一、鸭乙型肝炎肝纤维化模型的研究(论文文献综述)
张强[1](2021)在《基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制》文中认为肝纤维化(Hverfibrosis,LF)是肝胆系统疾病中的常见病,并且是大多数慢性肝病发展的必然阶段。目前医学界普遍认为早期肝纤维化能够逆转,但如何进行逆转,目前尚未形成普遍的共识。肝纤维化早期产生的诸多病理变化中,人们对肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cells,SECs)的病理变化给予的关注逐渐增多,其特征性的细胞学行为改变包括“窗口”尺寸与数量的变化以及连续性基底膜的形成,一旦SECs发生去窗口化后,则肝纤维化的进程难以逆转,目前这已是不争的事实。目前针对肝纤维化的治疗,现代医学尚且只能给予病因治疗,针对肝纤维化本身而言,目前还没有疗效肯定的药物或治疗手段问世。中医药学在治疗肝纤维化方面的经验历史较长,并对其发病机制形成了完整的认识,尤其是在治未病思想指导下,针对慢性肝病给予早期干预,这在一定程度上能够降低患者未来发生肝纤维化、肝硬化的风险。芪术颗粒是姚乃礼教授经过多年的临床经验总结,结合目前中医药学界对肝纤维化的普遍认识基础上创制的治疗肝纤维化常用方,本课题在国家自然基金“基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制”(NO:81774282)的资助下,结合课题组前期的研究成果探讨益气活血方芪术颗粒治疗肝纤维化的机制。1.基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析目的:以Meta分析的方法评价益气活血法治疗肝纤维化的临床疗效。方法:1.以PubMed、中国知识基础设施工程数据库、万方数据知识服务平台为检索资料库,检索时间跨度为自建库到2020年12月31日;以检索词“liver fibrosis”、“hepatic fibrosis”为检索词,然后以“effect”或者“efficacy”作为关键词逐篇进行排除;以“肝纤维化”作为检索词进行检索,然后以“临床观察”、“疗效分析”作为关键词逐篇进行排除。以上数据库没有语言限制。2.纳入随机对照临床研究类文献,以肝纤维化四项、肝脏瞬时弹性成像、肝脾脏的形态、门脾静脉的宽度、不良反应、安全性等结局指标作为考核指标。结果:本次研究共纳入合格文献共93篇,其中有86篇文献以肝纤维化四项作为临床评价指标,两组对比显示中药组的临床疗效比对照组更好,结果对比具有统计学差异[MD=51.15,95%CI(56.95,45.35),P<0.00001]。15篇文献以肝硬度值作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善肝硬度值方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=3.52,95%CI(4.78,2.26),P<0.00001]。33 篇文献研究以门静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善门静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.20,95%CI(2.14,0.26),P=0.01]。31篇文献研究以脾脏厚度作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾脏厚度方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=6.83,95%CI(9.54,4.12),P<0.00001]。13篇文献研究以脾静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.77,95%CI(3.04,0.49),P=0.007]。结论:以益气活血为主要功效的中药组方在治疗肝纤维化方面相较于西药而言具有更好的临床疗效。2.基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制目的:(1)研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠肝脏炎症因子、肝纤维化指标以及病理组织学的调控作用。(2)通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法明确芪术颗粒对肝窦内皮细胞eNOSmRNA、eNOS、NO表达的影响。(3)基于多相多级次多孔介质理论,明确芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学特征。方法:(1)以四氯化碳作为肝纤维化的诱导剂,构建肝纤维化大鼠模型,造模同时给予芪术颗粒进行干预,通过Elisa法、HE以及Masson染色研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠的生化、病理组织学的影响。(2)原位胶原酶灌注+离体消化+梯度密度分离法分离提取肝窦内皮细胞。(3)以10%肝纤维化大鼠血清+5%的胎牛血清作为外在损伤因素作用于体外培养状态的肝窦内皮细胞,模拟体内生化环境,构建肝窦内皮细胞损伤模型。将细胞按照正常对照组、损伤组、正常大鼠血清损伤组、芪术颗粒含药血清低、中、高浓度进行分组。(4)采用 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内eNOSmRNA、eNOS、NO的表达情况。(5)基于多相多级次多孔介质理论,采用原子力显微镜表征芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学属性。结果:(1)芪术颗粒能够改善肝纤维化大鼠生化指标,改善肝脏病理组织形态。(2)经过细胞形态以及免疫荧光鉴定可知,我们所提取的细胞为大鼠肝窦内皮细胞,且纯度较高。(3)经 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内 eNOSmRNA、eNOS、NO显示芪术颗粒含药血清能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达。(4)经过芪术颗粒含药血清干预后,肝窦内皮细胞的骨架模量、粘度均有所提高,使肝窦内皮细胞向正常力学状态转变,而其扩散系数无明显变化。结论:(1)芪术颗粒能够抑制肝脏炎症状态,恢复肝脏正常组织形态。(2)芪术颗粒能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达,从而改善肝窦内皮细胞的病理状态,这可能是其抗肝纤维化的重要机制之一。(3)芪术颗粒能够改善肝窦内皮细胞的力学状态,促进肝窦内皮细胞向正常力学状态恢复,这可能是其发挥抗肝纤维化的另一重要机制。
成茂源[2](2020)在《基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响》文中研究表明目的:观察加减三甲散干预模型大鼠肝纤维化的效果以及对WNT/β-catenin通路的影响,并从lnc RNA和m RNA角度揭示其作用机制,丰富“主客交”学说的现代生物学内涵。方法:1.实验一:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、1号方组(加减三甲散1号方组)、2号方组(加减三甲散2号方组)、阳性对照组(秋水仙碱组)。常规喂养7d,模型组、1号方组、2号方组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油剂的方法制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,1号方组予以加减三甲散全方灌胃,2号方组以去穿山甲的加减三甲散2号方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE染色观察病理形态,检测血清ALT、AST。Western blot法检测空白对照组、模型组、1号方组、阳性对照组WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量。2.实验二:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、加减三甲散组、阳性对照组(秋水仙碱组)。常规喂养7d,模型组、加减三甲散组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油的方式剂制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,加减三甲散组予以加减三甲散全方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE和MASSON染色观察病理形态,ELISA法检测血清HA、LN、PCⅢ、CIV浓度。高通量二代测序法检测空白对照组、模型组、加减三甲散组大鼠肝组织lnc RNA和m RNA表达谱。结果:1.病理切片:HE染色光镜下观察,实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠、1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大(P﹤0.01);与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着(P﹤0.01),2号方组无明显差异(P﹥0.05);与1号方组比较,2号方组大鼠肝纤维化程度明显加重(P﹤0.01)。