,CD133、CD45低表达;Matrigel基质胶上形成管腔样结构,表现出典型的内皮细胞特征;3.抗体芯片检测显示,细胞条件培养基ECFCs-CM在常氧和低氧条件下多种细胞因子高表达,随时间表达谱稍有不同。在低氧条件且持续培养48h更有利于细胞培养液上清中细胞因子表达;ELISA法检测显示,EBM-2组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF无表达,ECFCs-CM组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF表达量较高;4.ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞的作用:CCK-8法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞增殖情况明显高于EBM-2组（P<0.05）;细胞划痕法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞培养至0h、6h和12h和24h细胞迁移覆盖率明显大于EBM-2组（P<0.05）;Transwell间接共培养法检测显示ECFCs-CM共培养组的HUVECs和HDFs细胞数明显高于EBM-2组（P<0.05）;流式细胞仪检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞处于G0/G1期细胞比例明显少于EBM-2组（P<0.05）;ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞早晚期凋亡率明显降低。5.丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶:SF/ALG复合水凝胶的孔径为50-120μm,FTIR光谱结果表明重要官能团的振动模式对比纯的ALG和SF,无明显差异;SF/ALG水凝胶孔隙率分析显示水凝胶孔隙率高,均一性良好;SF/ALG水凝胶溶胀度随着时间增加。结论:富含多种细胞因子的ECFCs-CM可促进HUVECs和HDFs细胞增殖、迁移和成管,减少HUVECs和HDFs细胞的凋亡,ECFCs通过旁分泌促进新生血管形成,为干/祖细胞旁分泌机制为基础的“无细胞”治疗策略促进糖尿病及难愈性创面修复可提供新思路。
二、人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究（论文提纲范文）
（1）绵羊皮肤前体细胞分离培养（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 SKPs的研究进展 |
| 1.1.1 SKPs的发现及来源 |
| 1.1.2 SKPs的分化 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.2.1 培养基 |
| 1.2.2 原代和传代培养 |
| 1.2.3 冷冻保存和复苏 |
| 1.2.4 细胞周期 |
| 1.3 细胞的生物学检测 |
| 1.3.1 细胞的形态特征检测 |
| 1.3.2 细胞活力检测 |
| 1.3.3 污染检测 |
| 1.4 单细胞转录组测序的研究进展及应用 |
| 1.4.1 单细胞转录组测序技术的发展 |
| 1.4.2 单细胞分离技术 |
| 1.4.3 单细胞转录组测序文库制备的比较分析 |
| 1.4.4 单细胞转录组测序技术的应用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 绵羊皮肤前体细胞体外分离培养与特征鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 成纤维细胞的分离与培养 |
| 2.2.2 pH-SKPs的分离与培养 |
| 2.2.3 成纤维细胞和pH-SKPs的特征鉴定 |
| 2.2.4 pH-SKPs分化为成纤维细胞 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 成纤维细胞的分离培养与特征鉴定 |
| 2.3.2 pH-SKPs的分离培养与鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于单细胞转录组鉴定绵羊皮肤前体细胞 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 制备与检测单细胞悬液 |
| 3.2.2 建库测序 |
| 3.2.3 测序数据质量评估 |
| 3.2.4 细胞检测和比对 |
| 3.2.5 细胞聚类 |
| 3.2.6 基因功能富集分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 成纤维样本的细胞类群鉴别 |
| 3.3.2 pH-SKPs样本中细胞类群鉴别 |
| 3.3.3 pH-SKPs的富集分析 |
| 3.3.4 成纤维细胞与pH-SKPs两个样本的聚类 |
| 3.3.5 成纤维细胞与SKPs的富集分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
| 附录 D |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）萨能奶山羊耳缘成纤维细胞分离培养及抗衰老研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 体细胞的分离培养及遗传资源保护的研究进展 |
