一、I 根瘤菌的遗传改造及其应用 II DNA超螺旋对nif基因表达的调节作用（论文文献综述）
王亚伟[1]（2019）在《胡萝卜软腐果胶杆菌苎麻脱胶增效的关键酶及应用研究》文中进行了进一步梳理苎麻纤维是最好的天然植物纤维,其纤维最长、强度大,具有吸湿透气、防霉耐磨等多种功能,使苎麻纤维织物在国内外高端市场广受欢迎。苎麻纤维是由苎麻韧皮脱胶获得,习惯将苎麻纤维以外的果胶、半纤维素和木质素等成分统称为胶质。对比目前普遍使用的高温强碱脱胶工艺,生物脱胶能大幅节能减排,并显着提高纤维品质,是目前的研究重点和难点。本课题组前期筛选获得苎麻高效脱胶菌株胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum HG-49,其脱胶率达82.2%,去除了苎麻韧皮中95%果胶、70%半纤维素,残留的主要胶质为半纤维素,仍需一定量的碱进行高温碱煮才能去除,分析发现残胶中的甘露聚糖含量较高。为了进一步提高P.carotovorum HG-49脱胶效果,减少碱的用量和高温能耗,本研究对降解甘露聚糖的关键半纤维素酶进行了筛选和脱胶效果评价,并构建相应的高效工程菌,以期显着提高脱胶效果,取得的主要研究结果如下:（1）筛选鉴定并高效表达了苎麻脱胶关键酶—甘露聚糖酶（Man B）,发现该酶与P.carotovorum HG-49协同脱胶能提高苎麻韧皮的半纤维素去除率。依据苎麻半纤维素中甘露聚糖含量较高的特征,以及P.carotovorum HG-49脱胶过程中监测p H变化由中性逐渐升高至碱性,确定以耐碱的甘露聚糖酶为关键半纤维素酶的筛选目标。对已发表的甘露聚糖酶进行了筛选,获得一种能特异性水解甘露聚糖的耐碱典型甘露聚糖酶。对该酶的密码子进行优化,使其适用于毕赤酵母表达系统,合成优化后的酶基因序列并命名为Man B（Gen Bank accession No.KJ806638.1）。构建了高产重组菌株6×Man B-P.pastoris GS115,并在30 L发酵罐中高密度发酵后,上清液中酶活力达1649 IU/m L,蛋白质浓度达3.34 g/L。Man B的最适反应温度为70-75oC,最适反应p H为7-9,在p H 6-10能够维持稳定。Man B对角豆胶和魔芋粉水解活力最高,比活力分别为494.0 IU/mg和152.8 IU/mg。将不同浓度的Man B与P.carotovorum HG-49联合使用对苎麻韧皮进行原位脱胶处理,发现添加400 IU/m L Man B时苎麻韧皮脱胶率提高到85.6%。（2）分析P.carotovorum HG-49基因组中糖苷水解酶,发现了一种能显着提高苎麻韧皮脱胶效果且具有较高甘露聚糖酶活性的酶（Cel5M）,并鉴定了该酶的特性和功能。通过分类注释P.carotovorum HG-49基因组中所有糖苷水解酶,仅发现一种N端催化域分类于糖苷水解酶第五家族（GH5）、C端分类于碳水化合物第三家族（CBM3）的酶具有较高甘露聚糖酶活力,尤其是对以葡甘聚糖为主的魔芋粉水解活性最高,故命名为葡甘聚糖酶Cel5M（Gen Bank accession No.MH544226.1）。利用重组酶Cel5M与P.carotovorum HG-49联合脱胶,发现添加400 IU/m L Cel5M时脱胶率提高至88.9%,特别是,半纤维素去除率显着提高。Cel5M最适反应温度为65o C,最适反应p H为6.5,在p H 5.0-9.0能够维持较高的稳定性。该酶具有较宽广的底物水解谱,对魔芋粉、羧甲基纤维素钠、木聚糖、角豆胶和瓜尔豆胶等水溶性底物均具有较高的水解活力,比活力依次为1061.1 IU/mg、647.3 IU/mg、563.4 IU/mg、315.1IU/mg和297.1 IU/mg。以魔芋粉作为底物时,Cel5M的热稳定性与酸碱耐受性较高。另外,Cel5M的CBM3能显着提高催化域的比活力,并降低对金属离子等的敏感性。（3）以P.carotovorum HG-49为表达受体,构建了过表达工程菌,提高了苎麻韧皮脱胶效果。将携带信号肽的Cel5M基因与载体p UC18-YJ重组后,转化原始菌P.carotovorum HG-49,获得Cel5M的组成型表达工程菌。分析比较工程菌与原始菌分别在富营养条件下和苎麻脱胶过程中的生长状态和酶活力,发现工程菌具有明显的生长和产酶优势。工程菌将脱胶率由原始的82.2%提高到87.7%,提高了苎麻韧皮的脱胶效果。本研究发现甘露聚糖酶能显着提高P.carotovorum HG-49苎麻脱胶效果,通过构建同源过表达Cel5M的高效脱胶工程菌,大幅降低了苎麻生物脱胶过程中半纤维素的残留,促进了苎麻生物脱胶绿色技术的应用。
