一、人源化抗CD_3单链抗体的构建、序列分析和表达研究（论文文献综述）
曹韪凡[1]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中提出近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
于昊天[2]（2020）在《全人源抗蓖麻毒素单链抗体制备及其生物学活性研究》文中认为蓖麻毒素（Ricin Toxin,RT）为提取自蓖麻种子的植物毒素,属于Ⅱ型核糖体活性抑制剂,含有A亚基（Ricin Toxin A chain,RTA）和B亚基（Ricin Toxin B chain,RTB）。蓖麻毒素具有制备成本低廉、性质稳定、多种中毒途径和无特效解毒药等特点。蓖麻毒素作为生物战剂和恐怖剂,严重威胁公共安全。目前蓖麻毒素无任何解毒剂,特异性抗体治疗可能成为一种高效的治疗方法。单链抗体（single chain antibody fragment,sc Fv）具有亲本单克隆抗体对于抗原的高亲和力、高特异性等优势,还拥有体内免疫原性低、容易透过体内的屏障组织等诸多优点。应用噬菌体抗体库技术,将单链抗体基因重组至噬菌粒的特定位置,通过将单链抗体与噬菌体的外壳蛋白融合表达,最终得到噬菌体抗体。不但避免繁琐的免疫和细胞操作,并且易于对抗体改造,有利于提高抗体的亲和力。本研究为制备特异性抗蓖麻毒素的全人源单链抗体进行相关探索,主要包括以下四部分内容:1.全人源抗蓖麻毒素单链抗体的筛选本研究通过对Tomlinson I+J噬菌体抗体库循环4轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的富集筛选,成功筛选得到全人源抗蓖麻毒素单链抗体JE11。通过PCR和phage ELISA抗原交叉反应,对得到的阳性克隆进一步鉴定,筛选得到阳性率较高且假阳性率较低的克隆JE11。设计引物对筛选得到的JE11序列进行Ig BLAST,证明单链抗体为人源抗体,其VH属于VHⅢ亚群,VL为κ链,属于VκⅠ亚群。2.全人源抗蓖麻毒素单链抗体的表达工艺研究为确定制备全人源抗蓖麻毒素单链抗体的最优表达工艺,本研究通过SDS-PAGE和灰度分析,对比不同表达条件下的单链抗体表达量,确定JE11工程菌的最优诱导表达条件为:以0.5 mmol/L IPTG浓度,37℃诱导12 h。通过金属螯合层析和离子交换层析对单链抗体粗提液进行纯化,利用薄层扫描分析产物的纯度变化,最终确定JE11包涵体的纯化方法为:先用金属螯合亲和层析以50 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白,以100 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。然后用p H=7.2的平衡液使目的蛋白通过阴离子交换层析柱,目的蛋白以流穿形式流出。本研究获得97.88%纯度的JE11抗体,为下一步体内外实验验证奠定了基础。3.全人源抗蓖麻毒素单链抗体的生物学活性研究本研究利用ELISA法验证人源抗RT单链抗体JE11对RT呈剂量依赖性的特异性结合,其线性率R2为95.23%。另外,通过Western Blot实验进一步验证人源抗RT单链抗体JE11对RT的特异性结合。通过MTT验证10μg/m L JE11可保护He La细胞抵御10×IC50RT毒性,对小鼠进行肌肉注射JE11与RT,证明320μg/只JE11可在72 h内保护小鼠抵御2×LD50的RT毒性。4.利用生物信息学技术预测抗体结合力的研究本研究通过Discovery Studio软件对RT和JE11的分子模型进行对接,得到RT与JE11的复合物模型。由于结合界面的氨基酸大多集中在重链可变区,因此采用单点突变的策略,对于重链可变区CDR区或结合界面上的氨基酸向二十个天然氨基酸进行突变。通过软件组合、比较亲和力,最终设计出三株突变体进行下一步实验。通过ELISA方法比较JE11的三株突变体与JE11的亲和力区别,ELISA结果显示,JE11-5759的亲和力和稳定性均得到明显提高。综上,本研究通过筛选全人源噬菌体单链抗体库,制备了全人源抗蓖麻毒素单链抗体,并对单链抗体进行表达条件、纯化的工艺优化及生物学活性的研究,最后利用生物信息学技术预测抗体结合力,并提高了该抗体的稳定性与亲和力。研究制备的全人源抗蓖麻毒素单链抗体为蓖麻毒素检测、蓖麻毒素中毒的诊断或治疗奠定基础。
周兵[3]（2018）在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中研究表明感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植（常用噬菌体展示等抗体库技术）、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:（1）FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;（2）有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;（3）还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;（4）最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒（Flu-B）的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒（RSV）的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白（HBsAg）上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker（Gly4Ser）3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
