一、套式PCR法检测慢性丙肝患者PBMC及血清中HCV-RNA的意义（论文文献综述）
戴俊斌[1]（2019）在《湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析》文中研究表明目的:1.根据HCV基因NS5B区段设计引物,对湖南省吸毒人群HCV患者的HCV病毒基因进行分型。2.探讨湖南省吸毒人群中HCV基因型的分布特点,为对该人群中HCV阳性者进行精确治疗提供指导和帮助。方法:收集湖南省内14个市州18岁以上、未接受抗病毒治疗、既往HCV抗体阳性的吸毒患者的血浆样本,每市州样本15份,共210份。对收集到的血浆样本分别进行HCV抗体ELISA复检、荧光PCR法定量HCV-RNA检测和基因分型检测。结果:在210名调查对象中,ELISA法复检HCV抗体阳性标本202例,阳性率96.19%;荧光PCR法检出HCV-RNA病毒载量>15IU/m L标本181例,阳性率86.19%。HCV基因型分别为1型18例（9.94%）,2型51例（28.18%）,3型47例（25.97%）,其他型别65例（35.91%）。区域分布以非1型为主,2型和3型普遍分布。结论:湖南省吸毒患者HCV基因型比较复杂,区域分布以非1型为主,2型和3型普遍分布,需进一步研究。
聂静敏,胡凤玉,许敏,陈伟烈,何浩岚,李凌华,蔡卫平,唐小平[2]（2016）在《丙型肝炎患者抗病毒治疗后外周血单个核细胞内病毒RNA的检测及其与疗效的关系》文中研究表明目的观察慢性丙型肝炎患者在聚乙二醇干扰素α-2a（Peg IFNα-2a）联合利巴韦林（RBV）抗病毒治疗前、后血清及PBMC内HCV RNA的变化,初步探讨PBMC内HCV RNA检测的临床意义。方法 2013年6月至2014年12月在广州市第八人民医院感染科就诊的慢性丙型肝炎患者20例,在治疗前、后的不同时间点（0、2、4、12、24、36、48周）采集患者外周血,分离血浆和PBMC;采用精确荧光定量方法（Cobas TaqMan实时PCR）检测丙型肝炎患者血浆HCV RNA;采用实时-PCR、套式PCR两种方法分别检测PBMC内HCV RNA。计数资料采用x2检验。结果 Cobas精确定量检测各时间点血浆中HCV RNA分别为（5.92±0.86）、（2.77±1.32）、（1.30±1.72）、（0.15±0.47）、0、0和（0.06±0.26）lgIU/mL;各时间点差异有统计学意义（F=148.06,P<0.01）。12周时有18例患者血浆中HCV RNA完全清除。套式PCR较实时PCR阳性率高（均P<0.01）;20例患者血浆病毒载量及PBMC中HCV RNA检测结果发现,PBMC中HCV RNA清除速率较血浆明显延迟,其中2例PBMC中HCV RNA持续性存在并在治疗结束24周后复发。结论慢性丙型肝炎患者PBMC中可以检测到HCV RNA,且套式PCR检测较实时PCR检测阳性率高;抗病毒治疗对PBMC内、外的HCV均有效,但PBMC中HCV RNA清除速率较血浆明显延迟;干扰素抗病毒过程中PBMC内HCV清除缓慢,预示存在治疗后复发的风险。
王俊洁[3]（2015）在《宿主MDR1多态性及HCV基因组变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗复发的影响》文中进行了进一步梳理研究背景和目的丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）主要经血液途径传播,感染HCV后,50%-80%将进展为慢性状态,其中20%-30%的患者将发展为肝硬化或肝癌。据世界卫生组织（WHO）统计目前全球有接近1.8亿人感染HCV。我国抗-HCV阳性率在不同地区有较大差异,2006年以营养调查人群剩余血清进行的研究显示,在1-59岁的一般人群中抗-HCV阳性率约为0.43%（不包括特殊人群和高发地区的研究）。遗憾的是,目前还没有针对丙型肝炎有效的预防性疫苗,预防HCV传播的主要措施还依赖于安全输血和侵袭性操作。HCV感染后症状隐匿,又有相当一部分患者的ALT在正常范围内或仅有轻度升高而未引起重视,等到就诊时已是肝硬化,甚至是失代偿肝病,失去了最佳治疗时机。在未来二十年内,丙肝相关终末期肝病患者的数量将持续增长,会成为世界性的医学、社会难题和经济负担。目前公认的慢性丙型肝炎（Chronic hepatitis C,CHC）标准治疗方案（Standard of care,SOC）是聚乙二醇干扰素（Peg-IFN α）联合利巴韦林（ribavirin,RBV）抗病毒治疗,基因型不同,抗病毒治疗药物方案、疗程不同,且抗病毒治疗的持续病毒学应答率（Sustained virological response,SVR）也存在差异。各大指南均明确指出,基因1型的治疗疗程为48周,而非1型（2/3型）的疗程为24周。基因1型患者,治疗结束SVR率约为40%-50%;基因2型、3型的感染者SVR率能够达到75%-80%。也就是说,仍有不少患者在忍受了 SOC治疗的各种副作用和较大费用代价后,依然没有获得疗效。抗病毒治疗失败的表现包括3类:完全无应答（non-response）、治疗过程中反弹（breakthrough）及停药后复发（relapse）。临床上将这些初始治疗无应答或治疗后复发及没有获得SVR的患者,定义为“难治性丙型肝炎”,这已成为临床上的难点和研究上的热点。对于难治性丙型肝炎的发生机制众说纷纭,尚无定论。从宿主因素和病毒因素着手深入研究干扰素抵抗现象发生的分子机制,为丙型肝炎患者抗病毒治疗提供疗效预测指标,将有助于进入慢性丙型肝炎个体化治疗的时代。HCV感染是宿主与病毒相互作用的一个过程,最近十年来,为数众多的宿主相关因子基因多态性被发现与丙型肝炎的抗病毒治疗失败相关。自2009年以来,全球多项研究发现人基因组编码干扰素的基因IL28B附近rs12979860和rs8099917 位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）与聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗应答有关,这一发现标志着在HCV研究领域对宿主基因多态性的认识进入新的阶段。随后,陆续有研究发现了其他宿主因子多态性对SVR的作用,包括RBV摄取和代谢相关的平衡和集中核苷酸转运因子（equilibrative nucleoside transporters,ENTs;concentrative nucleoside transporters,CNTs）、苷三磷酸酶基因（inosine triphosphatase,ITPA）及维生素 D信号通路调节因子等,其多态性与抗病毒治疗失败有关。多药耐药基因（Multidrug resistance 1,MDR1）位于人类第7号染色体,基因全长约209kb,可编码药物转运蛋白P（P-glycoprotein,P-gp）。P-gp是一个分子量大小为170kDa的膜蛋白,高表达于肝脏、小肠、结肠和血脑屏障等器官,依赖主动运输能量通过限制物质的肠道吸收或增加其胆道和尿液的排泄,将外源性化学物质从细胞内泵出体外,是影响药物吸收、代谢、分布和排泄的重要蛋白,近年来大量研究证实了遗传因素在个体间P-gp表达和功能的差异中扮演了重要角色,MDR1多态性可能会影响P-gp的活性和功能。自1989年Kioka等首次描述MDR1的SNPs以来,迄今已发现50多个SNPs,其中外显子21、26和12的G2677T/A、C3435T和C1236T SNP是MDR1编码区最常见的突变位点,且它们间有一定的连锁,连锁程度在不同种族间差异很大。既往MDR1基因多态性的研究多集中于肿瘤发生、化疗耐药等方面,目前还没有关于MDR1 3435多态性与中国CHC接受SOC治疗效果的关系的研究。HCV基因型是影响抗病毒疗效的最主要因素,因为基因1型感染者SVR率（40%-50%）显着低于基因2/3型（75%-80%）,这说明病毒因素在干扰素抗病毒治疗中起着重要作用,提示应该着重从病毒因素开展相应研究。目前已有大量研究表明多个HCV蛋白与干扰素抵抗发生相关,如Core（尤其是aa70/91）,E2 上的 PePHD、HVR1、HVR2、HVR3,NS3/NS4A 及 NS5A 上的 ISDR、PKR-BD、V3、V4和IRRDR等。但是这些研究尚未达成明确的共识,并且体内和体外的研究结果还得出了相互矛盾的结论。多数研究仅分析了单一时间点（通常为治疗基线,非纵向观察队列）,将达到SVR的患者与未达到SVR患者体内HCV的某段功能基因序列与某一指定GenBank里的HCV序列进行比对,并不能反映出在机体和/或干扰素调节的免疫压力下病毒的适应性演变过程。并且这种比较很难排除个体基因遗传背景的差异以及不同患者间的宿主因素差异对治疗结果的影响。SOC方案治疗有很多副作用和禁忌症,且花费昂贵,致使部分患者无法完成全程治疗或无法接受该治疗方案。