刘炜[2]（2019）在《炭基肥与化肥配施对水稻产量和土壤养分的影响》文中指出炭基肥是由生物质炭与化学肥料混合制成的新型肥料,对减少化肥损失、改良土壤作用明显。目前,炭基肥与化肥不同配施模式对红壤双季稻区土壤肥力和水稻产量的影响了解较少。为探讨紫云英还田下炭基肥与化肥配施对水稻产量和土壤养分的影响,本研究利用开始于2018年3月的江西省万年县定位实验,以冬闲常规施氮为对照,分析了炭基肥与化肥不同配施模式对水稻生长、籽粒产量和土壤理化性状的影响,结果表明:1.炭基肥与化肥不同配施模式影响了水稻产量。在早稻季,与冬闲常规施氮处理相比,减施20%化肥氮处理增产0.381.23 t/hm2。减施20%各处理产量随着施肥中化肥所占比例的下降,炭基肥所占比例的上升呈现出先增加后下降的趋势。在晚稻季,与冬闲常规施氮相比,减施20%化肥氮各处里中仅F80N8C2处理产量有所增加;通过比较全年水稻产量可知,炭基肥与化肥配施随着炭基肥所占比例的增加、化肥所占比例的下降,各处理水稻产量呈现出先增加再减少的趋势,在化肥N和炭基肥N比为8:2时,水稻增产最为明显。2.炭基肥与化肥配施增加了水稻干物质积累量。与冬闲常规施氮处理相比,炭基肥与化肥配施的水稻干物质积累量在一定程度上有所提高,其中以化肥N与炭基肥N配施比例为8:2处理的干物质积累量最大,较冬闲常规施氮处理增加了2.6%7.9%,但各处理间差异并不显着。3.炭基肥与化肥配施促进了水稻氮磷钾养分吸收。炭基肥与化肥配施各处理均提高了氮、磷、钾收获指数,表明炭基肥与化肥配施有利于氮、磷、钾在植株籽粒中的累积;并且化肥N与炭基肥N配施比例为8:2时,氮、磷和钾收获指数最高。4.炭基肥与化肥配施影响了土壤养分含量。炭基肥与化肥不同配施模式的全氮、碱解氮、速效钾含量高于冬闲常规施氮处理,但各处理有效磷的含量差异不大。综上,紫云英还田和减施20%化肥氮条件下,化肥N与炭基肥N比例为8:2的处理是红壤双季稻区开展化肥减施和保障高产较佳的炭基肥与化肥配施模式。
石世强[3]（2015）在《嗜酸性喜温硫杆菌启动子的筛选和性质研究》文中认为中度嗜热、嗜酸化能自养菌嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus,A.caldus）是一种重要的浸矿微生物,在混合浸矿体系中可协助铁氧化细菌显着提高浸矿效率。启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子的研究对于构建基因工程载体,改造代谢途径,表达目的蛋白有着重要的意义。本论文根据实验室已有的基因组学和转录组学数据,预测分析了A.ca dus中主要代谢途径相关基因启动子的序列特征。克隆了部分基因启动子,以gusA为报告基因,构建了启动子探测质粒,分别在E.coli和A.caldus中进行了实验验证和分析。构建了含有报告基因gusA和诱导型启动子的质粒,并在不同浓度的IPTG诱导下分别测定了 mRNA表达水平和目的蛋白酶活。将启动子探测质粒通过接合转移的方式转入到A.calds中,并且在A.caldus中对启动子活性进行检测。初步分析了 A.caldus来源的启动子在E.coli和A caldus中的差异。本论文围绕A.caldus的启动子,主要在以下四个方面取得进展:第一,根据本室已有的A.caldus基因组信息获得了碳代谢、氮代谢和硫代谢等主要代谢途径相关基因可能包含启动子的上游序列,对这些序列进行了生物信息学分析,获得每个启动子的-10区和-35区序列和二者之间的距离及软件打分。