陆礼[4]（2017）在《抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究》文中研究指明目的采用基因重组及蛋白原核表达技术获取抗CD40×HER2双特异性单链抗体（CD40×HER2 Single chain Diabody,CD40×HER2 Sc Db）,并检测其激活肿瘤特异性免疫及HER2分子靶向的功能。方法使用固相筛选法对抗CD40噬菌体展示免疫文库进行筛选,并通过噬菌体ELISA最终筛选获取高亲和力抗CD40 Sc Fv克隆。以此为模板,PCR扩增获取CD40 Sc Fv的重链可变区（heavy chain variable,VH）及轻链可变区（light chain variable,VL）序列,通过重叠PCR（Overlap Extension OE-PCR）将CD40 Sc Fv的VH及VL分两步与HER2 Sc Fv基因片段进行拼接获取CD40×HER2 Sc Db序列全长,DNA电泳及测序检测拼接序列的正确性。使用Nde I及Sal I进行CD40×HER2Sc Db序列及p ET28a原核表达载体的酶切并构建p ET28a-CD40×HER2 Sc Db原核表达载体。将构建的重组质粒转化Rosetta（DE3）感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,超声裂解诱导菌体,Ni-NTA琼脂糖纯化获取CD40×HER2 Sc Db,并对其进行理化性质的分析及分子结构预测。体外诱导培养小鼠骨髓源树突状细胞,流式细胞术检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞表面CD80/CD86及MHC-II表达的影响。依据给予的干预不同,实验分为:生理盐水（Normal Saline,NS）对照组;单纯肿瘤抗原负载（Ag）组;Ag+CD40×HER2 Sc Db组以及Ag+TNF-α组4组。ELISA检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞分泌IL-12的影响以及对T淋巴细胞分泌IFN-γ的影响。体外培养小鼠乳腺癌细胞系4T1,CCK8检测CD40×HER2 Sc Db诱导的肿瘤特异性T淋巴细胞对4T1增殖的抑制作用。构建4T1细胞系的BALB/c小鼠肿瘤模型,依据给予的不同干预,将模型小鼠随机分为:NS组;HER2 Sc Fv组;CD40×HER2 Sc Db1组（750μg/kg）;CD40×HER2 Sc Db2组（1.5mg/kg）及CD40m Ab（5mg/kg）组。记录并描绘各组肿瘤生长曲线,ELISA检测肿瘤组织中IL-12、IFN-γ的表达水平。对肿瘤组织进行石蜡包埋切片,HE染色检测肿瘤组织淋巴细胞浸润,免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测肿瘤细胞Caspase-3的表达水平。体外培养小鼠成纤维瘤细胞系T6-17细胞系,细胞免疫荧光检测CD40×HER2 Sc Db对HER2的靶向功能,CCK8实验检测CD40×HER2 Sc Db对T6-17细胞的体外杀伤。依据给予的干预不同,实验分组为:NS组;CD40 Sc Fv组（2.5μg/m L）;HER2 Sc Fv组（2.5μg/m L）;CD40×HER2Sc Db1组（2.5μg/m L）;CD40×HER2 Sc Db2组（5μg/m L）;曲妥珠单抗组（15μg/m L）。 构建T6-17细胞的BALB/c-Nude小鼠肿瘤模型,依据给予的干预不同,将模型小鼠随机分为:NS组;CD40 Sc Fv组（150μg/kg）;HER2 Sc Fv组（150μg/kg）;CD40×HER2 Sc Db1组（150μg/kg）;CD40×HER2 Sc Db2组（300μg/kg）;曲妥珠单抗组（1mg/kg）。记录小鼠皮下肿瘤的体积的变化,对肿瘤组织进行石蜡包埋并切片,HE染色观察T6-17肿瘤组织细胞形态的变化。结果固相筛选法对噬菌体展示文库克隆的序列多样性发挥了收敛效果。第三轮筛选克隆的测序结果100%匹配的克隆占总克隆数的3.2%,并筛选获取了8个潜在阳性克隆,梯度噬菌体ELISA检测各潜在克隆的亲和力表明,8#克隆与CD40的亲和力最佳,其与BSA亲和力的比值>3,符合阳性克隆筛选的标准。PCR扩增CD40 Sc Fv的VH及VL片段,DNA电泳及测序结果表明CD40 Sc Fv的VH及VL碱基长度分别为345bp及324bp,与预期大小相符,重叠PCR拼接获取的CD40×HER2 Sc Db基因序列长度为1464bp,与预期相符。使用0.5mmol/L IPTG可获得最佳蛋白诱导效果,蛋白变性电泳结果可于55Kd左右见一明显条带,其大小与预期相符,对His-tag进行Western Blot检测同样可于55Kd左右见一明显条带,BCA检测纯化后蛋白浓度为2.7mg/ml。流式细胞术检测Ag+CD40×HER2Sc Db组DC表面CD80、CD86及MHC-II的表达率分别为93.5±3.1%86.00±3.2%92.3±2.8%,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,与NS组及Ag组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。ELISA检测Ag+CD40×HER2 Sc Db组DC细胞上清中的IL-12浓度为659.90±61.28 pg/m L,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,与NS组及Ag组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。Ag+CD40×HER2 Sc Db组T淋巴细胞对4T1细胞增殖的抑制率为75.65±2.53%,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,与Ag组及NS组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。ELISA检测CD40×HER2 Sc Db2组4T1肿瘤组织内IL-12及IFN-γ表达水平分别为448.85±51.10 pg/m L,273.44±44.60 pg/m L,与NS组及HER2 Sc Fv组相比,差异有统计学意义（P<0.05）,与CD40 m Ab组相比,无统计学差异（P>0.05）。观察不同组小鼠4T1肿瘤体积的变化表明,CD40×HER2 Sc Db2组（1.5mg/kg）及CD40 m Ab（5mg/kg）均可显着抑制4T1肿瘤的体内增殖,二者的抑制效果无统计学差异（P>0.05）。免疫组化检测肿瘤组织Cleaved-Caspase-3的表达水平,结果表明,CD40×HER2Sc Db组4T1肿瘤细胞内Cleaved-Caspase-3的表达显着上调。CCK8检测CD40×HER2 Sc Db对T6-17细胞增殖的抑制结果表明,CD40×HER2 Sc Db（5μg/m L）对T6-17的抑制率为86.89±6.35%,其与曲妥珠单抗（15μg/m L）的抑制率85.56±1.73%相比,差异无统计学意义（P>0.05）。Western Blot检测不同干预组Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2的表达水平,结果表明,CD40×HER2Sc Db、HER-2 Sc Fv及曲妥珠单抗均可抑制Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2的表达,与NS组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。