近期FDA批准NS5B聚合酶抑制剂（sofosbuvir,SOF）用于治疗CHC,开启了 CHC的无IFN治疗时代,SVR率高达95%以上,且疗程更短、副作用更少;但也随之而来的是高额经济负担。根据我国国情,近几年治疗HCV感染的方案仍以将Peg-IFN-α联合RBV为主。因此,积极探索能够预测抗病毒治疗疗效的因素,对患者避免治疗带来的高风险、降低药物的毒副作用以及合理的进行个体化治疗,具有重要的临床实践意义。上述关于丙型肝炎病毒方面及宿主基因多态性方面的研究,都需要血标本,标本的数量和质量对于课题的顺利展开是不可或缺的。为了合理利用病例资源,迅速为研究者提供高质量、大数量的HCV标本,缩短课题研究周期,促进HCV研究,有必要建立HCV标本库。此外,对于华南地区的CHC而言,有多少患者属于“难治性丙型肝炎”?这些患者临床特征如何呢?抗病毒治疗失败的患者,表现为治疗中无应答、治疗过程中发生病毒学突破还是停药后复发呢?有无其他因素（宿主基因多态性位点或者病毒突变位点）可以预测抗病毒治疗失败呢?本研究首先扩大完善了我国华南地区丙肝标本库,随后从中选择完成SOC治疗并至少随访24周的患者,分析患者经抗病毒治疗后的临床转归,揭示抗病毒治疗失败患者尤其是停药后复发患者的临床特点。其次,从宿主基因多态性方面,以第一部分停药后复发患者为研究对象,匹配其他已知的影响抗病毒疗效的因素后,分析MDR1C3435T对SVR的影响。最后,从病毒突变方面,分析NS5A氨基酸突变对SVR的影响;并构建纵向研究队列,采集停药后复发患者的基线和停药后复发两个时间点的血清用于HCV全序列扩增和分析,以期进一步发掘HCV可能与抗病毒治疗失败相关的特征性氨基酸替换位点/类型或功能区域。第一If部分慢性丙型肝炎干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗失败患者的临床特点研究研究方法纳入2009年1月～2014年12月就诊于南方医科大学附属南方医院感染内科门诊和住院部,确诊为慢性丙型肝炎的患者（均符合《病毒性肝炎防治方案》）,收集患者临床资料及血液标本,定期随访,完善资料。在课题组前期基础上扩大、扩充标本库。随后从中选择237例完成抗病毒治疗（普通干扰素或长效干扰素联合利巴韦林）并至少随访24周的丙型肝炎病毒慢性感染者,系统分析这部分患者的临床特点,特别是难治性CHC患者和反复复发的CHC患者的临床特点。统计学分析:计数资料采用卡方检验;计量资料组间比较采用one-way ANOVA统计分析;连续性变量呈偏态分布资料的组间比较,采用Kruskal-Wallis检验统计分析。P<0.05有统计学差异,所有统计学分析使用SPSS13.0。结果1、扩大并完善华南地区丙肝标本库,已纳入慢性丙型肝炎患者758例,血清标本1052份,PBMC标本195例;患者流行病学及临床资料完善。427例CHC进行HCV基因分型检测,149例CHC进行IL28B rs12979860检测,98例进行IL28Brs8099917 检测。2、237例慢性丙型肝炎患者完成SOC治疗并至少随访24周,总体SVR率为 66.2%（157/237,2a/3a/3b 疗效最好,6a 次之,1b 最低）。3、80例抗病毒治疗失败患者的类型,5例治疗中反弹（6.25%）,22例完全无应答（27.5%）,53例停药后复发（66.25%）。4、53例停药后复发患者特点:（1）基因型分布:1b型43例,6a型7例,其他基因型3例;（2）复发时间分布:停药后4周:13例、停药后12周:25例、停药后24周:12例、停药后48周:2例、停药后72周:1例;（3）感染途。径分布:40例经输血或使用血液制品感染（75.5%）,3例经静脉吸毒感染,5例经纹身、穿耳孔、刮脸、小诊所牙科治疗等未严格消毒的操作感染,还有5例传播途径不明。第二部分宿主MDR1 C3435T多态型对慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的影响研究方法从第一部分237例研究对象中纳入109例1b亚型慢性丙型肝炎（CHC）患者。所有患者接受长效干扰素135ug/180ug（每周）联合利巴韦林1000mg（体重<75kg）/1200（体重>75kg）（每天）,疗程为48周,治疗结束后至少随访24周。采用我们先期开发的高敏感、高特异的四引物扩增阻滞突变体系聚合酶链反应法对MDR1 3435进行分型,并从中取部分样本行PCR扩增后直接测序,BioEdit分析测序峰图进行分型验证。分析MDR1 3435多态性与抗病毒治疗复发的关系。统计学分析:组间比较采用两独立样本t检验行统计分析,连续性变量呈偏态分布资料的组间比较采用Mann-Whitney U检验行统计分析。P<0.05差异有统计学意义。结果1、建立四引物扩增阻滞突变体系聚合酶链反应法（T-ARMS-PCR）进行MDR1 3435基因分型,是一种特异、敏感、简洁的检测方法。2、109例1b型CHC患者,男性67例,女性42例;MDR1基因第26外显子3435基因型分布:CC型51例,CT型为49例,TT型为9例。3、109例1b型CHC接受SOC后,65例获得SVR,总体SVR为59.6%;SVR 和 Non-SVR 两组患者的基线 IL28B rs12979860 基因型、ALT、AST、ALB、WBC、PLT及合并肝硬化比例,均无统计学差异（P值分别为:0.880、0.946、0.053、0.737、0.069、0.817,均>0.05）。4、SVR 组中,3435 CC 型、CT 型、TT 型各为 21 例（32.3%）、36 例（55.4%）和8例（12.3%）;非SVR组中,3435 CC型、CT型、TT型分别为30例（68.2%）、13例（29.5%）和1例（2.3%）。两组MDR1 3435基因型存在显着差异（χ2=14.31,P=0.001）。第三部分抗病毒治疗复发的慢性丙型肝炎患者治疗前后病毒变异情况研究研究方法从本研究第一部分建立的丙肝标本库中,选择70例基因1b型CHC,接受IFN/RBV抗病毒治疗并至少随访24周,扩增HCV NS5A;随后再从中选择1b和6a型慢性丙型肝炎抗病毒治疗复发患者各2例。采用血清微量HCV RNA抽提技术、长片段PCR扩增和测序技术、HCV全长读码框序列的拼接技术等获取患者初治基线和停药后复发两个时间点的全长基因组HCV序列,通过Vector NTI软件、MEGA 4软件比对分析碱基和氨基酸的变异和进化情况。结果1、HCV 1b亚型NS5A氨基酸变异数目与IFN/RBV治疗后的SVR明显相关,尤其是 ISDR/PKRBD 区（Z=-3.814,P<0.001;Z=-2.308,P=0.021）,该区域氨基酸突变数目越多,则SVR率越高。2、成功扩增2例1b亚型慢性丙型肝炎Peg-IFN/RBV治疗复发患者的HCV RNA全基因组,2例6a型扩增、测序尚在进行中。3、2例1b亚型复发患者基线与停药后复发的比较,HCV功能蛋白E2和NS5A区域的变异率较高（E2蛋白,核苷酸突变比例为17.4%和19.4%,氨基酸突变比例为16.3%和16.5%;NS5A蛋白,核苷酸突变比例为23.7%和16.2%,氨基酸突变比例为30.8%和27.8%）。结论1、扩大、完善了华南地区慢性丙型肝炎感染者的临床资料标本库,该标本库的建立将为HCV的基础和临床研究提供平台。2、华南地区CHC接受干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗,总体SVR率为66.2%（157/237）,2a/3a/3b 疗效最好（78.79%）,6a 次之（75%）,1b 最低（60.14%）。抗病毒治疗失败,多表现为停药后复发,停药后24周内为复发高危时期,但停药72周还可能复发,应延长随访时间。3、四引物扩增阻滞突变体系聚合酶链反应法（T-ARMS-PCR）是一种特异、敏感、简洁的MDR1 3435基因分型方法;MDR1 C3435T突变与基因1b型CHC患者抗病毒治疗应答有关,MDR1 3435CT/TT基因型获得SVR的比例显着高于MDR1 3435CC 基因型。4、HCV 1b亚型NS5A氨基酸变异数目与IFN/RBV治疗后的SVR明显相关,尤其是ISDR/PKRBD区,该区域氨基酸突变数目越多,则SVR率越高。经IFN/RBV治疗停药后复发的1b亚型患者,HCV功能蛋白E2和NS5A区域的变异率较高。