实验二中,与空白对照组相比,模型组、加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大(P﹤0.01);与模型组相比,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着(P﹤0.01);加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度无明显差异,无统计学意义。MASSON染色光镜下观察,实验二中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝纤维化程度明显增大(P﹤0.01),加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度增大(P﹤0.05);与模型组比较,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度明显减轻(P﹤0.01);与加减三甲散组比较,阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度相当,无统计学意义(P﹥0.05)。2.肝功能指标:实验一中,与空白对照组相比,模型组、1号方组、2号方组大鼠血清中ALT、AST水平显着升高(P﹤0.01),阳性对照组大鼠ALT、AST水平相当,无统计学意义(P﹥0.05);与模型组相比,1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠ALT水平显着降低(P﹤0.01);与模型组相比,1号方组、2号方组大鼠AST水平降低(P﹤0.05),阳性对照组大鼠AST水平显着降低(P﹤0.01);与1号方组相比,阳性对照组大鼠血清中AST水平显着降低(P﹤0.01)。3.信号通路指标:实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin蛋白表达量降低(P﹤0.05),GSK-3β蛋白表达量显着降低(P﹤0.01);与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白含量无明显变化,无统计学意义(P﹥0.05)。4.肝纤维化指标:实验二中,与空白对照组相比,模型组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度均显着增大(P﹤0.01)。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中HA浓度增大,差异明显(P﹤0.05)。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中LN、PCⅢ、CⅣ浓度减小(P﹤0.05)。加减三甲散组与阳性对照组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度比较,无统计学意义(P﹥0.05)。5.测序结果:实验二中,预测出新的lncRNA1976条。空白对照组与模型组差异Inc RNA基因共340个(187个上调,153个下调)。空白对照组与加减三甲散组差异Inc RNA基因251个(上调139个,下调112个)。模型组与加减三甲散组差异Inc RNA基因93个(上调48个,45下调)。差异lnc RNA靶基因共同功能主要为:自然杀伤细胞介导免疫,自然杀伤细胞介导的细胞毒性调控等。空白对照组与模型组差异m RNA基因1635个(上调1451个,下调184个),模型组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个(上调39个,下调41个),空白对照组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个(上调39个,下调41个)。空白对照组、加减三甲散组和模型组m RNA差异基因共同途径为:PPAR信号通路。结论:1.采用四氯化碳诱导法可成功复制大鼠肝纤维化模型。2.加减三甲散1号方减轻模型大鼠肝纤维化程度的效果好于去除穿山甲的加减三甲散2号方。3.加减三甲散(加减三甲散1号方)改善模型大鼠肝纤维化程度不经过WNT/β-catenin通路作用。4.加减三甲散改变肝纤维化模型大鼠lnc RNA和m RNA的表达谱,这可能是加减三甲散改善模型大鼠肝纤维化程度的部分作用机制。
艾永强[3](2020)在《五味子醇乙联合蟛蜞菊内酯抗肝纤维化的效应及机制研究》文中研究表明目的:探究五味子醇乙(Schisandrol B,Sch-B)联合蟛蜞菊内酯(Wedelolactone,Wed)对胆管结扎与四氯化碳所致小鼠肝纤维化的保护效应与其作用机制。方法:1.利用胆管结扎(bile duct ligation,BDL)手术诱导建立小鼠胆汁淤积型肝纤维化模型。C57BL/6小鼠被随机分为假手术组(control)、胆管结扎模型组(BDL-Model)、秋水仙碱阳性药组(colchicine 0.2mg/kg)、Wed20mg/kg组、Sch-B40mg/kg组、Wed20mg/kg+Sch-B40mg/kg组。假手术组打开腹腔,剥离总胆管,但不实施胆管结扎,其余四组,剥离总胆管后实施结扎。术后第7d开始给药,连续给药14d。比色法检测血清中羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)的含量;采用HE染色、马松(Masson)染色与天狼星红染色法(sirius red staining)观察肝脏的组织病理学变化;免疫组化染色法检测肝脏组织α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表达;实时定量PCR法(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)检测肝脏组织中的促纤维化生长因子与肝星形细胞增殖趋化因子m RNA的表达;Western blot法(免疫蛋白印迹法)检测肝脏组织中TGF-β/Smad信号通路与NF-κB信号通路相关蛋白的表达。2.利用CCL4诱导小鼠化学性肝损伤肝纤维化模型。C57BL/6小鼠被随机分为橄榄油溶剂对照组(control)、CCL4模型组、秋水仙碱阳性药组(colchicine0.2mg/kg)、Wed20mg/kg组、Sch-B40mg/kg组、Wed20mg/kg+Sch-B40mg/kg组。将CCL4溶于橄榄油中制备成5%的CCL4油溶液,腹腔注射2m L/kg。每日1次,14d后开始给予治疗药物。治疗28d后,留取血液与组织样本。检测指标同上。3.体外建立炎症刺激模型以及纤维化模型,探讨Wed与Sch-B抗肝纤维化的作用机制。结果:1.与模型组相比,Wed与Sch-B单独给药组与联合给药组均具有明显的保肝效应,并且还可以降低血清中Hyp含量,联合给药组效果最佳,且有显着性差异。2.HE染色、Masson染色、天狼星红染色显示,与模型组相比,WED与Sch-B单独给药组均能够减少小鼠肝脏组织中小胆管增生,降低炎性细胞浸润与纤维间隔的生成,联合给药组效果最佳,且有显着性差异。3.WED与Sch-B单独给药组与联合给药组均可以抑制肝星形细胞的增殖。与模型组相比,WED与Sch-B单独给药组与联合给药组均可降低肝脏组织中Collagen 1蛋白的表达,以联合给药组效果最佳,且有显着性差异。4.WED与Sch-B单独给药组可抑制TGF-β/Smad信号通路的转录。与模型组相比,WED与Sch-B单独给药组与联合给药组均可下调Smad2/3的蛋白表达,联合给药组效果最佳,且有显着性差异。5.WED与Sch-B单独给药组与联合给药组与联合给药组都能够抑制NF-κB信号通路的转录。与模型组相比,WED与Sch-B单独给药组与联合给药组可减少P-IκBα蛋白表达水平以联合给药组效应最强,且有显着性差异。6.Wed主要通过在巨噬细胞中抑制NF-κB信号通路的激活与炎症的激活,在肝星形细胞中抑制TGF-β/smads信号通路逆转肝纤维化。Sch-B与Wed具有协同作用结论:Wed与Sch-B能够有效地阻断与抑制BDL与CCL4诱导的小鼠肝纤维化的形成,其机制可能与其抑制TGF-β/Smad与NF-κB信号转导通路转录有关。