小鼠肿瘤组织HE染色结果表明,NS组细胞形态正常,细胞核完整,部分细胞可见核仁,细胞生长活跃,CD40×HER2 Sc Db和曲妥珠单抗组肿瘤组织细胞失去正常形态,核固缩核碎裂现象明显。结论通过对抗CD40噬菌体展示免疫文库的筛选,可成功获取抗CD40高亲和力单链抗体克隆。通过重叠PCR可成功获取CD40×HER2 Sc Db基因序列全长,通过IPTG诱导可成功于原核蛋白表达系统表达获取CD40×HER2 Sc Db蛋白,并通过蛋白复性获得功能性蛋白。CD40×HER2 Sc Db可通过促进DC细胞成熟,激活肿瘤特异性免疫,体外杀伤肿瘤,也可通过促进肿瘤特异性CTL在肿瘤组织巢集,通过激活肿瘤细胞内Caspase-3诱导肿瘤细胞凋亡,并通过上调组织内激活型免疫细胞因子激活肿瘤特异性免疫反应。CD40×HER2 Sc Db可通过与T6-17表面的HER2结合,抑制Akt、ERK1/2的磷酸化,抑制T6-17的体外增殖,同时也可在体内通过HER2靶向功能抑制T6-17细胞的增殖。
张磊[5]（2007）在《抗CD3人鼠嵌合抗体轻链在毕赤酵母中大规模发酵表达的研究》文中认为本研究选择酵母偏爱密码子同义替换鼠源性抗CD3抗体轻链可变区基因（Vκ）,与人源性轻链恒定区（Cκ）基因连接,构建完整的人鼠嵌合抗体轻链。将构建的完整的人鼠嵌合表达载体转化X-33毕赤酵母,建立兼具原核系统良好操作性和真核系统后加工性的重组抗CD3抗体毕赤酵母真核表达体系。在初步研究了发酵最佳条件后在80L发酵罐中进行大规模发酵表达,并对后续下游纯化条件做了初步探讨。结果表明,本研究正确构建了重组抗CD3抗体毕赤酵母真核表达体系,经甲醇诱导能够分泌重组抗CD3抗体轻链蛋白,重组抗CD3抗体轻链的表达具有累积效应,产量在一段时间内随表达时间延长而增加。本研究为进一步用毕赤酵母作为生物反应器大规模生产抗CD3抗体提供了实验依据。
刘梦元[6]（2005）在《抗TNF-α多价抗体的构建及体内外生物学活性研究》文中进行了进一步梳理肿瘤坏死因子α（TNF-α）是上世纪70年代发现的一个细胞因子，最初发现它能引起某些特定的肿瘤组织的出血性坏死，现在已经知道它除了具有抗肿瘤作用外，还在机体的免疫、炎症和病理中发挥重要的作用。TNF-α的拮抗剂包括中和性的抗体已被证明是急性脓毒血症、类风湿关节炎，局部性回肠炎和牛皮癣等急慢性炎症性疾病的有效治疗剂。美国FDA已批准了Etanercept、Infliximab和Adalimumab这三种抗TNF-α的生物治疗剂，其中后两种为抗TNF-α的单克隆抗体。抗体工程技术经历了鼠源杂交瘤抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体和人源抗体的发展阶段，而上世纪80年代基因工程技术的兴起使构建基因工程的小分子抗体如Fab、scFv及单域抗体等成为现实，这些小分子抗体由于分子量小、穿透性强、易于构建并可在大肠杆菌等原核系统中功能性的表达而具有广阔的应用前景。本研究通过基因工程的方法构建了具有中和活性的抗TNF-α的单链抗体，对其生物学活性进行了研究，并在此基础上对单链抗体进行了多价化，对多价抗体的体内外生物活性进行了研究，为开发新的抗TNF-α治疗剂打下了基础。 一、抗TNF-α单链抗体TNF-scFv的构建及体外活性研究 单链抗体是一种将抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段连接肽连接起来而形成的重组蛋白。本研究利用连接肽（GGGGS）3将抗TNF-α的单克隆抗体Di62的VH和VL连接起来，设计成为完整的单链抗体的氨基酸序列，然后根据设计的氨基酸序列以大肠杆菌偏爱的密码子将其反向翻译成编码的DNA序列。根据编码的DNA序列，合成了22个寡核苷酸片段并用装配PCR的方法将这22个寡核苷酸片段拼接成的完整的单链抗体编码基因，在编码基因的两端加上了克隆所需要的酶切位点。将此编码基因克隆进载体pTCM-2，通过阳性克隆的鉴定和序列测定，构建了单链抗体TNF-scFv的表达载体，命名为pTS。将载体pTS转化大肠杆菌BL21（DE3）star，利用0.4mM的IPTG诱导目
王尚资[7]（2004）在《全合成人源抗体库和人源化改型抗体库的构建及筛选》文中指出九十年代兴起的噬菌体抗体库技术是组合技术与基因工程抗体技术相结合的产物，是抗体工程领域的重大进展，代表着抗体工程的前沿。该技术的出现和发展使人们能够在体外模拟体内细胞产生抗体的全过程，为快速筛选特异性抗体提供了简便而高效的可操作系统，因而具有重要的理论意义和应用前景。 鼠源抗体应用于人体所产生的人抗鼠抗体反应（HAMA），是影响抗体药物发展的一大障碍，因此发展人源抗体的制备技术十分迫切。近年来，如下两种人源抗体制备技术得到快速发展和应用：利用抗体工程进行抗体的人源化改造和通过构建人源抗体库，筛选针对任意抗原的人源抗体。本文即是对这两项技术所进行的应用研究，通过构建两种不同功能的全合成抗体库：一是CD28鼠源抗体的人源化改型库，二是没有任何抗原偏向性的全套抗体库，从两个角度探讨了人源抗体的制备技术。对以上两个抗体库的构建和筛选工作证明了建库方法的可行性，并获得有价值的人源抗体，有望用于抗体药物的开发。 1 全合成人源抗体库的骨架构建及子库的构建与筛选 高质量全套抗体库为制备针对任意抗原的人源抗体提供了重要的分子来源，因而具有重要的基础研究和应用价值。作为抗体制备技术研究的重点和热点，构建大容量高质量全套抗体库是一项有意义而又繁琐的工作。本文针对现有抗体库在构建中存在的一些质量缺陷加以改进，采用全合成的方法作为噬菌体抗体库的构建方法。本文所采用的抗体骨架序列来自文献报道的具有较好的代表性和良好的表达折叠性能的抗体骨架序列。根据大肠杆菌偏好密码子对该序列进行了重新设计和拆分后，合成寡核苷酸片段，利用重叠PCR法进行抗体重轻链可变区基因序列的拼接，经测序证实，最终获得正确的7条重链与7条轻链可变区的抗体骨架序列。经过重轻链骨架序列的组装，最终获得49条单链抗体骨架序列。选用一条在人抗体库中使用频率最高的抗体骨架序列K3H3，以分组式合成法合成随机化CDR3序列，进行了抗体子库模式库的构建和初步筛选，构建得到库容量为107全合成抗体库。随后对抗体库的质量分析表明，阳性重组率高于95％，功能性坑体分子的表达率约为88%，该结果高于用传统刊N翼方法合成CDR区的半合成抗体库。通过对人外周淋巴组织趋化性细胞因子（s LC）重组表达的纯抗原筛选实验证明，该库具有较好的应用价值。2应用噬菌体抗体库技术实现抗CD28单域抗体的人源化改造 在抗体工程数十年的发展过程中，人们获得了无数鼠源单克隆抗体，其中相当一部分具有良好的临床应用前景。