| 1.1 畜禽遗传资源保护的研究进展 |
| 1.1.1 畜禽遗传资源保护的发展状况 |
| 1.1.2 畜禽遗传资源保护的技术方法 |
| 1.2 细胞培养及生物学特性的研究进展 |
| 1.2.1 细胞培养技术的发展概况 |
| 1.2.2 细胞培养的方法及特点 |
| 1.2.3 细胞的生物学特性检测 |
| 第二章 细胞衰老与亚精胺抗衰老的研究进展 |
| 2.1 细胞衰老的研究概况 |
| 2.1.1 细胞衰老的特征 |
| 2.1.2 细胞衰老诱因的相关研究 |
| 2.1.3 细胞抗衰老的相关研究 |
| 2.2 亚精胺的研究概况 |
| 2.2.1 亚精胺的简介 |
| 2.2.2 亚精胺的合成与代谢 |
| 2.2.3 亚精胺的功能研究 |
| 2.3 亚精胺抗衰老的研究概况 |
| 2.4 研究目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第三章 奶山羊成纤维细胞的分离培养及鉴定 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂与耗材 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 原代奶山羊成纤维细胞分离培养 |
| 3.2.2 奶山羊成纤维细胞的纯化和鉴定 |
| 3.2.3 奶山羊成纤维细胞生长曲线的绘制 |
| 3.2.4 奶山羊成纤维细胞核型分析 |
| 3.2.5 微生物污染检测 |
| 3.2.6 奶山羊成纤维细胞形态观察 |
| 3.2.7 数据分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 原代奶山羊成纤维细胞的分离培养 |
| 3.3.2 奶山羊成纤维细胞的纯化与鉴定 |
| 3.3.3 奶山羊成纤维细胞生长曲线 |
| 3.3.4 奶山羊成纤维细胞核型分析 |
| 3.3.5 微生物污染检测 |
| 3.3.6 不同代数奶山羊成纤维细胞的形态观察 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 亚精胺提高奶山羊成纤维细胞抗衰老的研究 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 主要试剂与耗材 |
| 4.1.4 主要溶液的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 奶山羊成纤维细胞细胞活力检测 |
| 4.2.2 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal) |
| 4.2.3 细胞DNA的提取 |
| 4.2.4 细胞RNA的提取及反转录 |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR |
| 4.2.6 奶山羊成纤维细胞活性氧水平 |
| 4.2.7 奶山羊成纤维细胞细胞周期 |
| 4.2.8 奶山羊成纤维细胞衰老相关分泌表型 |
| 4.2.9 数据分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 亚精胺对奶山羊成纤维细胞细胞活力的影响 |
| 4.3.2 亚精胺对奶山羊成纤维细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色率的影响 |
| 4.3.3 亚精胺对奶山羊成纤维细胞端粒长度的影响 |
| 4.3.4 亚精胺对奶山羊成纤维细胞衰老相关基因 p21、p53 mRNA 表达水平的影响 |
| 4.3.5 亚精胺对奶山羊成纤维细胞活性氧水平的影响 |
| 4.3.6 亚精胺对奶山羊成纤维细胞细胞周期的影响 |
| 4.3.7 亚精胺对奶山羊成纤维细胞衰老相关分泌表型的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）脂肪间充质干细胞联合窄谱中波紫外线对小鼠白癜风模型及内质网应激信号通路的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:脂肪间充质干细胞联合NB-UVB对莫诺苯宗诱导白癜风小鼠的疗效观察 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物与分组 |
| 2.2.2 白癜风小鼠模型的建立 |
| 2.2.3 脂肪间充质干细胞(AMSCs)提取与鉴定 |
| 2.2.4 AMSCs种植及紫外线照射 |
| 2.2.5 疗效评价 |
| 2.2.6 HE染色 |
| 2.2.7 流式细胞 |
| 2.2.8 ELISA检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脂肪间充质干细胞的分离鉴定 |
| 3.2 各组疗效评价结果 |
| 3.3 HE染色 |
| 3.4 流式细胞检测各组小鼠外周血CD4/CD3和CD8/CD3T细胞的比例 |
| 3.5 ELISA检测血浆TYP、MIF、MAO含量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 干细胞移植联合NB-UVB照射在白癜风小鼠中的治疗作用 |
| 4.2 干细胞移植联合紫外照射治疗对白癜风小鼠免疫调节影响 |