赵会芳[4]（2014）在《IFN-λ与丙型肝炎患者应用IFN-α抗病毒治疗疗效的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染可引起肝脏急慢性炎症，据世界卫生组织统计，全球约有1.8亿人感染HCV，其中约有4250万感染者在中国。约有20%-30%的HCV感染者在急性期可以自发清除病毒，而大部分HCV感染者转化为慢性丙型肝炎（Chronic Hepatitis C, CHC），其中30%CHC患者可进展为肝硬化，而且CHC患者发生肝细胞癌的机会为正常人的20-30倍。因此CHC已成为值得关注的全球性公众健康问题，迫切需要有效的抗病毒治疗方案。干扰素（interferon，IFN）是机体细胞在受到某些病毒感染后所分泌的一类特异性细胞因子，具有抗病毒、免疫调节及抗细胞增殖等多种生物学活性，根据IFN的氨基酸序列和生物学活性可分为三类：I、Ⅱ、Ⅲ型。I型INF包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-δ和IFN-ζ等，其中IFN-α为临床上应用比较广泛的抗病毒药物之一；Ⅱ型INF仅有1种为IFN-γ；Ⅲ型INF即IFN-λ，包括IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28A）和IFN-λ3（IL-28B）。目前标准的抗HCV治疗方案为聚乙二醇化干扰素-α（pegylated interferon α, PEG-IFN-α）联合利巴韦林（ribavirin, RBV），治疗4周时HCV-RNA转阴（HCV-RNA<1000IU/ml）为快速病毒学应答（rapidvirologic response, RVR），若治疗治疗4周时HCV-RNA仍为阳性至治疗12周时HCV-RNA转阴（HCV-RNA<1000IU/ml）为早期病毒学应答（eralyvirologic response, EVR）。已有研究证实RVR和EVR能很好的预测持续病毒学应答（sustained virological response，SVR）即治疗结束24周HCV-RNA小于1000IU/ml，其中获得RVR的患者约88%-100%可获得SVR，一旦达到SVR,99%以上可以维持病毒学应答5年甚至更久。但并不是所有丙型肝炎患者都可以获得满意的抗病毒疗效，影响抗病毒疗效的因素有病毒因素（如HCV基因型、基线病毒载量等）、药物因素（如IFN-α种类、IFN-α和RBV有明显的血液学和神经系统抑制等不良反应、IFN-α药代动力学特点等）、宿主因素［如对IFN-α耐受性不佳、免疫应答状态、IL-28B单核苷酸基因多态性（single nucleotide polyorphism, SNP）等］。近几年一系列全基因组关联分析研究报道了丙型肝炎患者的IL-28BSNP不同位点的基因型（rs12979860、rs8099917、rs12980275）与抗病毒治疗应答密切相关，携带保护性基因型的丙型肝炎患者自发清除病毒、获得SVR的机率比携带非保护基因型的患者高，同时发现携带保护性基因型的丙型肝炎患者血清中的IL-29、IL-28A、IL-28B水平和外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的IL-29mRNA、IL-28AmRNA、IL-28B mRNA水平均高于携带非保护性基因型的患者，丙型肝炎患者血清中IL-29水平低于正常人、而IL-28A水平高于正常人，丙型肝炎患者肝组织中IL-28A mRNA和IL-29mRNA的表达高于正常人。已有研究证实，IFN-λ与IFN-α的结合受体及分布不同，但它们可以通过相同的信号传导通路，传导活化信号、诱导一系列干扰素激活基因的表达，IFN-λ与IFN-α可协同发挥抗病毒作用。上述研究表明，丙型肝炎患者IL-28B SNP与抗病毒治疗疗效密切相关，丙型肝炎患者体内IFN-λ水平与抗病毒治疗疗效可能有相关性。已有研究证实，RVR和EVR可以很好的预测SVR，其中RVR能更好的预测SVR，本研究根据患者应用IFN-α治疗4周时HCV-RNA是否转阴分为快速病毒学应答（RVR）组和非快速病毒学应答（N-RVR）组，旨在探讨丙型肝炎患者体内IL-28B rs12979860基因型、IFN-λ水平与其应用IFN-α抗病毒治疗获得RVR是否有相关性及其临床意义。方法：选取丙型病毒性肝炎患者45例，根据患者应用IFN-α治疗4周时HCV-RNA是否转阴（HCV-RNA<1000IU/ml）分为快速病毒学应答（RVR）组21例和非快速病毒学应答组（N-RVR）组24例，另外设健康对照组（Normal）组15例。1病毒学指标检测：应用微粒子酶联免疫法检测抗-HCV，采用荧光定量聚合酶链反应法检测HCV-RNA水平。2收集血清，应用ELISA法检测血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平。3收集新鲜外周抗凝血，用密度梯度离心法分离收集PBMCs：Trizol法抽提提取PBMCs中的总RNA，应用RT-PCR法检测PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA相对表达水平；提取PBMC中总蛋白，应用Western blot法检测外周血PBMC中IL-29、IL-28A和IL28B蛋白表达水平。4留取丙型肝炎患者外周（含EDTA）抗凝全血，提取DNA，应用TapManMGB蛋白探针法检测IL-28B rs12979860基因型。结果：1血清中IL-29、IL-28A和IL-28B的表达水平1.1健康对照组血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平分别为（11.78±0.78）、（268.13±9.82）、（267.26±8.26）。1.2丙型肝炎患者在干扰素-α治疗前（0周）血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平：RVR组分别为（13.32±1.34）、（273.11±8.78）、（293.67±7.38）；N-RVR组分别为（10.58±1.44）、（243.05±9.48）、（254.85±8.67）。1.3丙型肝炎患者在干扰素-α治疗4周时血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平：RVR组分别为（12.90±1.04）、（288.49±13.50）、（308.53±9.48）；N-RVR组分别为（10.14±0.46）、（253.53±4.37）、（247.34±6.39）。采用SPSS13.0软件统计学处理以上结果得出：RVR组血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平在治疗前、治疗4周时均明显高于N-RVR组，P <0.01差异有统计学意义（Table1）；而健康对照组处于RVR组和N-RVR组之间，其中IL-28B的水平明显低于RVR组、高于N-RVR组，P <0.01，差异有统计学意义（Table1）；丙型肝炎患者在干扰素-α治疗前与治疗4周血清中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平变化不大。2将PBMCs中GAPDH的表达量设定为1.00，与GAPDH表达量相比，得出IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA相对表达水平2.1健康对照组PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表达水平分别为（0.76±0.02）、（0.68±0.02）、（0.70±0.02）。2.2丙型肝炎患者在干扰素-α治疗前（0周）PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表达水平：RVR组分别为（0.80±0.02）、（0.79±0.02）、（0.72±0.02）；N-RVR组分别为（0.71±0.02）、（0.65±0.02）、（0.68±0.01）。2.3丙型肝炎患者在干扰素-α治疗4周时PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表达水平：RVR组分别为（0.80±0.02）、（0.79±0.01）、（0.74±0.02）；N-RVR组分别为（0.70±0.01）、（0.64±0.01）、（0.66±0.01）。采用SPSS13.0软件统计学处理以上结果得出：RVR组PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表达水平在治疗前、治疗4周时均明显高于N-RVR组，P <0.01，差异有统计学意义（Table2）；而健康对照组处于RVR组和N-RVR组之间，其中IL-28A的mRNA表达水平低于RVR组，P <0.01，差异有统计学意义（Table2）；丙型肝炎患者在干扰素-α治疗前与治疗4周PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B的mRNA表达水平变化不大。3将PBMC中内参β-actin相对表达量设定为1.00，与β-actin表达量相比较，得出IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表达水平：3.1健康对照组PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表达水平分别为（0.67±0.12）、（0.58±0.13）、（0.70±0.11）。