但是，鼠源抗体极易引起人体排异反应的特点，限制了这些抗体在疾病治疗领域的应用。通过抗体改型进行鼠源抗体的人源化改造，能充分利用现有的抗体资源，因而一直是抗体工程研究的热点之一。 CD28分子是T细胞活化和增殖过程中最重要的共刺激信号接受体，随着双信号识别理论的确立及CD28分子的探入研究，发现抗CD28单克隆抗体可以同B7家族一样传递共刺激信号，替代CD28的天然配体（B7）与CD28结合产生协同刺激信号，，辅助TCR/CD3介导的第一信号途径，活化T细胞和促进T细胞增殖，分泌多种细胞因子。在临床上，抗CD28抗体己作为免疫抑制剂用于器官移植和自身免疫性疾病的预防。- 本论文对一株几鼠源抗CD28单抗9.3的轻链进行人源化改造，并与本实验室己构建成功的人源化抗CD28单域抗体重链基因相连，构建成为人源化抗CD28单链抗体，为临床应用奠定基础。 本实验设计以定向分子进化理论为基础，采用非计算机同源模建方法构建改型抗体库，无需对抗体序列进行空间模拟来确定需要移植的骨架区上的关键氨基酸残基;该改型方法将抗体的改型及亲和力的成熟于同一步骤完成，从而节省构建的时间及劳动强度。
王健,李锴男,孙妍琳,刘彦仿,付勇,刁建升,屈晓杰[8]（2004）在《人源抗肝癌单链抗体scFv-CD3ζ基因真核载体的构建》文中研究说明目的克隆正常人T细胞CD3ζ的胞内区、跨膜区基因,将其与二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的基因克隆入真核表达载体,为制备肝癌靶向性嵌合锚定T细胞奠定基础,并探讨其对肝癌的杀伤活性。方法应用PCR法将二硫键稳定的人源化的单链抗体scFv的基因克隆入真核细胞表达载体pcDNA3,在5’端及3’端分别引入相应酶切位点;用RT-PCR法从正常外周血人T细胞扩增出CD3ζ的胞内区、跨膜区基因,然后将其克隆于scFv的下游,并在5’端及3’端引入相应的酶切位点。结果二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的cDNA片段为735bp,与已知的序列相符;CD3ζ的胞内区、跨膜区的cDNA片段为294bp,与GeneBank公布的序列一致。重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳及测序加以证实。结论完成了二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv及CD3ζ的胞内区、跨膜区融合基因真核表达载体pcDNA3-scFv-CD3ζ的构建,为制备肝癌靶向性嵌合锚定T细胞奠定了实验基础。
李锴男,刘彦仿,孙妍琳,付勇,赵君,高娟,杨守京[9]（2004）在《肝癌靶向性T细胞活化融合基因scFv-CD3ζ的构建与表达》文中进行了进一步梳理目的 :构建抗肝癌单链抗体融合CD3 ζ真核表达载体。 方法 :应用PCR法将二硫键稳定的人源化的单链抗体scFv的基因克隆入真核细胞表达载体pcDNA3 ,在 5′端及 3′端分别引入相应酶切位点 ;用RT PCR法从正常外周血人T细胞扩增出CD3 ζ的胞内区、跨膜区基因 ,然后将其克隆于scFv的下游 ,并在5′端及 3′端引入相应的酶切位点。以脂质体转染法将pcDNA3 scFv CD3 ζ转入T细胞 ,采用免疫细胞化学的方法 ,利用抗CD3 ζ的单克隆抗体检测转染前后T细胞中CD3 ζ的表达。 结果 :二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的cDNA片段为 73 5bp ,与已知的序列相符 ;CD3 ζ的胞内区、跨膜区的cDNA片段为 2 94bp ,与GeneBank公布的序列一致。重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳及测序加以证实。转染前后T细胞中CD3 ζ染色强度显着增强。 结论 :完成了二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv及CD3 ζ的胞内区、跨膜区融合基因真核表达载体pcDNA3 scFv CD3 ζ的构建 ,制备了肝癌靶向性T细胞
李锴男[10]（2004）在《肝癌靶向性T淋巴细胞活化融合基因hdsFv-CD3ζ的构建、表达与应用的研究》文中研究表明肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）简称肝癌，是恶性程度极高的肿瘤，在我国有着较高的发病率和死亡率，目前，临床对肝癌的诊治仍然十分困难。随着现代分子生物学，基因工程技术和蛋白质工程技术的发展，基因工程抗体的诞生为肿瘤的诊断和治疗带来了希望，尤其是单链抗体的应用成为免疫基因治疗的热点。我室成功的构建了一二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体（hdsFv），提高了抗体的稳定性，降低了亲本鼠源性抗肝癌单链抗体的免疫原性，而其亲和性和特异性无明显下降。CD3是主要分布于成熟T淋巴细胞表面的分子，与TCR非共价结合形成TCR／CD3复合物，构成T淋巴细胞活化信号，而CD3ζ链在TCR／CD3信号转导中起重要作用。本研究将抗肝癌hdsFv的基因与人T细胞活化信号CD3ζ基因融合，构建了肝癌靶向性T细胞的嵌合受体，并在人PBMC和Jurkat T淋巴瘤细胞中表达，为制备肝癌靶向性T细胞奠定了实验基础。 1．构建真核表达载体pcDNA3-hdsFv-CD3ζ。采用RT-PCR从正常人外周血T淋巴细胞总RNA中克隆CD3ζ的胞内区及跨膜区基因，经测序，与GenBank公布的序列一致。用PCR从含有抗肝癌单链抗体的原核表达载体第四军医大学硕士学位论文 pET一22b（+）一hdsFv中克隆其基因序列，经测序，与已知序列相同。将二者序列重组导入真核表达载体pcDNA3，构建重组表达载体peDNA3一hdsFv一CD3乙，经酶切鉴定序列分析与GenBank公布的CD3乙和已知的hdsFv序列相同。 2.肝癌靶向性T淋巴细胞活化融合基因hdsFv一CD3心的表达与定位检验。将构建好的真核表达载体pcDNA3一hdsFv一CD3心用脂质体法转染JurkatT淋巴瘤细胞，经G418筛选获得正常生长的阳性克隆，用Westernblotting检测表明转染后Jurkat细胞中有hdsFv一CD3心融合蛋白的表达。再经细胞化学染色鉴定和灰度分析，hdsFv--CD3心表达于Jurkat细胞的细胞膜上，经修饰的Jurkat细胞可表达较高量的CD3心分子。用RT一PCR从经hdsFv一CD3心修饰的Jurkat细胞中检验出了hdsFv的表达。 3.hdsFv一CD3心修饰的Jurkat和PBMC的功能检验。