| 4.3 干细胞移植联合紫外照射治疗对MAO、TYP、MIF的表达影响 |
| 4.5 干细胞移植联合紫外照射治疗对氧化应激因子的表达影响 |
| 5 结论 |
| 第二部分:脂肪间充质干细胞联合NB-UVB对白癜风小鼠内质网应激的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物模型建立与分组 |
| 2.2.2 ELISA |
| 2.2.3 免疫荧光检测 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ELISA检测血清MDA、MPO和SOD含量 |
| 3.2 免疫荧光检测ROS |
| 3.3 Western blot检测内质网应激相关蛋白 |
| 3.4 qPCR检测内质网应激相关蛋白的mRNA水平 |
| 3.5 免疫荧光检测皮肤内钙离子 |
| 4 讨论 |
| 4.1 干细胞移植联合紫外照射治疗对氧化应激因子表达的影响 |
| 4.2 脂肪间充质干细胞移植联合紫外照射治疗对白癜风小鼠内质网应激的影响 |
| 4.3 脂肪间充质干细胞联合NB-UVB抑制内质网应激减轻白癜风钙离子超载 |
| 5 结论 |
| 第三部分:脂肪间充质干细胞联合NB-UVB激活Nrf2/HO-1信号通路改善白癜风内质网应激损伤 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物模型建立与分组 |
| 2.2.2 人表皮黑色素细胞培养 |
| 2.2.3 氧化应激损伤黑素细胞模型的建立与分组 |
| 2.2.4 紫外照射细胞 |
| 2.2.5 ELISA检测 |
| 2.2.6 免疫荧光检测 |
| 2.2.7 Western blot |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Western blot检测小鼠组织中Nrf2/HO-1信号通路的表达 |
| 3.2 ELISA检测TYP、MIF、MAO含量 |
| 3.3 ELISA检测黑素细胞内氧化应激因子 |
| 3.4 Western blot法检测各组黑素细胞中GRP78、caspase-12、SERCA2a |
| 3.5 免疫荧光检测Ca~(2+)浓度 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 自体脂肪来源干细胞与白癜风治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）潞党参通过IL-15及其受体调控光老化小鼠皮肤炎症反应作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 建立实验动物模型及潞党参对光老化小鼠皮肤组织中炎症因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 潞党参对光老化小鼠皮肤组织中MAPK以及PI3K表达的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 潞党参对光老化小鼠皮肤组织中ERK1/2、Akt表达的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述1 紫外线引起皮肤光老化机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述2 中草药防治皮肤光老化的现代研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（5）新型PI3K/mTOR双重抑制剂GDC-0084抗皮肤鳞状细胞癌（cSCC）细胞作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 :新型PI3K/m TOR双重抑制剂(GDC-0084)体外抗皮肤鳞状细胞癌(c SCC)细胞作用 |
| 1. 研究内容 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 研究结果 |
| 4. 研究结果总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 新型PI3K/m TOR双重抑制剂(GDC-0084)抗皮肤鳞状细胞癌(c SCC)细胞作用机制研究 |
| 1 研究内容 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 研究结果 |
| 4. 研究结果概述 |
| 参考文献 |
| 第三部分 新型 PI3K/mTOR 双重抑制剂(GDC-0084)在体抗皮肤鳞状细胞癌(cSCC)细胞作用及分子机制研究 |
| 研究内容 |
| 研究方法 |
| 研究结果 |
| 研究结果概述 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 皮肤鳞状细胞癌的治疗新靶点 |
| 主要参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（6）瞬时受体电位通道TRPC3在增生性瘢痕中的表达及作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 TRPC3和TGFβ1在人增生性瘢痕的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 激活TRPC3增加成纤维细胞线粒体钙摄取致增生性瘢痕的机制 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:TRP通道与增生性瘢痕研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果及发表的学术论文 |