3.2丙型肝炎患者在干扰素-α治疗前（0周）PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表达水平：RVR组分别为（0.73±0.01）、（0.69±0.03）、（0.73±0.03）；N-RVR组分别为（0.52±0.02）、（0.48±0.03）、（0.53±0.03）。3.3丙型肝炎患者在干扰素-α治疗4周时PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表达水平：RVR组分别为（0.73±0.09）、（0.70±0.11）、（0.77±0.09）；N-RVR组分别为（0.55±0.09）、（0.50±0.10）、（0.57±0.09）。采用SPSS13.0软件统计学处理以上结果得出：RVR组PBMCs中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白表达水平在治疗前、治疗4周时均明显高于N-RVR组，P <0.05，差异有统计学意义（见Table3）；丙型肝炎患者在干扰素-α治疗前与治疗4周PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B蛋白的表达水平变化不大。4IL-28B rs12979860CC型丙型肝炎患者血清和PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B水平明显高于CT和TT型患者，P <0.05差异具有统计学意义；CT型患者血清和PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B水平介于CC和TT型患者之间，其中血清中IL-28B水平明显高于TT型患者，PBMC中IL-28A mRNA水平明显高于TT型患者，P <0.05差异具有统计学意义（见Table4/5/6）。5Pearson卡方相关分析法分析三种IL-28B rs12979860基因型与RVR率的关系，结果：IL-28B rs12979860CC基因型携带者获得RVR率明显高于CT、TT基因型携带者（见Table7）。6将丙型肝炎患者HCV-RNA基线水平、HCV分型、IL-28B rs12979860基因型、PBMC和血清中IL-29、IL-28A、IL-28B水平等多种因素与IFN-α抗病毒应答疗效进行logistic回归分析（Table8）；6.1通过向后逐步排除法，进入回归方程的自变量为X3、X6、X12；卡方检验，χ2=32.183， P<0.01，回归方程有统计学意义。回归方程：logitP=-2.76+2.94X3+3.30X6+6.58X12。6.2X3、X6、X12的logistic回归系数反应对RVR/N-RVR的影响：IL28B CC基因型对获得RVR的优势比（OR）为5.06；PBMC中IL28B mRNA水平每增加一个等级对获得RVR的优势比为6.28； PBMC中IL28B蛋白水平每增加一个等级对获得RVR的优势比为13.87。结论：1丙型肝炎患者血清和PBMC中IL-29、IL-28A、IL-28B的水平与RVR密切相关。2IL-28B rs12979860CC基因型与RVR密切相关。3IL-28B rs12979860CC基因型、PBMC中在基因和蛋白水平高表达的IL-28B可能是RVR的预测因素。
刘扬[5]（2013）在《CHC患者血清TNF-α、IL-10水平及其与病毒载量、ALT、AST关系探讨》文中研究说明目的：研究慢性丙型肝炎患者血清TNF-α、IL-10水平及其与HCV RNA载量、ALT、AST水平的关系,并探讨其导致肝脏损害的机制。方法：用酶联免疫吸附法（ELISA）检测112例慢性丙型肝炎患者、40例健康对照者血清中TNF-α、IL-10的水平。用PCR-荧光探针法检测血清HCVRNA水平。使用全自动生化分析仪检测ALT、AST含量。结果：慢性丙型肝炎患者组TNF-α、IL-10的水平均高于健康对照组（P=0.000,=0.000）,在慢丙肝患者中,轻度组TNF-α,的水平均低于中度重度组,而轻度与中度组间差异无统计学意义（P=0.023,P=0.000,P=0.106）,而IL-10水平在轻、中、重三组之间差异均无统计学意义（F=1.555,P=0.221）。随着HCV RNA载量的升高,血清IL-10水平逐渐升高,各组之间差异有统计学意义（F=13.429,P=0.000）。而TNF-α在不同HCV RNA载量组之间均无显着性差异（F=1.212,P=0.302）。TNF-α与ALT、AST呈正相关,而与HCV RNA无相关性（P=O.000,P=0.000,P=0.105）,IL-10与HCV RNA呈正关,与ALT、AST无相关性（P=0.000,P=0.147,P=0.102）, HCV RNA载量与ALT. AST水平无相关性（P=0.065,P=0.071）。结论：血清TNF-a水平随着病情程度的加重升高,IL-10随着HCV RNA载量升高而升高,TNF-α与IL-10是引起丙型肝炎肝脏损害及慢性化的重要因素,检测TNF-α与IL-10水平可作为判断慢性HCV感染情况的指标。
黎氏白贤（LE THI BACH HIEN）[6]（2013）在《益气清化法联合干扰素治疗慢性丙型肝炎正虚邪恋证的临床研究》文中认为丙型病毒性肝炎是由丙肝病毒感染引起的一种感染病。丙型病毒性肝炎流行范围之广、发病率之高、危害性之大,居各种传染病之首、症状表现多种多样,现代医学应用抗病毒药治疗取得了一定疗效,但长期疗效差、复发率高,因为病毒的变异性比较高,而且抗病毒药的副作用也不少。近年来中医药对丙型性肝炎的机理研究及辨证治疗显示了一定的优越性。A.研究背景慢性丙型肝发病率高,知晓率低,是引起肝硬化、肝癌主要原因之一,感染25-30年后肝硬化发生率为5%-25%,是影响重大传染病。临床治疗慢性丙型肝炎的西药主要是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林为标准方案,其适应征要求严格、且禁忌症和副作用较多等局限性。中医药用于防治慢性丙型肝炎具有较大优势。在此背景下,本课题用中西医结合治疗慢性丙型肝炎的临床研究,探讨安全、有效的临床治疗方案。B.研究目的：根据中医理论与临床观察,明确中药益气清化法联合干扰素治疗慢性丙型肝炎正虚邪恋证能改善症状,恢复肝功能、抑制病毒复制、改善肝组织损伤、防治肝纤维化及癌变,从而提高临床益气清化法治疗慢性丙型肝炎的疗效。C.研究方法：本研究以确诊为慢性丙型肝炎正虚邪恋证进行临床研究,通过随机对照,观察60例患者,随机分2组,其中治疗组30例,对照组30例,疗程为48周。观察两组患者在治疗前、治疗12周及治疗结束时的综合疗效、抗病毒疗效、症候疗效、中医症候积分、肝功能、肝脾B超的变化及安全性指标,进行比较两组的治疗效果。治疗组（中西医结合治疗组）：聚乙二醇干扰素180ug,皮下注射,每周一次。利巴韦林,每天900mg分三次口服,早中晚各300mg。中药基本方,每天1剂,每天两次（中药基本方组成：黄芪15g、白术15g、栀子15g、苦参15g、胡黄连6g）对照组（西医治疗组）：聚乙二醇干扰素180ug,皮下注射,每周一次。利巴韦林,每天900mg分三次口服,早中晚各300mg。D.研究结果：1.治疗组有效率为90%,对照组总有效率为73.3%,治疗组整体疗效与对照组相比,治疗组明显优于对照组（P<0.05）,表明本研究中药结合干扰素治疗慢性丙型肝炎正虚邪恋证的疗效比对照组单纯用干扰素疗效较佳。两组总体疗效比较明显着差：。治疗组30例,有效27例（90%）,无效3例（10%）,总有效率90%对照组30例,有效24例（73.3%）,无效8例（26.7%）,总有效率为73.3%。2.益气清化法结合干扰素治疗慢性丙型性肝炎正虚邪恋证能改善临床症状体征：两组治疗前症状体征分布无明显差异,差异无统计学意义,具有可比性（P>0.05）。两组患者治疗后乏力、腹胀、黄疸、口干口苦、肝脾肿大、怯冷或热症状均有显着性差异,差异有统计学意义（P<0.05）；纳差、便溏、胁痛、腰膝酸软症状有非常显着改善,差异有统计学意义（P<0.01）。由治疗组的症状积分均数0.6908>对照组的症状积分均数0.6817,可以认为治疗组的症状积分转化率数高于对照组的症状积分。3.益气清化法结合干扰素治疗慢性丙型性肝炎正虚邪恋证能改善肝脏炎症,恢复肝功能治疗前两组肝功能数值经t检验,P>0.05,提示：两组肝功能无明显差异。治疗后两组肝功能数值经t检验：ALT、AST、GGT P<0.05,提示：两组肝功能ALT、AST、GGT明显改善。治疗后两组肝功能数值经t检验ALB、GLB、TBlil、DBlil均无明显改善,差异无统计学意义（P>0.05）,提示：两组肝功能ALB、GLB、TBlil、DBlil无明显改善。