将hdsFv一CD3心修饰的Jurkat细胞与HepGZ细胞共培养，发现Jurkat细胞粘附在HepGZ上，说明了经hdsFv一CD3乙修饰的Jurkat细胞具有良好的靶向性。再将pcDNA3一hdsFv一CD3心用脂质体法转染pBMC，经细胞化学染色鉴定，CD3心的表达量增加，证实hdsFv一CD3心导入PBMC中。由于活化的T细胞表达CD25，用hdsFv一CD3心修饰活化的的PBMC，经直接免疫荧光染色和FCM分析CD25的表达增加。用hdsFv一CD3心修饰活化的PBMC的培养液上清进行IL一2的生物活性检测，结果证实修饰后的PB毗的IL一2分泌增加。hdsFv一CD3心修饰的PBMC，与肝癌H即G2细胞共培养，以未转染的PBMC与HepGZ细胞共培养做对照，培养6h后，AnnexinV荧光染色检测HepGZ细胞的凋亡，结果表明经hdsFv一CD3心修饰活化的PBMC可以较好的诱导HepGZ细胞的凋亡。将hdsFv一CD3心、hdsFv修饰的PBMC与未转染的PBMC与肝癌HePGZ细胞和宫颈癌H。1a细胞按50:1的效靶比共培养，结果表 4第四军医大学硕士学位论文明，hdsFv一CD3乙、hdsFv修饰的PBMC均可显着杀伤HepGZ细胞，但以hdsFv一CD3心修饰的PBMC杀伤作用最强，共培养6h后，HepGZ细胞即有死亡，12h后死亡细胞进一步增加，18h时，转染hdsFv和hdsFv一CD3心的PBMC对H即G2细胞的杀伤率分别可达到62.39%和75.85%。转染hdsFv一CD3心的PBMC也可显着杀伤Hela细胞，18h时可达63.13%。转染hdsFv一CD3心的PB毗对Hela细胞杀伤率较高除与CD3乙有活化T细胞的功能外，还与PBMC培养时加入了IL一2引起的非特异性活化有关，应属于非特异性活化杀伤。 本研究成功的克隆了CD3心的胞内区及跨膜区基因，构建了抗肝癌hdsFv与T淋巴细胞活化信号CD3心嵌合受体的真核表达载体penNA3一hdsFv一Cn3心，转染入PB讹和JurkatT淋巴瘤细胞，并以此为基础进行了T淋巴细胞活化与功能检验。修饰后的PBMC和肝癌H即G2细胞共培养，与未修饰的PBMC相比，能较好的诱导H即G2细胞的凋亡。 综上所述，我们首次构建了抗肝癌单链抗体融合CD3心的基因，制备了具有肝癌靶向性的PBMC和JurkatT淋巴细胞。该实验结合了杀伤性T细胞的抗肿瘤作用与协同刺激分子两大研究热点，使体液免疫与细胞免疫相结合，利用了TCR/CD3心中抗原识别和信号转导的独立性，将抗体分子的导向作用和T细胞活化信号相结合，构建的肿瘤特异性T细胞的杀伤功能由于不受栩C限制具有一定的临床应用价值，可以提高抗肿瘤综合免疫治疗的水平。
二、人源化抗CD_3单链抗体的构建、序列分析和表达研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人源化抗CD_3单链抗体的构建、序列分析和表达研究（论文提纲范文）
（1）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（2）全人源抗蓖麻毒素单链抗体制备及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 全人源抗蓖麻毒素单链抗体的筛选 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 菌株与抗体库的保存 |
| 1.2.2 抗体库的扩增 |
| 1.2.3 噬菌体滴度的测定 |
| 1.2.4 抗体库的富集 |
| 1.2.5 阳性克隆菌株的鉴定 |
| 1.2.6 分析阳性克隆序列 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 噬菌体抗体库的扩增 |
| 1.3.2 噬菌体抗体库富集筛选效率 |
| 1.3.3 PCR鉴定阳性克隆 |
| 1.3.4 Phage ELISA抗原交叉反应 |
| 1.3.5 阳性克隆DNA序列分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 全人源抗蓖麻毒素单链抗体的表达工艺研究 |
| 2.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 全人源抗蓖麻毒素scFv诱导表达工艺研究 |
| 2.2.2 全人源抗蓖麻毒素scFv纯化工艺研究 |
| 2.2.3 全人源抗蓖麻毒素scFv复性工艺研究 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 全人源抗蓖麻毒素scFv诱导表达工艺研究 |
| 2.3.2 全人源抗蓖麻毒素scFv纯化工艺研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 全人源抗蓖麻毒素单链抗体的生物学活性研究 |
| 3.1 实验材料及仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ELISA鉴定单链抗体的结合活性 |
| 3.2.2 Western blot鉴定单链抗体的结合活性 |
| 3.2.3 MTT鉴定单链抗体的中和活性 |
| 3.2.4 体内鉴定单链抗体的中和活性 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ELISA鉴定单链抗体的结合活性 |
| 3.3.2 Western blot鉴定单链抗体的结合活性 |
| 3.3.3 MTT鉴定单链抗体的中和活性 |
| 3.3.4 体内鉴定单链抗体的中和活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 利用生物信息学技术预测抗体结合力的研究 |
| 4.1 实验材料及仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 软件与在线平台 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 同源建模与模型评价 |
| 4.2.2 ZDOCK与 RDOCK |
| 4.2.3 点突变结合界面氨基酸 |
| 4.2.4 突变体工程菌的制备 |
| 4.2.5 表达与验证突变体亲和力 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 构建与评价3D模型 |
| 4.3.2 分子对接结果 |
| 4.3.3 分析结合界面的氨基酸 |
| 4.3.4 点突变结合界面氨基酸 |
| 4.3.5 重链可变区突变体的设计 |
| 4.3.6 ELISA验证亲和力变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体(Antibody)的概述 |