陈姗[4](2019)在《荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通路及PPAR-r/c-Ski通路的影响》文中研究表明目的:荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞增殖抑制作用,并从TGF-β1/Smad通路及PPAR-r/c-Ski通路探讨荔枝核总黄酮抗肝纤维化的可能作用机制。方法:体外培养大鼠肝星状细胞,分为空白对照组、TFL浓度20ug/ml组、40ug/ml组、80ug/ml组、160ug/ml组、320ug/ml组,分别干预48h后,运用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;再设置为空白组、秋水仙碱对照组、TFL低剂量组、TFL中剂量组、TFL高剂量组ELISA法检测各组细胞上清液中PPAR-r、c-Ski的含量;qPCR法检测各组TGF-β1、Smad3/4 mRNA的表达。结果:CCK-8结果显示,随着TFL作用浓度的增加,药物对细胞的增殖的抑制率增高;ELISA结果显示,与空白组比较,各组细胞上清液中PPAR-r、c-Ski的含量均显着升高(P<0.01),并在TFL高剂量组中含量达到最高(P<0.01);与秋水仙碱对照组比较,TFL高剂量组中的细胞上清液PPAR-r、c-Ski含量均高于秋水仙碱对照组(P<0.01),TFL中剂量组中的细胞上清液PPAR-r含量相对高于秋水仙碱对照组(P<0.05),TFL中剂量组中的细胞上清液c-Ski含量高于秋水仙碱对照组(P<0.01),TFL低剂量组中的细胞上清液PPAR-r含量低于秋水仙碱对照组(P<0.01),TFL低剂量组中的细胞上清液c-Ski含量相对高于秋水仙碱对照组(P<0.05);qPCR结果显示,与空白组比较,各组细胞中TGF-β1、Smad3/4 mRNA的表达量均显着降低(P<0.01),并在TFL高剂量组中达到最低(P<0.01);与秋水仙碱对照组比较,TFL高剂量组中的细胞中TGF-β1、Smad3/4 mRNA的表达量均明显低于秋水仙碱对照组(P<0.01),TFL中剂量组中的细胞中Smad3 mRNA的表达量明显低于秋水仙碱对照组(P<0.01),TFL中剂量组中的细胞中TGF-β1、Smad4mRNA的表达量相对低于秋水仙碱对照组(P<0.05),TFL低剂量组中的细胞中TGF-β1mRNA的表达量相对低于秋水仙碱对照组(P<0.05),TFL低剂量组中的细胞中Smad3/4 mRNA的表达量相对高于秋水仙碱对照组(P<0.05)。结论:荔枝核总黄酮能够抑制大鼠肝星状细胞增殖,降低细胞外基质分泌,该机制可能与增加大鼠肝星状细胞上清液中PPAR-r、c-Ski的含量,抑制TGF-β1、Smad3/4 mRNA表达有关。
苏翠丽,刘雪梅,邱华,张秋奎,刘灵杰,冯宇[5](2017)在《中药复方治疗慢性乙型肝炎的研究概况》文中研究表明乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界流行趋势,严重威胁人类的健康。通过检索近10年中国知网、万方数据库、Pub Med等中外文献数据库总结出常用的治疗慢性乙型肝炎(CHB)中药复方并对其可能作用机制进行归纳,为今后筛选中药治疗CHB有效成分及研发治疗CHB新药提供思路。
常彩芳,候勇,丛刚[6](2017)在《α-2b干扰素对乙型肝炎模型鸭肝组织炎症和肝纤维化的治疗作用》文中指出目的:通过鸭乙型肝炎病毒(DHBV)阳性血清注射建立鸭乙型肝炎模型,探讨α-2b干扰素治疗DHBV所致鸭肝炎症及肝纤维化的作用,为干扰素的临床应用提供依据。方法:10日龄北京麻鸭40只随机分为对照组(6只)和感染组(34只),感染组使用DHBV阳性血清1周内3次注射的方法,制备鸭乙型肝炎模型。2周后,采用斑点杂交法检测DHBV-DNA水平确认感染鸭共32只,随机将感染动物分为模型对照组(10只)、低剂量及高剂量α-2b干扰素组(各11只),α-2b干扰素组鸭分别肌肉注射低剂量(1×105 U·100g-1)和高剂量(5×105 U·100g-1)α-2b干扰素治疗。30d治疗结束后,采用斑点杂交法检测各组鸭血清DHBV-DNA水平,检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)和肝纤维化指标层黏蛋白(LN)及Ⅲ型前胶原肽(PCⅢ)水平,取肝组织检测白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,观察组织病理形态表现。结果:与造模前比较,造模后鸭血清DHBV-DNA水平明显升高,表明造模成功。α-2b干扰素治疗结束后,与模型组比较,低和高剂量α-2b干扰素组鸭血清DHBV-DNA水平明显下降(P<0.05),血清中AST和ALT水平降低(P<0.05),其中高剂量α-2b干扰素组LN及PCⅢ型水平明显降低(P<0.05),肝组织中IL-6和TNF-α水平明显降低(P<0.05),IL-12水平无明显变化(P>0.05)。组织病理形态表现,与模型组比较,低和高剂量α-2b干扰素组鸭肝组织中纤维化明显减轻。结论:α-2b干扰素可以减轻DHBV所致的鸭肝组织炎症和肝纤维化,本研究为干扰素的进一步开发和临床应用提供了理论依据。
李红[7](2016)在《探讨海珠益肝方从痰论治肝纤维化的作用及机制研究》文中指出目的:本研究探讨海珠益肝方对Con A(Concanavalin A,刀豆蛋白A)诱导的免疫性肝纤维化小鼠的疗效及可能的作用机制,探明肝纤维化与leptin(瘦素)、OB-Rb(瘦素受体)、JAK2(Janus Kinase 2,Janus激酶2)、STAT3(Signal transducer and activator 3,信号转导与转录激活因子3)之间的关系,明确JAK2/STAT3信号通路在肝纤维化发生、发展中的作用。本实验通过分析这一过程中所涉及的关键信号通路,探明海珠益肝方的抗肝纤维化的作用机制,为中医药防治肝纤维化提供新思路和策略。方法:将SPF级C57BL/6品系小鼠48只,随机分为4组,空白对照组、模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组,每组各12只?模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组均采用6mg·kg-1 w-1的剂量尾静脉注射Con A,每周1次,共12周,建立肝纤维化模型。模型复制成功后,分别给予相应药物灌胃干预治疗,其中秋水仙碱组给予0.25mg·kg-1d-1秋水仙碱,海珠益肝方组给予9.86g·kg-1d-1中药海珠益肝方,空白对照组和模型组均给予等剂量的蒸馏水。每日上午9:00和下午15:00各灌胃1次,连续4周。灌胃给药结束第2天早上处死小鼠,收集各组小鼠血液和肝脏、脾脏组织等相关标本。取肝脏组织作病理切片,采用HE染色法在光学显微镜下观察并评定小鼠肝组织病损积分;采用Masson染色法在光学显微镜下观察各组小鼠肝组织纤维化情况;采用电子显微镜观察各组小鼠肝组织超微病理结构变化。采用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清ALT(alanine aminotransferase,丙氨酸氨基转移酶)、AST(aspartate aminotransferase,天门冬氨酸氨基转移酶)、小鼠血清及肝组织匀浆上清液TC(total cholesterol,总胆固醇)、TG(triglyceride,甘油三脂)水平、肝组织匀浆MDA(malondialdehyde,丙二醛)及SOD(superoxide dismutase,超氧化物歧化酶)。采用双抗体夹心ELISA法检测各组小鼠肝组织匀浆上清液HA(hyaluronieacid,透明质酸)、LN(laminin,层粘连蛋白)、PC III(procollagenIII,III型前胶原)、CIV(collagen typeⅣ,Ⅳ型胶原)、各组小鼠血清LP(leptin,瘦素)水平。采用RT-PCR检测各组小鼠肝脏组织中leptin m RNA、OB-Rb m RNA、JAK2 m RNA、STAT3 m RNA转录水平。采用Western blot(免疫印迹试验)法检测各组小鼠肝组织中leptin、OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表达水平。结果:1各组小鼠一般情况比较空白对照组小鼠一般情况好,行动灵活,正常饮食,被皮浓密有光泽,体重增长明显。模型组小鼠精神不振,喜卧少动,进食量较空白对照组有所减少,且皮毛松弛、杂乱蓬松无光泽、尿黄,体重增长缓慢。秋水仙碱组小鼠精神状态一般,活动较活跃,皮毛欠光滑,体重有所增加。海珠益肝方组小鼠精神状态良好,活动较活跃,进食量大于模型组及秋水仙碱组,皮毛顺滑有光泽,体重增加,仅次于空白对照组,一般情况均明显改善。2各组小鼠肝脏肉眼观察比较空白对照组小鼠肝脏质地柔软,表面光滑未见任何斑点、突起、结节,颜色略呈深红色且有光泽,边缘锐利。模型组小鼠肝脏质地较韧,表面见白点,部分肝组织表面粗糙,凹凸不平,颜色变暗红,边缘较钝。秋水仙碱及海珠益肝方组小鼠肝脏质地欠柔软,表面尚光滑,边缘较锐利,基本未见斑点、突起、结节等,颜色接近正常。3各组小鼠肝、脾指数的比较在肝指数方面同空白对照组相比较,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组各组小鼠肝指数均明显升高(P均<0.05)。模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组脾脏指数亦较空白对照组升高,差异有统计学意义(P均<0.05);与模型组比较,秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠肝、脾指数均有所降低,其差异均具有统计学意义(P<0.05);与秋水仙碱组在降低小鼠肝及脾指数方面进行比较,海珠益肝方组相关指标降低更多(P<0.05)?4海珠益肝方对肝纤维化小鼠肝组织病理的影响光镜下空白对照组肝组织清晰,肝细胞排列以中央静脉为中心,肝细胞浆均匀红染,细胞核大小正常,核质淡染,未见变性坏死,纤维组织增生及炎性细胞浸润。模型组小鼠肝组织结构紊乱,破坏明显,肝细胞索排列不整齐,肝细胞脂肪变性,部分坏死,中性粒细胞及淋巴细胞浸润,纤维组织大量增生,部分假小叶形成,肝细胞内脂滴较多。秋水仙碱组与海珠益肝方组肝脏损伤程度较模型组有所减轻。