由治疗组的肝功能均数28.416<对照组的肝功能均数52.9814,可以认为治疗组的肝功能转化率数低于对照组的肝功能。4.益气清化法结合干扰素治疗慢性丙型性肝炎正虚邪恋证能改善血常规指标：治疗前两组血常规指标无明显差异,差异无统计学意义,具有可比性（P>0.05）两组治疗后白细胞、红细胞、血小板均有显着改善,有显着差异,差异有统计意义（P<0.05）。提示：两组治疗后血常规指标有明显改善（P<0.05）5.益气清化法结合干扰素治疗慢性丙型性肝炎正虚邪恋证能改善病毒定量HCV-RNA,抑制病毒复制：治疗前两组病毒定量数值经t检验,P>0.05,提示：两组的病毒定量无明显差异。治疗后两组病毒定量数值经t检验,P<0.05,提示：两组的病毒定量明显差异。由治疗组的病毒定量均数1000<对照组的病毒定量均数2018,可以认为治疗组的病毒定量转化率数低于对照组的病毒定量。两组在治疗过程中未发生任何过敏反应或严重不良事件者,治疗后血常规、尿常规检测均无明显异常变化,过程中亦无研究对象失访,表明益气清化法结合干扰素治疗正虚邪恋证的临床研究安全有效,无明显毒副作用,且依从性好。治疗中、治疗后未见任何不良反应。E.研究结论：论文通过中药益气清化法联合干扰素治疗慢性丙型肝炎患者,以干扰素作为对照组。结果表明能够明显改善患者的乏力、腹胀、纳差、黄疸、口干口苦、便溏、胁痛腰膝酸软、怯冷或热症状,肝功能、病毒定量均有显着性差异P<0.05。因此,益气清化法联合干扰素治疗慢性丙型肝炎正虚邪恋证的临床研究能够改善患者的症状、恢复肝功能、抑制病毒复制、改善肝组织损伤、防止肝纤维化及肝癌,从而提高临床益气清化法治疗慢性丙型肝炎的疗效。益气清化法联合干扰素治疗慢性丙型肝炎正虚邪恋证的临床研究获得较好的疗效,主要体现在改善临床症状体征方面,是一种方便、无毒、无副作用的方法。
张力[7]（2012）在《游离HCV核心抗原检测对不同基因型丙肝早期筛选早期治疗影响的研究》文中指出目的验证HCV核心（游离）抗原ELISA实验特异性、敏感性及有效缩短HCV检测窗口期的作用。讨论HCV核心（游离）抗原检测和HCV RNA的一致性。比较HCVRNA和HCV核心（游离）抗原阳性、HCV ELISA阴性的有危险因素组治疗组和HCV RNA阳性HCV核心（游离）抗原阴性、HCV ELISA阳性的治疗对照组不同基因型经一段时间治疗后早期病毒学应答是否有统计学差异。方法比较300份正常体检人群组与35例随访确定HCV感染的有危险因素组HCV RAN和HCV（游离）核心抗原检测情况,危险因素为有与HCV感染者接触的暴露史。对35例有危险因素组中参与治疗的病人和40例病程在一年以上HCV慢性感染治疗对照组病人比较通过《丙型肝炎防治指南》确定治疗方案后治疗12周EVR情况。所有病人均排除其他肝炎病毒感染,均未经抗病毒治疗。结果300份HCV RNA和抗-HCV阴性体检人群组中有1例（0.33%）游离HCV核心抗原阳性,35例确诊HCV感染者丙肝核心抗原初次检测33例为阳性（94.29%）,经统计HCV-核心抗原ELISA法比Anti-HCV ELISA法缩短窗口期约34-36天。有危险因素组和治疗对照组1型两组病人EVR P<0.01,有显着性差异,2型（非1型）病人标本总量小于40,采用Fisher精确检验精确Sig.（单侧）<0.05,有统计学差异。结论HCV核心（游离）抗原ELISA实验有较好的特异性和敏感性。HCV核心（游离）抗原检测可有效缩短HCV检测窗口期。HCV核心（游离）抗原检测和HCV RNA检测有较好的一致性。1型和2型HCV RNA和HCV核心（游离）抗原阳性、Anti-HCV阴性有危险因素组EVR均高于HCV RNA阳性HCV核心（游离）抗原阴性、Anti-HCV阳性治疗对照组。HCV核心抗原检测可作为丙肝检测的有效补充实验。
张立营,冯玉奎,梁冰,王军,禹华伟,苑同业,王华强[8]（2011）在《丙型肝炎病毒实验室检测技术的研究进展》文中提出丙型肝炎病毒（HCV）是一种主要经血液传播的肝炎病毒,是造成慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的主要病原之一。HCV属于黄病毒属,为单股正链的RNA病毒,基因组长度约9.6kb,含有单个开放阅读框架（ORF）,编码一个由约3010个氨基酸组成的多聚蛋白。到目前为止,丙型肝炎的实验室检测技术主要有抗-HCV检测、HCVRNA核酸扩增检测、HCV核心抗原的检测三种类型。现就HCV实验室检测的研究现状作一综述,为致病机理的研究及抗HCV药物的开发和疫苗的研制等提供理论依据。
韦金露[9]（2010）在《抗-HCV阴性的HIV感染者血清中HCV RNA、HCV病毒载量及基因型的状况》文中研究指明目的了解抗-HCV阴性的广西HIV感染者血清中HCV RNA的阳性率、HCV病毒载量及基因型分布,为今后的丙型肝炎筛查工作及临床治疗提供参考。方法1、2008年8月～2009年1月,从广西省柳州市和钦州市抽取部分的艾滋病VCT门诊、监狱、戒毒所、医院及社区等作为研究对象的招募点,共招募到300例HIV-1型感染者。采用自行设计的统一问卷对研究对象进行调查,同时采集研究对象静脉血10ml。另外,作为对照,41例单纯丙型肝炎患者来自医院门诊。2、采用ELISA法检测300例HIV-1型感染者血清中的丙型肝炎抗体,按结果分成抗-HCV（+）组和抗HCV（-）组。3、从NCBI网站下载广西及国内主要流行的HCV基因型,采用Clustalx和BioEdit软件进行比对,获取各HCV基因型序列的高度保守区域5’UTR,通过Primer ExPress5.0软件设计两对巢式PCR引物。4、采用试剂盒对抗-HCV（+）组和抗-HCV（-）组的血清样本进行HCV RNA的提取,逆转录成cDNA,再用巢式PCR法检测血清的HCV RNA,计算每组的HCV RNA阳性率并比较。5、采用荧光定量PCR法对两组中HCV RNA阳性的血清样本进行HCV病毒载量检测,与41例单纯丙型肝炎患者作比较。6、采用RFLP法对两组的HCV RNA阳性血清进行HCV基因分型并比较分布情况。7、数据资料用SPSS13.0统计软件进行统计分析,两组率的比较用χ2检验、Fisher确切概率法,两组间均数比较用t检验,三组间均数比较用方差分析,以P<0.05为有统计学差异。结果1、在300例HIV感染者中,男195例,女105例,平均年龄为37.39+13.73岁,以性传播途径占62.67%（188／300）,吸毒途径占33.67%（101／300）,其他途径占3.67%（11／300）。经ELISA法检测,发现146例研究对象呈抗-HCV阳性、154例为抗-HCV阴性,表明在广西HIV感染患者体内抗-HCV的阳性率为48.67%。在146例HIV/HCV混合感染者中,男性多见,以20-40岁为主,初中文化占多数,无固定职业者居多,大部分为未婚者,不同的传播途径其抗-HCV阳性率不同,经吸毒途径的抗-HCV阳性率为63.7%（93／146）,经性传播途径为34.93%（51／146）,其他传播途径为1.37%（2／146）。2、在抗-HCV阳性组中,检出114份血清呈HCV RNA阳性,阳性率为78.08%（114／146）；在抗-HCV阴性组中,检出41份血清呈HCV RNA阳性,HCV RNA阳性率为26.62%（41／154）；ELISA法和RT-nPCR法检测HCV感染的符合率为75.67%[（113+114）／300]。3、在HCV RNA （+）的41例抗-HCV阴性患者中,其血清的平均HCV病毒载量对数值为6.15+1.33,抗-HCV（+）组的HCV平均病毒载量对数值为6.79±1.24,41例单纯丙肝感染者为3.44±1.10,三组之间的HCVRNA水平有统计学差异（P<0.05）,以抗-HCV阳性组最高,其次是抗-HCV阴性组,最低为单纯HCV感染组。结果还提示在HIV/HCV混合感染者中,三个不同HCV RNA水平组的HCV抗体阳性率并无差异（P>0.05）,不能说明HCV抗体阳性率会随着HCV病毒载量的升高而增加。4、41例抗-HCV（-）组和114例抗-HCV（+）组的HCV基因型分布有统计学差异（P<0.05）,可能与两组HIV/HCV混合感染者的主要传播途径不同有关。155例HIV/HCV混合感染者血清的HCV基因型呈多样性分布,主要以1b（34.2%）、混合亚型（17.4%）、6a（12.9%）、3b（9.68%）为主。柳州和钦州地区的HCV基因型均以1b型占主导,不同传播途径中HCV基因型分布不一样,吸毒者的主要以6a,混合亚型及3b为主,经性、母婴和血液途径传播的混合感染者主要以1b及1a+1b混合亚型为主。结论：1.广西HIV感染者混合HCV感染的现象可能较为严重,年轻、单身、无固定职业、多个性伴侣、吸毒的HIV感染者血清的HCV抗体阳性较多,静脉药瘾、性传播是广西HIV/HCV混合感染的主要感染途径。2.若单纯使用国产第三代ELISA法检测HIV感染者体内的HCV抗体会导致部分丙肝患者被漏诊,而且HIV/HCV混合感染者的病毒载量较高。所以今后对HIV感染者进行丙肝筛查时,对HCV抗体阴性者应加检血清的HCV RNA,并对HCV病毒载量进行实时定量监测。3.本研究提示广西HIV/HCV混合感染者的HCV基因型呈多样性变化,主要以1b、混合亚型（以1a+lb多见）、6a、3b型为主,这些可为今后对混合感染者的丙肝治疗及疫苗研制提供一定的科学参考。