| 1.1.1 抗体的结构与功能 |
| 1.1.2 抗体的人源化 |
| 1.1.3 抗体药物市场 |
| 1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
| 1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
| 1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
| 1.2.1 HBV基因组 |
| 1.2.2 HBV的病毒结构 |
| 1.2.3 HBV的生命周期 |
| 1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
| 1.2.5 HBV的基因型 |
| 1.2.6 HBV的流行病学 |
| 1.2.7 HBV的预防 |
| 1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 1.3 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 常规细胞生物学方法 |
| 2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.4 免疫学相关实验方法 |
| 2.2.5 体外调理吞噬实验 |
| 2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
| 2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
| 2.2.8 亲和力常数测定 |
| 2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
| 2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
| 2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
| 2.2.12 数据处理统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
| 3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
| 3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
| 3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
| 3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
| 3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
| 3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
| 3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
| 3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
| 3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
| 3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
| 3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
| 3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
| 3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
| 3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
| 3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
| 3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼠源抗体人源化方法 |
| 4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
| 4.3 FR区人源化点突变规则 |
| 4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
| 4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
| 4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 一、抗CD40高亲和力单链抗体克隆的筛选 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验技术路线图 |
| 1.1.2 菌株及文库 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要溶液配方 |
| 1.1.5 主要培养基配方 |
| 1.1.6 主要仪器 |
| 1.1.7 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 原始文库扩增后滴度测定 |
| 1.2.2 噬菌体展示个轮筛选筛选压力的测定 |
| 1.2.3 噬菌体展示各轮筛选克隆随机测序及相互比对 |
| 1.2.4 潜在阳性克隆的选择 |
| 1.2.5 噬菌体ELISA比较各克隆亲和力差异 |
| 1.2.6 第1次梯度噬菌体ELISA比较各克隆亲和力差异 |
| 1.2.7 第2次梯度噬菌体ELISA比较各克隆亲和力差异 |
| 1.2.8 8~#阳性克隆测序结果及分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 抗体筛选技术的选择 |
| 1.3.2 噬菌体展示系统的选择 |
| 1.3.3 噬菌体展示筛选策略的设计 |
| 1.3.4 潜在阳性克隆的选择 |
| 1.4 小结 |
| 二、抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及蛋白表达 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验技术路线图 |
| 2.1.2 菌株及文库 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配方 |