秋水仙碱组肝小叶结构破坏有所减轻,肝细胞排列较整齐,胶原纤维及炎细胞浸润均减少,肝细胞内脂肪较空白对照组明显增加。海珠益肝方组肝小叶结构破坏有明显改善,肝细胞排列较整齐,胶原纤维及炎细胞浸润均减少,肝细胞内脂滴少见。5海珠益肝方对肝纤维化小鼠血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA、SOD的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA水平均升高(P均<0.05),而肝组织匀浆SOD水平均下降(P<0.05);同模型组相比,秋水仙碱组小鼠血清ALT、AST水平均降低(P<0.05),而肝组织匀浆MDA、SOD未见明显变化;同模型组比较,海珠益肝方组血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA水平均降低(P均<0.05),而肝组织匀浆SOD水平均升高(P<0.05);同秋水仙碱组相比,海珠益肝方在降低小鼠血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA水平方面优于秋水仙碱(P<0.05),在升高肝组织匀浆SOD水平方面优于秋水仙碱(P均<0.05)。6海珠益肝方对肝纤维化小鼠血清及肝组织匀浆TG、TC的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠血清TG、TC水平均降低(P均<0.05);同模型组比较,秋水仙碱组血清TG、TC水平未见统计学差异(P均>0.05);同模型组相比,海珠益肝方组血清TG、TC水平均升高,差异有统计学意义(P均<0.05);同秋水仙碱组相比,海珠益肝方组在升高小鼠血清TG、TC水平方面优于秋水仙碱(P<0.05)。同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠肝组织匀浆TG、TC均升高(P均<0.05);同模型组相比,秋水仙碱组肝组织匀浆TG、TC水平无统计学差异(P均>0.05);同模型组相比,海珠益肝方组肝组织匀浆TG水平降低(P均<0.05);同秋水仙碱组相比,海珠益肝方组在降低小鼠肝组织匀浆TG、TC水平方面优于秋水仙碱(P<0.05)。7海珠益肝方对肝纤维化小鼠肝组织匀浆HA、LN、PCⅢ、CIV的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠肝组织匀浆HA、LN、PCⅢ、CIV水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组相比,秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠肝组织匀浆HA、LN、PCⅢ、CIV水平下降(P<0.05)。海珠益肝方组肝组织匀浆HA、LN、PCⅢ、CIV水平显着性降低,优于秋水仙碱组(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。8海珠益肝方对小鼠血清leptin水平的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组血清leptin水平均明显升高(P<0.05);同模型对照组相比,秋水仙碱组和海珠益肝方组血清leptin水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。海珠益肝方组血leptin素水平显着性降低,优于秋水仙碱组(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。9海珠益肝方对小鼠肝组织leptin、OB-Rb m RNA及蛋白表达的影响同空白对照组相比较,模型组、秋水仙碱组和海珠益肝方组leptin、OB-Rb m RNA及蛋白表达显着增强(P<0.05)。与模型组相比,秋水仙碱组和海珠益肝方组leptin、OB-Rb m RNA及蛋白表达显着减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。海珠益肝方组在leptin、OB-Rb m RNA及蛋白表达方面比秋水仙碱组明显降低(P<0.05)。10海珠益肝方对小鼠肝组织JAK2、STAT3 m RNA及蛋白表达的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组和海珠益肝方组小鼠肝组织中JAK2 m RNA及蛋白表达量均高于空白对照组(P<0.05)。同模型组相比,秋水仙碱组及海珠益肝方组JAK2 m RNA及蛋白表达量显着性降低(P<0.05)。同秋水仙碱组相比,海珠益肝方组JAK2 m RNA及蛋白表达量有明显降低(P<0.05)。同空白对照组比较,模型组、秋水仙碱组和海珠益肝方组小鼠肝组织中STAT3 m RNA及蛋白表达量均高于空白对照组(P<0.05)。与模型组相比,秋水仙碱组及海珠益肝方组STAT3 m RNA及蛋白表达量有显着性降低(P<0.05)。与秋水仙碱组相比,海珠益肝方组STAT3 m RNA及蛋白表达量有明显降低(P<0.05)。结论:海珠益肝方可改善肝纤维化模型小鼠的一般情况:如改善模型小鼠的活动及体质量,改善食欲和饮水等症状,显着降低肝纤维化模型小鼠肝、脾指数。海珠益肝方有助于肝小叶结构恢复正常,减少纤维组织增生、肝细胞坏死变性以及炎性细胞的浸润等。能降低纤维化模型小鼠血清ALT、AST、肝组织匀浆MDA含量,升高肝组织匀浆SOD水平,降低肝组织匀浆中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原含量,具有抗肝细胞损伤,有效减轻炎症反应,促进ECM的降解,抑制纤维组织增生,改善肝纤维化小鼠的病理组织结构,达到抗肝纤维化的作用。同时海珠益肝方能调节血脂(TG、TC)水平,减少肝细胞内脂肪的堆积,保护肝细胞,从而抑制早期肝纤维化的启动。综上所述,海珠益肝方抗肝纤维化的作用机制可能为:1海珠益肝方明显降低纤维化模型小鼠血清leptin水平,有效的阻止因leptin与OB-Rb结合而发挥的诱导HSC活化和增殖作用。2海珠益肝方明显抑制纤维化模型小鼠肝组织leptin及其受体表达,提示Leptin是海珠益肝方抗肝纤维化的作用靶点之一。3海珠益肝方能够降低肝纤维化小鼠肝组织JAK2、STAT3的表达水平,从而影响HSC活化、增殖,减少胶原纤维的表达及分泌,达到抗肝纤维化的作用。海珠益肝方具有抑制OB-Rb及其信号转导的作用,这可能是其抗肝纤维化的分子机制之一。瘦素调控的JAK2/STAT3信号转导通路可能是海珠益肝方抗肝纤维化的作用途径和作用靶点。
农志欢,陶丽群,左巧云,陈春霞,黄仁彬[8](2015)在《玉郎伞水提物对慢性鸭乙型肝炎的保护作用》文中研究指明目的:建立鸭乙型肝炎慢性感染模型,研究玉郎伞水提物对鸭慢性乙型肝炎的保护作用。方法:1日龄的广西麻鸭经颈静脉接种0.2 m L的鸭乙型肝炎病毒(DHBV)强阳性血清,7 d后用荧光定量PCR筛选DHBV阳性鸭,随机分为4组,即:模型组,玉郎伞水提物高、低剂量组(按生药量计分别为20,10 g·kg-1)和秋水仙碱组(0.02 g·kg-1)。将未感染鸭作为正常组。除正常组外,其余各组每周均接种0.2 m L的DHBV强阳性血清,直到实验结束,以造成鸭乙型肝炎慢性感染。从造模第25周开始,连续灌胃给药5周。末次给药24 h后,所有动物从颈静脉采血,测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性,血清鸭乙型肝炎病毒表面抗原(DHBs Ag),DHBV-DNA含量。将所有动物处死,迅速摘取肝组织,测定肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,丙二醛(MDA)的含量,肝组织中羟脯氨酸(Hyp)的含量。通过HE染色观察肝细胞损伤程度。结果:与正常组比较,模型组血清ALT,AST活性,HBs Ag,DHBV-DNA含量均显着升高(P<0.05,P<0.01)。肝组织中SOD,GSP-Px活性均显着降低,MDA和Hyp含量则显着升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,玉郎伞水提物高、低剂量组均能降低血清ALT活性和DHBV-DNA含量(P<0.05,P<0.01),均能增加肝组织匀浆中GSH-Px活性,降低MDA和Hyp的含量(P<0.05,P<0.01)。玉郎伞水提物高剂量组能降低血清AST活性和HBs Ag含量,增加肝组织SOD活性(P<0.05,P<0.01)。HE染色显示玉郎伞水提物能显着减轻肝细胞损伤。结论:玉郎伞水提物对DHBV所致的慢性鸭乙型肝炎有一定的保护作用。