许信刚[10]（2005）在《逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究》文中研究表明丙型肝炎病毒（HCV）是输血后非甲非乙型肝炎以及社区获得性肝炎的主要病原因子,目前全世界约有2 亿HCV感染者。HCV感染后缺乏有效的保护性免疫。目前对HCV感染尚未找到有效的治疗手段,因此需要提高治疗手段和发展有效的疫苗以控制HCV感染。HCV 为单股正链RNA 病毒,属于黄病毒科的成员。其基因组全长9.4kb,编码约3 000 氨基酸的多聚蛋白前体,在宿主及病毒蛋白酶的作用下,将其切割成3 个结构蛋白和7 个非结构蛋白,其中有2 个糖蛋白E1 和E2 为HCV的包膜蛋白。由于其位于病毒颗粒的最外侧,是宿主免疫系统攻击的主要目标,也是HCV 疫苗研究的首选抗原。近年来各国学者运用基因重组技术对HCV包膜糖蛋白的结构和功能进行了深入研究,以期进一步理解HCV感染后慢性化机制及病毒与宿主相互作用的关系,并寻找有效的保护性疫苗及治疗药物。Chiron公司的研究人员在1994 年首先报道了用哺乳动物细胞表达的E1 和E2 蛋白共免疫大猩猩,可诱生出中和抗体能抵抗同源病毒攻击的。他们认为在大猩猩免疫试验中,E2 区尤其是E2 的高变区之一HVR1（386～411 位氨基酸）对于诱导中和抗体的保护性免疫具有更为重要的作用。但是由于E2 区的高度变异性,针对某种型或株的抗体往往对其他型或株的HCV 无中和作用。而且有的学者认为抗E2 抗体对病毒感染的预防作用仍难以肯定。由于尚未建立HCV 体外复制系统,病人血清中的HCV 病毒粒子又极难纯化,迄今为止的HCV被膜蛋白研究几乎完全以各种系统中表达的重组蛋白为对象。有证据表明,只有哺乳动物细胞中表达的E1、E2 糖蛋白才能较好地反映天然HCV病毒粒子上被膜蛋白的构象和性质。但就目前而言,E1 及E2 糖蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,以及表达蛋白的纯化,仍然是世界范围内都未攻克的难题,严重影响了被膜蛋白相关研究及其临床应用的进展,说明HCV 中和抗体的研究还面临许多困难。本研究由三部分构成,第一部分是用逆转录病毒载体将HCV囊膜蛋白基因整合到SP2/0 细胞基因组中,在SP2/0 细胞的细胞膜上成功表达了HCV 囊膜蛋
二、套式PCR法检测慢性丙肝患者PBMC及血清中HCV-RNA的意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、套式PCR法检测慢性丙肝患者PBMC及血清中HCV-RNA的意义（论文提纲范文）
（1）湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 HCV感染者丙型肝炎知识知晓与接受直接抗病毒药物治疗意愿调查 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 调查对象 |
| 1.1.2 调查内容及方式 |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 人口学情况 |
| 1.2.2 治疗意愿及影响因素 |
| 1.2.3 丙型肝炎知识知晓情况 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样本来源 |
| 2.2.2 样本收集与处理 |
| 2.2.3 丙型肝炎病毒核酸定量和基因分型检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 检测结果 |
| 2.3.2 湖南省丙型肝炎基因型地理分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）宿主MDR1多态性及HCV基因组变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗复发的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 慢性丙型肝炎干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗失败患者的临床特点研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 宿主MDR1 C3435T多态型对慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 抗病毒治疗复发的慢性丙型肝炎患者治疗前后病毒变异情况研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩略语词汇表 |
| 攻读硕/博士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（4）IFN-λ与丙型肝炎患者应用IFN-α抗病毒治疗疗效的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 干扰素-λ与丙型肝炎患者抗病毒治疗的相关性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）CHC患者血清TNF-α、IL-10水平及其与病毒载量、ALT、AST关系探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本来源 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 3. 统计学方法 |
| 4. 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
（6）益气清化法联合干扰素治疗慢性丙型肝炎正虚邪恋证的临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 课题理论研究 |
| 第一章 ：中医学对慢性丙型性肝炎的研究进展 |
| Ⅰ. 中医对肝胆的认识 |
| 1. 中医学中“肝脏”的含义和实质 |
| 2. 中医学对肝脏位置的认识及论述 |
| 3. 中医肝脏的生理功能 |
| 4. 肝与其他脏腑在生理上密切关系 |
| Ⅱ. 中医对胆腑的认识 |
| 1. 中医对胆腑含义及位置的认识 |
| 2. 中医对胆的生理功能的认识 |
| Ⅲ. 中医学对慢性丙型肝炎的研究进展 |
| 1. 中医学对慢性丙型肝炎的病名认识 |
| 2. 中医学对慢性丙型肝炎的病因病机探讨 |
| 3. 中医学对慢性丙型肝炎的辨证诊断 |
| 4. 中医学对慢性丙型性肝炎的治疗研究进展 |
| 5. 难治慢性丙型性肝炎的中医辨证论治 |
| 6. 丙型性肝炎中医药临床研究存在问题评价与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 西医学对慢性丙型性肝炎的研究进展 |
| Ⅰ. 慢性丙型性肝炎的流行病学 |
| 1. 传染源 |
| 2. 传播途径 |
| 3. 人群感染性 |
| 4. 流行特征 |
| Ⅱ. 慢性丙型性肝炎的病毒学 |
| 1. HCV分类 |
| 2. HCV形态结构与生理性质 |
| 3. HCV基因组结构 |
| 4. HCV复制 |
| 5. HCV变异 |
| Ⅲ. 丙型病毒性肝炎病理形态学改变 |
| Ⅳ. 慢性丙型病毒肝炎的致病机制与自然史 |
| 1. 致病机制 |
| 2. 自然史 |
| Ⅴ. 慢性丙型肝炎的诊断学 |
| 1. 临床诊断 |
| 2. 实验室检查 |
| 3. 血清生化学检测 |
| Ⅵ. 慢性丙型肝炎的西医治疗 |
| 1. 基本治疗 |
| 2. 药物治疗 |
| 3. 难治性慢性丙型肝炎的西医治疗策略 |
| 4. 丙型肝炎西医药临床研究存在问题评价 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 |
| Ⅰ. 研究设计 |
| Ⅱ. 研究方案 |
| 1. 诊断标准 |
| 1.1 西医诊断标准 |
| 1.2 中医证型诊断标准 |
| 2. 病例纳入标准 |
| 3. 排除标准 |
| 4. 研究病历的终止条件 |
| 5. 剔除标准 |
| 6. 病历脱落与处理 |
| 7. 治疗方案 |
| 7.1 研究方法 |
| 7.2 治疗方法 |