（7）人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一章 富含干细胞的人皮肤角质形成细胞的获取 |
| 一、试剂和材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 人皮肤角质形成细胞重编程产生诱导性多能干细胞 |
| 一、试剂、材料和使用设备 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 诱导性多能干细胞超微结构的对比研究 |
| 一、试剂材料和仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 总结和展望 |
| 第四章 综述 |
| 综述 1 表皮干细胞增殖和分化机制研究 |
| 参考文献 |
| 综述 2 皮肤干细胞在皮肤再生及创伤修复中的作用 |
| 参考文献 |
| 综述 3 人皮肤源性多潜能干细胞的研究现状和应用前景 |
| 参考文献 |
| 负责科研项目 |
| 参与科研项目 |
| 读博期间发表的论文 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（8）p75NTR在NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 前言 |
| 第一部分 p75~(NTR)在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达及p75~(NTR)过表达/敲低稳定转染细胞株的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 p75~(NTR)对成纤维细胞生物学特性和肌成纤维细胞转分化的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 p75~(NTR)调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 神经生长因子及其受体在创面愈合中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（9）利用人表皮干细胞和成纤维细胞3D打印皮肤组织的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 皮肤创面治疗现状 |
| 1.2 组织工程皮肤的研究及临床应用 |
| 1.3 本课题的研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 皮肤组织 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与材料 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分离培养人皮肤表皮干细胞 |
| 2.2.2 分离培养人皮肤成纤维细胞 |
| 2.2.3 细胞免疫荧光染色 |
| 2.2.4 流式细胞分析 |
| 2.2.5 细胞MTT实验 |
| 2.2.6 3D打印支架材料的制备 |
| 2.2.7 微挤压打印皮肤组织及培养 |
| 2.2.8 3D打印皮肤组织冰冻切片制作 |
| 2.2.9 3D打印皮肤组织HE染色 |
| 2.2.10 3D打印皮肤组织免疫荧光染色 |
| 2.2.11 3D打印皮肤组织细胞活性检测 |
| 2.2.12 皮肤组织屏障功能检测 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 3D打印种子细胞的准备 |
| 3.1.1 人皮肤组织表皮干细胞的分离培养与鉴定 |
| 3.1.2 人皮肤组织成纤维细胞的分离培养与鉴定 |
| 3.2 3D打印种子细胞培养条件的优化 |
| 3.3 3D打印皮肤组织 |
| 3.3.1 3D打印支架材料的选用及打印性能 |
| 3.3.2 3D打印真皮层成纤维细胞浓度的确定 |
| 3.3.3 3D打印皮肤组织中细胞的活性 |
| 3.3.4 3D打印皮肤组织中细胞的增殖 |
| 3.3.5 3D打印皮肤组织的形态与结构 |
| 3.3.6 3D打印皮肤组织的屏障功能 |
| 4 讨论 |
| 4.1 3D打印皮肤组织种子细胞的准备 |
| 4.2 3D打印组织培养条件的优化 |
| 4.3 3D打印机的选用 |
| 4.4 3D打印皮肤组织支架材料的选用 |
| 4.5 3D打印皮肤生物墨水成分的优化 |
| 4.6 3D打印皮肤组织的结构与功能 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: 3D生物打印在组织工程皮肤研究中的应用与进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）人源内皮克隆形成细胞（ECFCs）旁分泌对成熟血管和皮肤细胞生物学影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 ECFCs细胞的提取 |
| 3.2 ECFCs细胞传代 |
| 3.3 ECFCs细胞冻存 |
| 3.4 ECFCs表面抗原检测 |