向志超[9](2009)在《加味三仁汤治疗乙肝所致慢性肝炎肝作用及机制研究的作用及机制研究》文中指出肝纤维化,是一种发生于慢性肝病后的可逆性损伤愈合反应,各种慢性肝病向肝硬化发展的所必经病理过程。目前,对于许多慢性肝病的治疗尚无理想的针对治疗措施,如乙型肝炎病毒所导致的病毒性肝炎。从病理变化来说,肝纤维化是可逆的,而肝硬化则是不可逆的,再加上我国是病毒性肝炎流行的高发区,据最近统计资料显示,我国目前有肝病患者已达2000多万,肝纤维化在我国的发病率较高,是我国人民必须严肃对待的一个健康问题。因此,寻找防治肝纤维化的有效方法和有效药物,是我国人民的迫切要求,具有深远的意义和重大的社会价值。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致,全世界约有3亿人是HBV携带者,而HBV携带者发生肝纤维化、肝硬化和肝癌的危险性比非携带者高出上百倍。我国是乙肝高发区,约有1.2亿HBV携带者。但是由于乙型肝炎的临床表现并不明显,再加上大多数病人并不重视而导致迁延失治,往往会让病情发展为慢性肝炎和肝纤维化。慢性肝炎(HBV所致)的存在是引发肝纤维化的重要原因,单单治疗肝纤维化是无法使之完全治愈的,就算治疗得当也无法排除复发的危险。因此,抗慢性肝炎肝纤维化应作为一个整体进行治疗,方是彻底治愈的有力保证。国内外在对慢性肝炎及肝纤维化的机理研究方面已取得了一定进展。但是在其临床治疗领域,却依然未能取得明显的进步。加上目前临床现有的药物,其疗效并不够理想,而且有些药物普遍存在副作用较大,费用较高的缺点。因此国内外的研究者都在努力寻找疗效确切、价格低廉、毒副作用小的防治肝纤维化药物,以便能阻止慢性肝炎进一步发展,演变为肝纤维化的进程,最终治愈大多数慢性肝炎及肝纤维化。因此本课题以加味三仁汤作为实验药物,展开针对慢性肝炎及肝纤维化的研究,拟采用免疫组化、细胞培养技术、流式细胞术、分子生物学方法(RealTime-PCR技术)等技术对鸭乙肝、大鼠免疫性肝纤维化、HSC细胞以及2.2.15细胞的影响等方面探讨其抗慢性肝炎及抗肝纤维化的作用及机理,为该方进一步的临床及开发应用提供实验依据。1.利用DHBV阳性绿头鸭作为研究对象,观察加味三仁汤对其血清中DHBV-DNA水平的影响。结果显示:模型组鸭血清中DHBV-DNA水平升高,与正常组比较有显着性差异(P<0.01),加味三仁汤水提液大剂量、小剂量以及大剂量醇提液对DHBV-DNA均有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01),而加味三仁汤的小剂量醇提液则没有显着的抑制DHBV-DNA作用。2.以加味三仁汤作用于2.2.15细胞,观察其对2.2.15细胞HbsAg及HbeAg分泌的影响。结果显示,浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.625、0.3125mg/mL的加味三仁汤水提液对2.2.15细胞HbsAg和HbeAg分泌抑制率分别为85.36%、79.72%、75.81%、69.65%、62.14%、30.56%以及90.17%、83.26%、76.34%、46.86%、20.32%、0.36%。药物剂量与HbsAg和HbeAg分泌抑制率呈现递增关系,其中随着剂量增加,其中药物对HbsAg的抑制更为明显。3.观察加味三仁汤对2.2.15细胞HBV-DNA表达的影响。结果表明,加味三仁汤具有明显的抑制2.2.15细胞HBV表达的作用,其中1 mg/mL、0.5 mg/mL及0.25 mg/mL浓度的加味三仁汤水提液效果更优于阳性药物。4.通过对DMN肝纤维化大鼠模型,观察加味加味三仁汤对肝组织肝HA、LN、IVC、PCIINP及HyP的影响。模型组及各给药组血清HA、LN、IVC、PCⅢ及HyP的水平均升高,与正常组比较,有显着性差异(P<0.01)。加味三仁汤水提大、小剂量组与模型组比较,血清HA、PCⅢ、LN、CIV及HyP水平均明显下降(P<0.05或0.01),且随剂量增加效果也相应增强;加味三仁汤醇提大剂量组与模型组比较,血清LN、IVC、PCⅢ及HyP的水平有一定程度下降,但无显着意义(P>0.05)。加味三仁汤醇提小剂量组与模型组比较,血清PCⅢ、CIV、HyP水平有下降,但无显着意义(P>0.05)。鳖甲软肝片组血清HA、PCⅢ、CIV水平较模型组无显着差异(P>0.05)。5.通过对DMN肝纤维化大鼠模型,观察加味三仁汤对DMN肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响:(1)HE染色;(2)α-SMA免疫组化;(3)Ⅰ型胶原免疫组化。本实验表明,从肝小叶破坏、假小叶形成、胶原纤维增生等肝脏结构的客观改变出发,认为加味三仁汤可减轻肝纤维化的程度,改善肝脏结构,促进ECM降解,从而治疗实验性肝纤维化。6.观察加味三仁汤对大鼠肝组织TGFβ1及PDGF-B表达抑制的影响。结果显示模型组及各给药组血清TGF-β1及PDGF表达增加,与正常组比较,有显着性差异(P<0.01)。加味三仁汤水提液组均能显着抑制TGF-β1和PDGF的表达(P<0.05),且优于阳性药物,其中尤以加味三仁汤水提大剂量组最为明显(P<0.01),且随剂量增加效果也相应增强;加味三仁汤醇提小剂量组剂量组与模型组比较,对于TGF-β1和PDGF表达抑制的影响有显着意义(P<0.05)。加味三仁汤醇提组与模型组比较,对血清TGF-β1的影响无显着意义(P<0.05)。7.观察加味三仁汤对肝纤维化大鼠血清TNF、IL-1及IL-6的影响。结果提示,加味三仁汤水提液组均具有显着降低大鼠血清中TNF-α、IL-1以及含量的作用(P<0.05或P<0.01)。其中水提液大剂量组的效果更是优于阳性药物组。而加味三仁汤醇提大剂量组对大鼠血清中的TNF-α和IL-1有明显的降低作用,但对IL-6则无明显作用。而小剂量醇提液对大鼠血清中的TNF-α、IL-1和IL-6则无明显作用。8.探讨加味三仁汤对HSC-T6 TIMP-1和MMP-2表达的影响。结果显示40mg/mL和20mg/mL浓度的加味三仁汤能有效降低TIMP-1和MMP-2mRNA的水平,并随着浓度降低而减弱。9.观察大鼠肝组织和HSC中的Fas/FasL表达与加味三仁汤的干预作用。实验发现,加味三仁汤能明显上调大鼠肝组织及HSC Fas/FasL基因mRNA的表达,而且其水提液对Fas/FasL的上调作用均优于阳性药物组。10.探讨体外培养HSC凋亡与加味三仁汤的干预作用。实验提示:加味三仁汤和丹参注射液均可诱导HSC凋亡,其中加味三仁汤水提液40mg/ml和20mg/ml剂量组细胞凋亡明显,并优于丹参注射液组。此外,加味三仁汤组对HSC的凋亡促进还呈剂量依赖。11.探讨加味三仁汤对肝纤维化大鼠组织纤维酶原激活剂抑制剂、组织型纤维酶原激活剂的影响。结果显示:与细胞对照组比较,加味三仁汤可调节uPA及PAI-1的表达。其中浓度为40mg/mL以及20mg/mL的加味三仁汤水提液对HSC-T6细胞uPA及PAI-1的的表达调节优于其它各组。而在大鼠血清uPA及PAI-1的表达抑制中,加味三仁汤水提液组均优于其他各组。
陈宗艳[10](2008)在《DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用》文中提出鸭乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis B Virus,DHBV)与乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸(GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326),具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1~30aa内有一个明显的信号肽,在19~20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a(+)/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法(间接法);同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应(fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法。建立的标准曲线循环阈值(cycle threshold,Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d~30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d~52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3~52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1~3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12~31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高(P<0.01),乳酸脱氢酶活性升高(P<0.01),肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物(代号PNA)的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8~62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组(50mg/kg)基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。
二、鸭乙型肝炎肝纤维化模型的研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸭乙型肝炎肝纤维化模型的研究(论文提纲范文)
(1)基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
英文缩略词表 |
第一部分 文献综述 |
综述一 中医药学治疗肝纤维化的研究进展 |
综述二 现代医学对肝纤维化的研究进展 |