| 8. 观察指标 |
| 9. 疗效判定 |
| 9.1. 综合疗效判定 |
| 9.2. 抗病毒疗效评定标准 |
| 9.3. 证候疗效判定标准 |
| 9.4. 临床综合疗效判定标准 |
| 10. 安全性评价标准 |
| 11. 不良事件轻重程度判断标准 |
| 12. 统计学方法 |
| Ⅲ. 结果 |
| 1. 治疗前两组基线比较 |
| 1.1 两组性别比较 |
| 1.2 两组年龄比较 |
| 1.3 两组症状分布治疗前比较 |
| 1.4 肝功能指标治疗前比较 |
| 1.5 病毒定量治疗前比较 |
| 2. 治疗组、对照组具体疗效比较 |
| 2.1 两组治疗后体征比较 |
| 2.2 两组治疗后肝功能疗效比较 |
| 2.3 两组治疗后病毒定量HCV-RNA比较 |
| 2.4 两组治疗后血常规指标疗效 |
| 2.5 两组临床综合疗效评定比较 |
| 3. 安全性比较 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 研究讨论与结论 |
| Ⅰ. 研究讨论 |
| 1. 研究的理论依据 |
| 2. 研究的治疗原则 |
| 3. 研究的中药基本方药物组成与意义 |
| 4. 西医聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗丙型病毒的临床应用 |
| 5. 研究的疗效分析 |
| 5.1 临床综合疗效评价 |
| 5.2 症候疗效的评价 |
| 5.3 肝功能指标的评价 |
| 5.4 病毒定量指标的评价 |
| Ⅱ. 研究的结论 |
| III. 研究的存在问题与展望 |
| Ⅳ. 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 简介 |
（7）游离HCV核心抗原检测对不同基因型丙肝早期筛选早期治疗影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 研究对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 标本采集和处理 |
| 1.3 试剂和仪器 |
| 1.3.1 试剂 |
| 1.3.2 仪器 |
| 1.4 实验步骤 |
| 1.4.1 Anti—HCV检测 |
| 1.4.2 HCV RNA定量检测 |
| 1.4.3 HCV core Ag检测 |
| 1.4.4 HCV基因血清学分型测定 |
| 1.4.5 统计学分析 |
| 第二章 结果与分析 |
| 2.1 特异性检测(300份正常体检人群) |
| 2.2 敏感性检测(35例有危险因素组人群) |
| 2.3 335例结果汇总 |
| 2.4 HCV cAg、HCV-RNA、ANTI-HCV检测在缩短HCV窗口期的时间对比表 |
| 2.5 接受治疗人群情况 |
| 2.6 血清学分型 |
| 2.7 EVR |
| 第三章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述的参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）丙型肝炎病毒实验室检测技术的研究进展（论文提纲范文）
| 1 HCV的结构特点与分型 |
| 2 HCV的存在部位 |
| 2.1 肝脏 |
| 2.2 肝外器官 |
| 2.3 骨髓及周围血的单个核细胞 |
| 2.4 血浆 |
| 3 HCV的实验室检测 |
| 3.1 抗-HCV的检测 |
| 3.2 HCV RNA的检测 |
| 3.3 HCV抗原的检测 |
（9）抗-HCV阴性的HIV感染者血清中HCV RNA、HCV病毒载量及基因型的状况（论文提纲范文）
| 主要中英文缩写对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 资料来源 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 健康调查问卷 |
（10）逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 丙型肝炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 丙型肝炎的流行现状、致病性与危害 |
| 1.3 病毒的颗粒特征 |
| 1.4 丙型肝炎病毒各区段基因组的结构和功能 |
| 1.4.1 5’非编码区(5’UTR) |
| 1.4.2 核心蛋白区 |
| 1.4.3 包膜蛋白区 |
| 1.4.4 p7 蛋白 |
| 1.4.5 非结构蛋白 |
| 1.4.6 3'非编码区(3'UTR) |
| 1.5 丙型肝炎病毒囊膜蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 包膜蛋白的结构 |
| 1.5.2 E2 蛋白在HCV入胞过程中的作用 |
| 1.5.3 E2 与机体免疫反应 |
| 1.6 丙型肝炎病毒基因的变异及分型 |
| 1.6.1 HCV 的变异机制 |
| 1.6.2 HCV 各基因的变异情况 |
| 1.6.3 HCV 基因分型研究 |
| 1.6.4 HCV 基因型的地理分布特点 |
| 1.6.5 HCV 基因分型的方法 |
| 1.7 HCV 的体外复制模型及感染动物模型研究 |
| 1.7.1 HCV 体外复制模型 |
| 1.7.2 黑猩猩 |
| 1.7.3 猴 |
| 1.7.4 树鼩 |
| 1.7.5 转基因和免疫耐受人鼠嵌合肝模型 |
| 1.8 丙型肝炎病毒感染的免疫反应 |
| 1.8.1 体液免疫应答 |
| 1.8.2 细胞免疫应答 |
| 1.9 丙型肝炎预防和治疗 |
| 1.9.1 干扰素(IFN) |
| 1.9.2 病毒唑 |
| 1.9.3 LAK 细胞治疗 |
| 1.9.4 熊去氧胆酸治疗 |
| 1.9.5 免疫调节剂 |
| 1.9.6 联合用药 |
| 1.9.7 中医中药 |
| 1.9.8 丙型肝炎预防 |
| 1.10 丙型肝炎疫苗研究 |
| 1.10.1 重组HCV 蛋白质疫苗 |
| 1.10.2 HCV 基因疫苗 |
| 1.10.3 HCV 融合基因疫苗 |
| 1.10.4 丙肝肝炎口服活菌苗 |
| 1.10.5 丙肝疫苗研制面临的问题 |
| 1.11 丙型肝炎病毒单克隆抗体(HCV-McAb)的研究 |
| 1.11.1 鼠源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.2 人源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.3 HCV单克隆抗体的意义及其发展前景 |
| 1.12 丙型肝炎病毒的实验室诊断研究进展 |
| 1.12.1 血清抗-HCV 抗体检测 |
| 1.12.2 HCV RNA检测用于HCV 感染的诊断 |
| 1.12.3 HCV 抗原的检测 |
| 1.13 丙型肝炎的研究展望 |
| 1.13.1 规范分型 |
| 1.13.2 细胞与动物模型 |
| 1.13.3 大容量噬菌体抗体库与肽库的构建 |
| 1.13.4 基因的表达调控 |
| 1.13.5 发病机制 |
| 1.13.6 HCV 受体 |
| 1.13.7 治疗 |
| 1.13.8 疫苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 HCV 囊膜蛋白基因E1E2 的亚克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 含有HCV 囊膜蛋白基因组的质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 载体和菌种 |
| 2.1.4 PCR 引物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收 |
| 2.2.3 纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接 |
| 2.2.4 新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法) |
| 2.2.5 连接产物的转化 |
| 2.2.6 重组质粒的提取 |
| 2.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 序列的计算机分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 2.3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 2.3.3 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.3.4 测序结果 |