| 3.5 ECFCs检测鉴定--免疫荧光标记 |
| 3.6 Matrigel基质胶成管实验 |
| 3.7 细胞条件培养基ECFCs-CM的制备 |
| 3.8 抗体芯片检测ECFCs-CM中细胞因子表达 |
| 3.9 ELISA法检测ECFCs-CM中细胞因子表达情况 |
| 3.10 CCK8检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs增殖能力的影响 |
| 3.11 迁移--划痕实验 |
| 3.12 迁移--transwell共培养 |
| 3.13 细胞凋亡 |
| 3.14 细胞周期检测 |
| 3.15 丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶的制备及表征检测 |
| 4 数据处理和统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 ECFCs培养及传代 |
| 5.2 免疫荧光染色ECFCs检测鉴定 |
| 5.3 流式细胞仪检测ECFCs表面抗原检测鉴定 |
| 5.4 ECFCs细胞的成管能力检测 |
| 5.5 抗体芯片法检测ECFCs-CM细胞因子表达 |
| 5.6 ELISA法检测ECFCs-CM中细胞因子表达情况 |
| 5.7 CCK-8法检测ECFCs-CM对HUVECs增殖能力的影响 |
| 5.8 CCK-8法检测ECFCs-CM对HDFs增殖能力的影响 |
| 5.9 细胞划痕法检测ECFCs-CM对HUVECs迁移能力的影响 |
| 5.10 细胞划痕法检测ECFCs-CM对HDFs迁移能力的影响 |
| 5.11 Transwell间接共培养法检测ECFCs-CM对HUVECs迁移能力的影响 |
| 5.12 Transwell间接共培养法检测ECFCs-CM对HDFs迁移能力的影响 |
| 5.13 流式细胞仪法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞凋亡的影响 |
| 5.14 流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs细胞周期的影响 |
| 5.15 流式细胞仪检测ECFCs-CM对HDFs细胞周期的影响 |
| 5.16 SF/ALG水凝胶合成大体形态观察 |
| 5.17 SF/ALG水凝胶傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析 |
| 5.18 SF/ALG水凝胶孔隙率分析 |
| 6 讨论 |
| 6.1 为什么选择人源性ECFCs作为糖尿病慢性损伤修复的细胞 |
| 6.2 如何通过表面抗原检测鉴定ECFCs细胞 |
| 6.3 为何采用抗体芯片法对ECFCs-CM中细胞因子进行检测 |
| 6.4 ECFCs-CM中细胞因子表达情况的分析 |
| 6.5 ECFCs-CM对HUVECs和HDFs增殖能力的影响 |
| 6.6 胞划痕法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs迁移能力的影响 |
| 6.7 Transwell间接共培养法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs迁移能力的影响 |
| 7 结论 |
| 8 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间科研着作情况 |
| 致谢 |
四、人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究（论文参考文献）
- [1]绵羊皮肤前体细胞分离培养[D]. 韩梅. 中国农业科学院, 2021
- [2]萨能奶山羊耳缘成纤维细胞分离培养及抗衰老研究[D]. 盘婕. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]脂肪间充质干细胞联合窄谱中波紫外线对小鼠白癜风模型及内质网应激信号通路的作用研究[D]. 卞媛媛. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]潞党参通过IL-15及其受体调控光老化小鼠皮肤炎症反应作用机制[D]. 王明月. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [5]新型PI3K/mTOR双重抑制剂GDC-0084抗皮肤鳞状细胞癌（cSCC）细胞作用及分子机制研究[D]. 丁羚涛. 苏州大学, 2020(06)
- [6]瞬时受体电位通道TRPC3在增生性瘢痕中的表达及作用[D]. 夏唯杰. 重庆医科大学, 2020(12)
- [7]人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究[D]. 杨玉花. 苏州大学, 2020(06)
- [8]p75NTR在NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化中的作用及机制研究[D]. 刘振兴. 山东大学, 2020(01)
- [9]利用人表皮干细胞和成纤维细胞3D打印皮肤组织的初步研究[D]. 苏浩. 扬州大学, 2020
- [10]人源内皮克隆形成细胞（ECFCs）旁分泌对成熟血管和皮肤细胞生物学影响的实验研究[D]. 郭晓瑞. 南方医科大学, 2020(01)