综述三 益气活血法对肝窦内皮细胞细胞生物学影响的研究 |
参考文献 |
第二部分 基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析 |
前言 |
资料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 实验研究 |
前言 |
实验一 芪术颗粒对肝纤维化模型大鼠的影响研究 |
1.实验材料 |
2.实验方法 |
3.实验结果 |
结论 |
实验二 大鼠肝窦内皮细胞的原代分离与提取 |
材料与方法 |
结果 |
结论 |
参考文献 |
实验三 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合成酶、一氧化氮的影响 |
材料与方法 |
结果 |
结论 |
讨论 |
参考文献 |
实验四 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质影响的研究 |
材料与方法 |
结果 |
小结 |
结论 |
讨论 |
参考文献 |
创新性 |
致谢 |
个人简历 |
附件 |
中医药科技查新报告书 |
(2)基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
英文缩略词表 |
引言 |
第一部分 文献研究 |
1 祖国医学对肝纤维化的认识 |
1.1 病名探讨 |
1.2 病因病机探究 |
1.3 治法探讨 |
2 现代医学对肝纤维化的认识 |
2.1 肝纤维化的病因 |
2.2 肝纤维化的诊断 |
2.3 肝纤维化的治疗 |
3 本研究的理论基础 |
3.1 “主客交”学说 |
3.1.1 “主客交”学说的创立 |
3.1.2 “主客交”含义 |
3.1.3 “主客交”学说的发展 |
3.1.4 “主客交”学说的特点 |
3.2 “主客交”与肝纤维化 |
3.3 “主客交”之治疗——三甲散及加减运用 |
3.4 加减三甲散及其运用 |
4 肝纤维化与Wnt/β-catenin信号转导通路 |
4.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
4.2 Wnt信号转导通路 |
4.3 Wnt/β-catenin与肝纤维化 |
5 LncRNA与肝纤维化 |
5.1 LncRNA概况 |
5.2 LncRNA在肝纤维化中的研究 |
第二部分 实验研究 |
1 实验一 加减三甲散功效对比及wnt信号通路研究 |
1.1 实验材料 |
1.1.1 实验动物 |
1.1.2 实验主要试剂 |
1.1.3 实验主要仪器和设备 |
1.1.4 实验药物 |
1.1.5 实验场地 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 实验动物分组 |
1.2.2 干预用药的用法用量及制备方法 |
1.2.3 造模方法 |
1.2.4 药物干预方法 |
1.2.5 血清标本采集与处理 |
1.3 观察指标及方法 |
1.3.1 大鼠肉眼下观察 |
1.3.2 大鼠肝脏组织形态 |
1.3.3 血清肝功能指标观察 |
1.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量观测 |
1.5 统计学处理方法 |
1.6 实验结果 |
1.6.1 大鼠一般情况变化 |
1.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
1.6.3 血清肝功能指标观察 |
1.6.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量变化 |
1.7 讨论 |
1.7.1 加减三甲散2号方的由来 |
1.7.2 对肝纤维大鼠模型的评价 |
1.7.3 对大鼠一般情况的影响 |
1.7.4 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
1.7.5 对大鼠血清肝功能指标的影响 |
1.7.6 对肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量的影响 |
2 实验二加减三甲散干预肝纤维化大鼠lnc RNA和 m RNA表达谱的研究 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 实验主要试剂 |
2.1.3 实验仪器和设备 |
2.1.4 实验药物 |
2.1.5 实验场地 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 实验动物分组 |
2.2.2 造模方法 |
2.2.3 干预用药的制备及用法用量 |
2.2.4 药物干预方法 |
2.2.5 标本采集与处理 |
2.3 观察指标及方法 |
2.3.1 大鼠肉眼下形态观察 |
2.3.2 小鼠肝脏组织形态 |
2.3.3 血清肝纤维化指标观察 |
2.4 高通量测序肝脏组织m RMA和 lnc RNA |
2.4.1 RNA抽提和质检 |
2.4.2 文库构建 |
2.4.3 上机测序 |
2.4.3.1 获得reads |
2.4.3.2 数据预处理 |
2.4.3.3 基因组比对(Mapping genome) |
2.4.4.4 基因饱和度分析 |
2.4.4.5 mRNA和lncRNA差异基因筛选 |
2.4.4.6 GO 富集分析和 KEGG pathway 富集分析 |
2.5 统计学处理方法 |
2.6 实验结果和分析 |
2.6.1 大鼠一般情况变化 |
2.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
2.6.3 血清肝纤维化指标观察 |
2.6.4 大鼠肝脏组织mRNA表达谱的变化 |
2.6.5 大鼠肝脏组织lnc RNA表达谱的变化 |
2.7 讨论 |
2.7.1 对大鼠一般情况的影响 |
2.7.2 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
2.7.3 对大鼠血清肝纤维化指标的影响 |
2.7.4 对大鼠肝脏组织lncRNA和mRNA的影响及与“主客交”的联系 |
结论 |
特色与创新 |
问题与展望 |
致谢 |
参考文献 |
附件 1:附图 部分原始图片 |
附件 2:文献综述 中成药治疗肝纤维化的临床研究进展 |
参考文献 |
附件 3:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
(3)五味子醇乙联合蟛蜞菊内酯抗肝纤维化的效应及机制研究(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
Abstract |
注释表 |
引言 |
第一章 六味五灵片防治肝损伤的药理与临床研究进展 |
1 六位五灵片概述 |
2 六味五灵片的药理作用 |
3 六味五灵片的临床应用 |
4 安全性 |
5 展望 |
第二章 五味子醇乙联合蟛蜞菊内酯抗胆管结扎与四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的药效评价 |
1 实验材料 |
1.1 药品与试剂 |
1.2 实验细胞 |
1.3 实验动物 |
1.4 仪器及其型号 |
2 实验方法 |
2.1 胆汁淤积型肝纤维化模型建立 |
2.2 CCl4致化学性肝纤维化模型建立与实验分组 |
2.3 血清样本的制备 |
2.4 肝脏组织样本的制备 |
2.5 ELISA法检测羟脯氨酸的含量 |
2.6 HE染色观察肝脏组织病理学变化 |
2.7 天狼星红染色观察肝脏组织病理学变化 |
2.8 Masson染色观察肝脏组织病理学变化 |
2.9 免疫组化法检测肝脏组织中α-SMA的表达 |
2.10 RT-PCR检测肝脏组织中mRNA的表达水平 |
2.11 Western blot法检测肝脏组织中蛋白表达 |
3 结果 |
4 讨论 |
第三章 五味子醇乙联合蟛蜞菊内酯抗胆管结扎与四氯化碳诱导的肝纤维化机制研究 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
2.1 细胞培养 |
2.2 BMDMs的分离与培养 |
2.3 炎症刺激 |
2.4 NF-κB信号转导通路激活 |
2.5 TGF-β1 结合LPS诱导体外肝纤维化模型 |
3 结果 |
3.1 Wed/Sch-B对NLRP3炎症小体激活的影响 |
3.2 Wed/Sch-B对IκBα、IKK及其磷酸化的影响 |
3.3 Wed/Sch-B对ACT2、MMP2及MMP9 mRNA表达的影响 |
3.4 Wed/Sch-B对α-SMA、Smad3及其磷酸化的影响 |
4 讨论 |
5 结论 |
参考文献 |
作者简介 |
(4)荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通路及PPAR-r/c-Ski通路的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
引言 |
1.实验材料 |
1.1 主要实验试剂 |
1.2 主要仪器设备 |
1.3 主要实验试剂配制 |
1.4 实验细胞样本 |
2.实验方法 |
2.1 HSC细胞培养 |
2.2 细胞计数方法 |
2.3 实验分组 |
2.4 CCK-8 法检测不同浓度TFL作用下HSC的生长活力 |
2.5 各实验组中细胞上清液里的PPARr、c-Ski含量 |