| 2.3.5 氨基酸序列分析结果 |
| 2.3.6 HCV E1E2 基因编码蛋白质的理化性质分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 细胞系 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.1.5 载体核菌株 |
| 3.1.6 培养基 |
| 3.1.7 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 逆转录病毒表达质粒的构建 |
| 3.2.2 逆转录病毒假病毒制备 |
| 3.2.3 逆转录病毒假病毒侵染SP 2/0 细胞及抗性筛选表达细胞 |
| 3.2.4 FACS 分析筛选膜表面表达E1E2 蛋白的SP 2/0 细胞 |
| 3.2.5 表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞免疫Balb/c 小鼠 |
| 3.2.6 小鼠采血及血清分离 |
| 3.2.7 血清抗体的检测 |
| 3.2.8 血清中和抗体检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 3.3.2 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.3.3 HCV E1E2 基因的核苷酸和相应的氨基酸序列 |
| 3.3.4 FACS 分析检测表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞 |
| 3.3.5 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 3.3.6 中和抗体检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 HCV 囊膜蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 细胞系 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的制备 |
| 4.2.2 动物免疫 |
| 4.2.3 骨髓瘤细胞的准备 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞的准备 |
| 4.2.5 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 |
| 4.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆 |
| 4.2.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 4.2.9 小鼠腹水的制备 |
| 4.2.10 单抗中和活性的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 分泌特异单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 |
| 4.3.2 中和抗体检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小节 |
| 第五章 丙型肝炎病毒核酸疫苗的构建及动物免疫试验 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 细胞系 |
| 5.1.3 试验动物 |
| 5.1.4 基因组质粒 |
| 5.1.5 载体和菌株 |
| 5.1.6 培养基 |
| 5.1.7 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物的设计 |
| 5.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取 |
| 5.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 5.2.4 真核表达质粒的构建 |
| 5.2.5 重组真核表达质粒转染293T 细胞 |
| 5.2.6 FACS 分析表达E1E2 蛋白的293T 细胞 |
| 5.2.7 重组真核表达质粒的大量提 |
| 5.2.8 重组真核表达质粒免疫Balb/c 小鼠取 |
| 5.2.9 免疫小鼠采血及血清分离 |
| 5.2.10 免疫小鼠血清抗体的检测 |
| 5.2.11 小鼠血清中和抗体的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 5.3.2 重组pGEM-T Easy载体质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.3 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.4 重组质粒的测序结果 |
| 5.3.5 FACS 分析重组真核表达质粒转染293T 细胞瞬时表达 |
| 5.3.6 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 5.3.7 中和抗体检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小节 |
| 第六章 HCV 囊膜蛋白基因E1 和E2 原核表达载体的构建及表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 酶和试剂 |
| 6.1.3 阳性血清及酶标抗体 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 引物的设计与合成 |
| 6.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的鉴定 |
| 6.2.3 原核重组表达载体的构建与鉴定 |
| 6.2.4 E2 基因在大肠杆菌中的表达 |
| 6.2.5 表达蛋白的鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的PCR鉴定 |
| 6.3.2 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的酶切鉴定 |
| 6.3.3 重组原核表达载体序列测定 |
| 6.3.4 表达蛋白的SDS-PAGE 检测 |
| 6.3.5 表达蛋白的Western blot 检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词英汉对照表 |
| 致 谢 |
| 作者简介 |
四、套式PCR法检测慢性丙肝患者PBMC及血清中HCV-RNA的意义（论文参考文献）
- [1]湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析[D]. 戴俊斌. 南华大学, 2019(01)
- [2]丙型肝炎患者抗病毒治疗后外周血单个核细胞内病毒RNA的检测及其与疗效的关系[J]. 聂静敏,胡凤玉,许敏,陈伟烈,何浩岚,李凌华,蔡卫平,唐小平. 中华传染病杂志, 2016(03)
- [3]宿主MDR1多态性及HCV基因组变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗复发的影响[D]. 王俊洁. 南方医科大学, 2015(01)
- [4]IFN-λ与丙型肝炎患者应用IFN-α抗病毒治疗疗效的相关性研究[D]. 赵会芳. 河北医科大学, 2014(09)
- [5]CHC患者血清TNF-α、IL-10水平及其与病毒载量、ALT、AST关系探讨[D]. 刘扬. 新疆医科大学, 2013(02)
- [6]益气清化法联合干扰素治疗慢性丙型肝炎正虚邪恋证的临床研究[D]. 黎氏白贤（LE THI BACH HIEN）. 南京中医药大学, 2013(07)
- [7]游离HCV核心抗原检测对不同基因型丙肝早期筛选早期治疗影响的研究[D]. 张力. 青岛大学, 2012(08)
- [8]丙型肝炎病毒实验室检测技术的研究进展[J]. 张立营,冯玉奎,梁冰,王军,禹华伟,苑同业,王华强. 热带医学杂志, 2011(09)
- [9]抗-HCV阴性的HIV感染者血清中HCV RNA、HCV病毒载量及基因型的状况[D]. 韦金露. 广西医科大学, 2010(09)
- [10]逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究[D]. 许信刚. 西北农林科技大学, 2005(02)