| 2.1.5 主要培养基配方 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 实验方法 |
| 2.1.8 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PCR扩增 8~#克隆CD40 ScFv的VH及VL片段 |
| 2.2.2 PCR扩增HER2 ScFv序列全长 |
| 2.2.3 重叠PCR拼接CD40×HER2 ScDb |
| 2.2.4 CD40×HER2 ScDb原核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.2.5 CD40×HER2 ScDb基因测序及序列分析 |
| 2.2.6 CD40×HER2 ScDb基因序列翻译结果预测 |
| 2.2.7 CD40×HER2 ScDb蛋白理化性质分子结构预测 |
| 2.2.8 CD40×HER2 ScDb蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.2.9 Western Blot检测目的蛋白His-tag表达 |
| 2.2.10 CD40×HER2 ScDb Ni-NTA琼脂糖蛋白纯化 |
| 2.2.11 BCA蛋白定量法测定CD40×HER2 ScDb蛋白浓度 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 双特异性单链抗体的构建 |
| 2.3.2 双特异性单链抗体蛋白表达体系的设计 |
| 2.3.3 重组蛋白原核表达产物的纯化 |
| 2.4 小结 |
| 三、抗CD40×HER2双特异性单链抗体免疫激活功能验证 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验技术路线图 |
| 3.1.2 实验动物及细胞 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液及培养基配方 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 实验方法 |
| 3.1.7 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 小鼠骨髓来源树突状细胞体外诱导及培养 |
| 3.2.2 流式细胞术检测不同干预组小鼠DC细胞表面标志物表达水平 |
| 3.2.3 ELISA检测不同组小鼠DC细胞上清IL-12 细胞因子水平 |
| 3.2.4 流式细胞术检测富集小鼠脾脏淋巴细胞CD3~+T淋巴细胞比例 |
| 3.2.5 ELISA检测不同组T细胞共培养后IFN-γ 表达水平的差异 |
| 3.2.6 肿瘤特异性T淋巴细胞对 4T1肿瘤细胞的杀伤 |
| 3.2.7 不同组 4T1小鼠肿瘤模型肿瘤生长趋势的比较 |
| 3.2.8 ELISA检测不同干预小鼠肿瘤组织中IFN-γ 细胞因子的表达水平 |
| 3.2.9 ELISA检测不同干预小鼠肿瘤组织中IL-12(p70)细胞因子的表达水平 |
| 3.2.10 HE染色检测不同组肿瘤组织中淋巴细胞浸润 |
| 3.2.11 IHC检测肿瘤细胞内Cleaved-caspase-3 的表达水平 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 CD40激动型抗体激活肿瘤免疫反应 |
| 3.3.2 CD40×HER2 ScDb促进小鼠树突状细胞成熟 |
| 3.3.3 CD40×HER2 ScDb诱导肿瘤特异性的免疫杀伤 |
| 3.4 小结 |
| 四、抗CD40×HER2双特异性单链抗体HER2靶向功能验证 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验技术路线图 |
| 4.1.2 动物及细胞系 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要溶液及培养基配方 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.1.6 实验方法 |
| 4.1.7 统计学方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 细胞免疫荧光检测CD40×HER2 ScDb与HER2的靶向性 |
| 4.2.2 不同干预对T6-17 细胞增殖及形态的影响 |
| 4.2.3 CCK8检测不同干预对T6-17 细胞增殖的抑制率 |
| 4.2.4 WB检测不同组肿瘤细胞内PI3K/Akt信号通路相关分子的磷酸化水平 |
| 4.2.5 CD40×HER2 ScDb对裸鼠体内T6-17 肿瘤增殖的影响 |
| 4.2.6 HE染色检测不同干预对T6-17 肿瘤细胞形态的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 针对HER2的分子靶向治疗 |
| 4.3.2 CD40×HER2 ScDb体外对T6-17 细胞增殖的抑制作用 |
| 4.3.3 CD40×HER2 ScDb对PI3K/Akt信号通路的抑制作用 |
| 4.3.4 CD40×HER2 ScDb对MAPK/ERK1/2 信号通路的抑制作用 |
| 4.3.5 CD40×HER2 ScDb抑制T6-17 细胞在小鼠体内的增殖 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 抗体类药物在恶性肿瘤治疗中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）抗CD3人鼠嵌合抗体轻链在毕赤酵母中大规模发酵表达的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 文献回顾 |
| 第一节 抗CD3 抗体的结构特征 |
| 第二节 抗CD3 抗体的生物学特性及临床研究 |
| 第三节 立题依据 |
| 第二章 抗CD3 人鼠嵌合抗体轻链的构建 |
| 第一节 材料和方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 抗CD3 人鼠嵌合抗体轻链在毕赤酵母中的表达 |
| 第一节 材料和方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四章 抗CD3 人鼠嵌合抗体轻链大规模发酵及纯化 |
| 第一节 材料和方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（6）抗TNF-α多价抗体的构建及体内外生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语 |