2.6 qPCR法检测细胞内TGF-β1、Smad3/4 m RNA的表达 |
3.结果 |
3.1 HSC细胞的生长活力 |
3.2 各组细胞上清液中PPAR-r、c-Ski的含量比较 |
3.3 各组细胞中TGF-β1、Smad3/4 m RNA的表达比较 |
4.讨论 |
4.1 现代医学与肝纤维化 |
4.2 中医药与肝纤维化 |
4.2.1 中医与肝纤维化 |
4.2.2 中药与肝纤维化 |
4.3 TFL抗肝纤维化的研究 |
4.4 PPARγ-c-Ski通路与肝纤维化 |
4.5 TGF-β1/Smads信号通路与肝纤维化 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
略缩词表 |
综述 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历及攻读学位期间发表的学术论文 |
(5)中药复方治疗慢性乙型肝炎的研究概况(论文提纲范文)
1 慢性乙型肝炎的治疗 |
2 治疗湿热疫毒证慢性乙肝的复方 |
2.1 复方六月雪 |
2.2 小柴胡汤 |
2.3 清肝排毒饮 |
2.4蛇黄肝炎合剂 |
2.5 肝必康胶囊 |
2.6三黄乙肝胶囊 |
3 治疗肝郁脾虚证慢性乙肝的复方 |
3.1 疏肝健脾方 |
3.2 逍遥丸 |
3.3 四逆散 |
3.4 补肾健脾方 |
4 治疗气滞痰阻、瘀血阻滞证慢性乙肝的复方 |
4.1 血府逐瘀汤 |
4.2 大黄虫丸 |
4.3 鳖甲煎丸 |
4.4 茵兰益肝颗粒 |
5 小结与展望 |
(6)α-2b干扰素对乙型肝炎模型鸭肝组织炎症和肝纤维化的治疗作用(论文提纲范文)
1 材料与方法 |
1.1 实验动物、试剂和主要仪器 |
1.2 α-2b干扰素注射液剂量 |
1.3 动物造模及分组给药 |
1.4 斑点杂交法检测鸭血清DHBV-DNA水平 |
1.5 鸭血清中AST、ALT、层黏连蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原肽(PCⅢ)水平检测 |
1.6 ELISA法检测鸭肝组织中IL-6、IL-12和TNF-α水平及肝组织病理形态观察 |
1.7 统计学分析 |
2 结果 |
2.1 各组鸭血清中DHBV-DNA水平 |
2.2 各组鸭血清中AST、ALT、LN和PCⅢ水平 |
2.3 各组鸭肝组织中IL-6、IL-12和TNF-α水平 |
2.4 各组鸭肝组织病理形态表现 |
3 讨论 |
(7)探讨海珠益肝方从痰论治肝纤维化的作用及机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
中英文缩略词表 |
前言 |
材料方法 |
1 材料 |
2 方法 |
2.1 动物分组 |
2.2 模型复制和给药 |
3 观察内容 |
3.1 动物的一般情况 |
3.2 光、电镜观察小鼠肝组织变化 |
3.3 生化仪检测肝纤维化小鼠血清ALT、AST、TG、TC水平及肝组织匀浆SOD、MDA、TG、TC水平 |
3.4 ELISA检测肝纤维化小鼠肝组织匀浆HA、LN、PC III、CIV水平及血清中leptin的水平 |
3.5 RT-PCR测定小鼠肝组织leptin m RNA、OB-Rb m RNA、JAK2m RNA、STAT3 m RNA转录水平 |
3.6 Western blot测定小鼠肝组织leptin、OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表达 |
4 统计学方法 |
结果分析 |
1 动物的一般情况 |
2 肝脏病理组织学观察 |
3 海珠益肝方对ALT、AST、SOD、MDA的影响 |
4 海珠益肝方对血浆及肝组织匀浆TG、TC的影响 |
5 海珠益肝方对HA、LN、PC III、CIV及leptin的影响 |
6 海珠益肝方对leptin mRNA、OB-Rb mRNA、JAK2 mRNA、STAT3mRNA转录水平的影响 |
7 海珠益肝方对leptin、OB-Rb、JAK2、STAT3的蛋白表达的影响 |
讨论 |
1 肝纤维化动物模型的复制 |
1.1 实验动物模型的选择 |
1.2 实验动物模型的评价 |
2 对于肝纤维化病机的再认识 |
3 海珠益肝方方解 |
3.1 海珠益肝方的前期研究基础 |
3.2 海珠益肝方的组方原则 |
4 海珠益肝方的保肝抗纤维化作用 |
4.1 海珠益肝方的保肝降酶作用 |
4.2 海珠益肝方的抗纤维化作用 |
5 海珠益肝方对脂类及瘦素、瘦素受体的影响 |
5.1 肝纤维化对脂质代谢的影响 |
5.2 瘦素、瘦素受体与肝纤维化的相关性 |
6 海珠益肝方对JAK/STAT信号通路的影响 |
7 存在的问题及下一步研究方向 |
7.1 关于肝纤维化小鼠的辩证问题 |
7.2 关于研究可拓展方向的思考 |
结语 |
参考文献 |
附录 文献综述 |
参考文献 |
博士期间参与课题和发表论文情况 |
博士期间发表文章 |
致谢 |
(8)玉郎伞水提物对慢性鸭乙型肝炎的保护作用(论文提纲范文)
1材料 |
2方法 |
3结果 |
4讨论 |
(9)加味三仁汤治疗乙肝所致慢性肝炎肝作用及机制研究的作用及机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
第一部分 文献研究 |
第一章 慢性乙型肝炎及肝纤维化的病因病机研究 |
1、现代医学病因病机研究 |
1.1 慢性乙型肝炎病因病机研究 |
1.2 肝纤维化病因病机研究 |
2、慢性乙肝和肝纤维化的中医学病因病机研究 |
第二章 慢性乙型肝炎及肝纤维化的诊断与治疗 |
1 慢性乙型肝炎的诊断与治疗 |
2 肝纤维化的诊断与治疗 |
第三章、慢性乙型肝炎肝肝纤维化模型研究 |
1、鸭类乙肝动物模型 |
2、HBV转基因小鼠模型 |
3、四氯化碳(CCl4)肝纤维化模型 |
4、二甲基亚硝胺(DMN)肝纤维化模型 |
5、D一半乳糖胺(D—GalN)肝纤维化模型 |
6、酒精性肝纤维化模型 |
7、异源血清肝纤维化模型 |
8、人血清白蛋白法 |
9、刀豆素蛋白A(Con A)肝纤维化模型 |
10、胆汁性肝纤维化动物模型 |
11、血吸虫性肝纤维化动物模型 |
第四章、cccDNA与HBV |
1、HBV cccDNA的形成 |
2、HBV cccDNA的转录与调控 |
第五章、肝星状细胞与肝纤维化 |
1、HSC的激活与肝纤维化 |
2、HSC与ECM的合成 |
3、HSC与ECM的降解 |
4、HSC的凋亡 |
第六章、HSC凋亡机制 |
1 通过神经生长因子(nerve growth factors,NGF)与HSC裹面受体P75相互作用诱导凋亡 |
2 线粒体途径 |
3 通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡 |
4 粘附分子途径 |
5 中医药诱导肝细胞凋亡 |
第七章 纤溶系统与肝纤维化 |
1.纤溶系统的组成 |
2.肝纤维化过程中纤溶系统参与的作用机制 |
3.中医药对纤溶系统的影响 |
第二部分 实验研究 |
实验一 加味三仁汤抗乙肝的体内外实验研究 |
第一章 加味三仁汤体内抗鸭乙肝病毒的作用 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
3 方法 |
4.实验结果 |
5、讨论 |
第二章 加味三仁汤对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV DNA的影响 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
实验二 加味三仁汤抗肝纤维化的体内外实验 |
第一章 加味三仁汤对免疫性肝纤维化大鼠肝纤四项的影响 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
第二章 加味三仁汤对DMN肝纤维化大鼠肝组织形态的影响 |
1 实验目的 观察加味三仁汤对DMN肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响 |
2 实验材料 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
第三章 加味三仁汤对肝纤维化大鼠TGF β_1及PDGF—BB的影响 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
第四章 加味三仁汤对肝纤维化大鼠血清TNF、IL-1及IL-6的影响 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
实验三 肝星状细胞凋亡与加味三仁汤抗肝纤维化的实验研究 |
第一章 加味三仁汤对HSC-T6 TIMP-1和MMP-2表达的影响 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
第二章 加味三仁汤对体内外实验中Fas/FasL表达的干预作用 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
第三章 加味三仁汤对HSC凋亡的影响 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
实验四 加味三仁汤对大鼠纤溶系统的影响 |
1 实验目的 |
2 实验材料 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
结论 |
主要创新 |
参考文献 |
缩略词表 |
致谢 |
(10)DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用(论文提纲范文)
本研究的创新点 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
缩略词 |
第一部分 文献综述 |
第一章 鸭乙型肝炎病毒的研究进展 |
1 DHBV生物学特性 |
1.1 包膜蛋白 |
1.2 核蛋白 |
1.3 P蛋白 |
1.4 X抗原 |
2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型 |
2.1 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的建立 |
2.2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的应用 |
3 DHBV感染鸭动物模型 |
3.1 DHBV感染动物模型的建立 |
3.2 DHBV感染动物模型的影响因素 |
4 DHBV感染动物模型的相关研究及应用 |
4.1 DHBV感染鸭的各种动物模型 |
4.2 DHBV突变株的生物学意义 |
4.3 抗HBV药物筛选模型 |
4.4 液制品消毒学领域的应用 |
5 小结 |
5.1 存在的问题 |
5.2 展望 |
第二章 病毒功能性蛋白的原核表达及其应用的研究进展 |
1 概述 |
2 病毒功能性蛋白表达采用的原核表达系统 |
2.1 原核表达系统 |
2.2 外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 |
2.3 影响克隆基因在大肠杆菌细胞中表达效率的因素 |
3 病毒功能性基因的原核表达 |
3.1 嗜肝DNA病毒的原核表达 |
3.2 鸭乙型肝炎病毒preS蛋白的功能及其原核表达 |
4 应用前景 |
4.1 preS蛋白的功能研究 |
4.2 preS抗原的诊断及预后作用 |
4.3 preS抗原与疫苗 |
第二部分 实验研究 |
第三章 DHBV阳性血清的分离、全基因组的克隆及序列分析 |
1 材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要试剂 |
1.3 菌株及质粒 |
1.4 主要试剂配制 |
1.5 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 阳性血清的分离 |
2.2 DHBV全基因组的克隆 |
3 试验结果 |
3.1 血清DHBV-DNA的分离 |
3.2 DHBV全基因序列扩增和克隆 |
3.3 四川麻鸭DHBV全基因测序结果 |
3.4 四川麻鸭DHBV全基因序列分析 |
4 讨论 |
5 小结 |
第四章 DHBV PRES基因表达质粒的构建与表达 |
1 材料 |
1.1 菌株及表达载体 |
1.2 试验动物 |
1.3 常用材料与试剂 |
1.4 主要试剂配制 |
1.5 仪器与设备 |
2 方法 |
2.1 扩增目的基因的引物设计 |
2.2 PCR扩增目的基因 |
2.3 PCR产物的鉴定 |
2.4 原核表达质粒的构建 |
2.5 转化表达菌株BL21 |
2.6 诱导表达 |
2.7 表达产物的SDS-PAGE分析 |
2.8 Western blotting检测 |
2.9 表达蛋白的可溶性和不可溶性分析 |
2.10 表达条件的优化 |
2.11 重组蛋白的大量诱导表达 |
2.12 Ni—NTA亲和层析纯化重组蛋白的纯化 |
2.13 纯化蛋白的应用 |
3 结果 |
3.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 |
3.2 T载体克隆及测序鉴定 |
3.3 原核表达质粒的构建及鉴定 |
3.4 诱导表达 |
3.5 可溶性分析 |
3.6 免疫印迹 |
3.7 表达条件的优化 |
3.8 重组蛋白的纯化 |
3.9 SDS-PAGE分析纯化蛋白 |
3.10 纯化蛋白的应用 |
4 讨论 |
5 小结 |
第五章 基于鸭乙型肝炎病毒PRES蛋白免疫组化方法建立及其病毒感染鸭的抗原定位 |
1 材料 |
1.1 试验毒株 |
1.2 试验动物 |
1.3 主要仪器 |
1.4 主要试剂 |
1.5 主要试剂配制 |
2 方法 |
2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
2.2 雏鸭人工感染DHBV标本采集 |
2.3 免疫组化检测DHBV方法的建立 |
3 结果 |
3.1 免疫组化方法的建立 |
3.2 免疫组化检测各组织器官的定位研究 |
4 讨论 |
4.1 免疫组化方法检测DHBsAg的建立 |
4.2 免疫组化方法检测DHBsAg建立的意义 |
4.3 免疫组化方法对DHBsAg的定位研究 |
5 小结 |
第六章 实时荧光定量PCR检测鸭乙型肝炎病毒方法的建立 |
1 材料 |
1.1 试验毒株 |
1.2 主要仪器 |
1.3 主要试剂 |
2 方法 |
2.1 标准品的制备 |
2.2 待检标本的来源 |
2.3 FQ-PCR条件的建立和优化 |
2.4 FQ-PCR的敏感性检测 |
2.5 FQ-PCR的特异性检测 |
2.6 FQ-PCR的可重复性检测 |
3 结果 |
3.1 反应体系的优化 |
3.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
3.3 荧光定量PCR稳定性和重复性试验 |
3.4 荧光定量PCR特异性试验 |
3.5 荧光定量PCR敏感性试验 |
4 讨论 |
5 结论 |
第七章 鸭乙型肝炎病毒在感染鸭体内侵染规律 |
1 材料 |
1.1 试验毒株 |
1.2 试验动物 |
1.3 主要仪器 |
1.4 主要试剂 |
2 方法 |
2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
2.2 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的病理组织学研究 |
2.3 DHBV在感染鸭体内的侵染和分布规律 |
2.4 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的血液生化指标的研究 |
3 结果 |
3.1 病理组织学变化 |
3.2 免疫组化检测各组织器官的变化规律 |
3.3 DHBV-DNA在血清和肝组织中的变化规律 |
3.4 血液病理学变化 |
4 讨论 |
4.1 雏鸭人工感染DHBV后在体内的侵染规律及其意义 |
4.2 DHBV感染发病机理探讨 |
4.3 病理组织学和血液生化指标变化规律 |
5 小结 |
第八章 免疫组化、FQ-PCR和鸭乙型肝炎病毒感染模型联合评价抗人类乙肝新药的实验研究 |
1 材料 |
1.1 供试药物 |
1.2 常用材料与试剂 |
1.3 仪器与设备 |
1.4 试剂配制 |
2 体外实验方法 |
2.1 细胞株 |
2.2 HepG2 2.2.15细胞的传代与培养 |
2.3 细胞毒性试验 |
2.4 对细胞分泌(上清)的HBsAg、HBeAg的抑制试验 |
2.5 上清病毒基因组DNA的分离及定量检测 |
2.6 细胞总DNA的提取及定量检测 |
3 体内实验方法 |
3.1 毒株 |
3.2 主要试剂 |
3.3 实验动物及分组 |
3.4 鸭肝组织标本形态学观察 |
4 结果 |
4.1 受试药物对HepG 2.2.15细胞毒性作用结果 |
4.2 受试化合物细胞水平药效学研究结果 |
4.3 FQ-PCR检测血清和肝组织中DHBV-DNA的结果 |
4.4 病理学检查结果 |
5 讨论 |
6 小结 |
参考文献 |
致谢 |
攻博期间发表的论文 |
四、鸭乙型肝炎肝纤维化模型的研究(论文参考文献)
- [1]基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制[D]. 张强. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响[D]. 成茂源. 成都中医药大学, 2020(01)
- [3]五味子醇乙联合蟛蜞菊内酯抗肝纤维化的效应及机制研究[D]. 艾永强. 江西中医药大学, 2020(05)
- [4]荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通路及PPAR-r/c-Ski通路的影响[D]. 陈姗. 广西中医药大学, 2019(03)
- [5]中药复方治疗慢性乙型肝炎的研究概况[J]. 苏翠丽,刘雪梅,邱华,张秋奎,刘灵杰,冯宇. 中国民族民间医药, 2017(22)
- [6]α-2b干扰素对乙型肝炎模型鸭肝组织炎症和肝纤维化的治疗作用[J]. 常彩芳,候勇,丛刚. 吉林大学学报(医学版), 2017(01)
- [7]探讨海珠益肝方从痰论治肝纤维化的作用及机制研究[D]. 李红. 湖北中医药大学, 2016(08)
- [8]玉郎伞水提物对慢性鸭乙型肝炎的保护作用[J]. 农志欢,陶丽群,左巧云,陈春霞,黄仁彬. 中国实验方剂学杂志, 2015(10)
- [9]加味三仁汤治疗乙肝所致慢性肝炎肝作用及机制研究的作用及机制研究[D]. 向志超. 广州中医药大学, 2009(10)
- [10]DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用[D]. 陈宗艳. 四川农业大学, 2008(01)