| 第一部分 抗TNF-α单链抗体的构建和生物学活性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验与结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 抗TNF-α单链多价抗体的构建及生物学活性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 抗TNF-α抗体体内生物学活性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果和分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 论文结论 |
| 第五部分 文献综述 |
| 致谢 |
（7）全合成人源抗体库和人源化改型抗体库的构建及筛选（论文提纲范文）
| 第一章 全合成人源抗体库的骨架构建及子库的构建与初步筛选 |
| 1.1 前言 |
| 1.1.1 合成抗体库的出现与发展 |
| 1.1.2 合成抗体库的构建基础 |
| 1.1.3 合成抗体库的构建方法 |
| 1.1.4 现有的合成抗体库和发展趋势 |
| 1.1.5 本文采用的抗体骨架序列来源 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 常规实验方法 |
| 1.2.3 全合成抗体库骨架序列的构建 |
| 1.2.4 全合成抗体库子库的构建及初步筛选 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 全合成抗体库骨架序列的构建 |
| 1.3.2 全合成抗体库子库的构建 |
| 1.3.3 全合成抗体库子库的鉴定与筛选 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 全合成抗体库的设计 |
| 1.4.2 正确骨架序列的获得 |
| 1.4.3 全合成抗体库子库的构建 |
| 1.4.4 全合成抗体库子库的筛选 |
| 第二章 应用噬菌体抗体库技术实现抗CD28单链抗体的人源化改造 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 蛋白质工程与抗体工程的出现 |
| 2.1.2 抗体人源化与噬菌体抗体库技术 |
| 2.1.3 一种新的人源化改型策略 |
| 2.1.4 CD28分子与CD28抗体在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 2.1.5 实验路线 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 抗CD28改型单链抗体的设计策略 |
| 2.2.2.2 抗CD28改型单链抗体库的构建 |
| 2.2.2.3 CD28噬菌体抗体库改型库的亲和淘选 |
| 2.2.2.4 高亲和力抗CD28人源化单链抗体的筛选及鉴定 |
| 2.2.3 结果与讨论 |
| 2.2.3.1 CD28 V_L的人源化序列设计 |
| 2.2.3.2 抗CD28改型单链抗体库的构建 |
| 2.2.3.3 抗CD28人源化单链抗体的筛选 |
| 2.2.3.4 人源化单链抗体突变体活性的测定 |
| 2.2.3.5 人源化改型单链抗体的序列分析 |
| 2.2.3.6 抗CD28改型单链抗体的计算机空间结构模拟 |
| 2.2.3.7 讨论 |
| 第三章 文献综述 |
| 3.1 抗体药物的诞生、发展与应用现状 |
| 3.2 肿瘤的抗体介导治疗 |
| 3.3 抗体生产技术 |
| 3.4 组合化学与噬菌体展示库 |
| 3.5 全合成抗体库构建的分子基础 |
| 第四章 小结 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）人源抗肝癌单链抗体scFv-CD3ζ基因真核载体的构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计合成 |
| 1.2.2 CD3ζ胞内区及跨膜区cDNA的克隆 |
| 1.2.3 重组表达载体pcDNA3-scFv的构建及酶切鉴定 |
| 1.2.4 重组表达载体pcDNA3-scFv-CD3ζ的构建及酶切鉴定 |
| 1.2.5 DNA测序分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 人CD3ζ基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 重组表达载体pcDNA3-scFv的构建、筛选、鉴定 |
| 2.3 重组表达载体pcDNA3-scFv-CD3ζ的构建、筛选、鉴定与序列分析 |
| 3 讨论 |
（10）肝癌靶向性T淋巴细胞活化融合基因hdsFv-CD3ζ的构建、表达与应用的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、人源化抗CD_3单链抗体的构建、序列分析和表达研究（论文参考文献）
- [1]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [2]全人源抗蓖麻毒素单链抗体制备及其生物学活性研究[D]. 于昊天. 军事科学院, 2020
- [3]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [4]抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究[D]. 陆礼. 天津医科大学, 2017(01)
- [5]抗CD3人鼠嵌合抗体轻链在毕赤酵母中大规模发酵表达的研究[D]. 张磊. 吉林大学, 2007(03)
- [6]抗TNF-α多价抗体的构建及体内外生物学活性研究[D]. 刘梦元. 中国协和医科大学, 2005(12)
- [7]全合成人源抗体库和人源化改型抗体库的构建及筛选[D]. 王尚资. 中国海洋大学, 2004(01)
- [8]人源抗肝癌单链抗体scFv-CD3ζ基因真核载体的构建[J]. 王健,李锴男,孙妍琳,刘彦仿,付勇,刁建升,屈晓杰. 实用医药杂志, 2004(05)
- [9]肝癌靶向性T细胞活化融合基因scFv-CD3ζ的构建与表达[J]. 李锴男,刘彦仿,孙妍琳,付勇,赵君,高娟,杨守京. 肿瘤防治杂志, 2004(04)
- [10]肝癌靶向性T淋巴细胞活化融合基因hdsFv-CD3ζ的构建、表达与应用的研究[D]. 李锴男. 第四军医大学, 2004(03)