对启动子的序列进行分析,我们得到了A.caldus基因的基本启动子-10区序列为G33G58G39T73A92T48A42A51T89,-35区基本序列为T80T80g74C45C56A35。通过对启动子的统计分析,能够为更好地了解A.caldus 代谢的独特性提供了重要线索。第二,首次对A.caldus基因启动子,尤其是对硫代谢途径相关基因的启动子进行了大量的筛选和鉴定。获得了大量具有启动子活性的DNA片段,为浸矿工程菌的构建提供了有价值的启动子元件。初步分析了硫代谢基因在代谢途径中所处地位,发现这些基因启动子活性的强弱,与其在代谢途径中重要性的大小有密切相关性。发现了一些与硫氧化相关基因的高活性基因启动子,为进一步深入探讨硫代谢机制和构建基因工程菌提供了支持。第二,构建了含有诱导启动子和报告基因的表达质粒,加入不同浓度IPTG诱导报告基因的表达,通过检测酶活和mRNA表达水平比较了启动子在转录和翻译水平的差异。相关性分析显示二者之间的相关系数为0.985,说明二者之间存在着非常强的相关性。这也说明,不论使用转录水平还是翻译水平的参数对启动子的活性进行检测,都能够很好的表征启动子的活性。第四,将部分启动子探测质粒通过接合转移的方式转移到A.caldus,通过检测A.caldus 中mRNA,发现不同启动子之间的mRNA表达水平差异小于在E.coli中的表达水平,但整体趋势与在E.coli中的比活趋势类似。六个基因启动子只有一个启动子的活性相比于在E.coli中有明显下降,可能是和A.caldus和E.coli遗传背景存在差异有关。
陆荣[4]（2008）在《喜树内生真菌产喜树碱及生物活性的研究》文中研究指明本研究以安徽境内喜树为研究对象,通过对喜树内生真菌的分离、筛选、发酵条件以及代谢产物喜树碱提取工艺的摸索等方面的研究,对微生物发酵法产抗癌药物喜树碱及新型抗癌抗菌药物进行探索研究。从安徽合肥、宣城和黄山等地采集喜树的根、枝、叶、果实、树皮,分离获得197株内生真菌。并利用薄层层析（TLC）方法对197株内生真菌的液体发酵培养物进行了初筛,选筛出13株可产喜树碱或其类似物的菌株。再通过高效液相色谱（HPLC）对其作了进一步分析,发现有1株内生真菌菌株发酵代谢物的吸收峰与喜树碱标准品吸收峰保留时间一致,此菌株编号为LR051。通过液体培养基组成成分的正交试验,以喜树碱含量为指标,比较不同的营养性因素包括碳氮源、无机盐及非营养因素温度对喜树碱产量的影响。最终筛选出LR051菌株的最适液体培养基的组成为:葡萄糖2%、马铃薯20%、蛋白胨0.5%、MgSO4·7H2O 0.2%、CaCl20.1%、MnSO4·H2O 0.006%。通过比较不同提取方法的提取处理及相关理化试验,确定了活性物质的最佳的提取工艺为:47℃条件下浓缩发酵液至原体积的1/5,加3倍体积95%乙醇（乙醇终浓度为70%）醇沉,除去沉淀并脱醇后,以氯仿为萃取剂,按2:1的体积比分两次萃取,合并脂溶相,浓缩至原脂溶相体积的1/10,即得到喜树碱活性物质的粗提品。喜树碱活性物质的粗提品经过硅胶柱分离纯化后结合TLC技术与HPLC-MS技术得到喜树碱纯品,该化合物的分子式为C20H16N2O4,分子量为348,名称为4-乙基-4-羟基-1H-吡喃[3′,4′:6,7]氮茚[1,2]喹啉-3,14（4H,12H）-二酮。在197株供试菌株中,共有46株对CHO细胞有抑制作用,占总供试菌株的23.4%,从树皮中分离出的内生真菌具有抗肿瘤活性的比例最高,达到45.0%;枝次之,为40.6%;而叶最低仍可达到8.7%。不同地理来源所采集分离的菌株,其代谢产物抗肿瘤活性存在着显着差异,表现为安徽黄山采集分离的菌株抗肿瘤活性菌株所占比例最高,达到42.9%,安徽宣城次之为35.6%,安徽合肥最低仅为25.9%。得自黄山采集地的一株菌株LR126对CHO细胞的抑制率超过了50%,对宫颈癌Hela细胞系抑制率超过了90%,此菌株从喜树果实中分离。因该活性菌株在培养基上无明显产孢结构,故采用分子分类法鉴定其种类。经测序发现该菌株（Accession numbers是EU250374）与GenBank数据库所登陆的Rhizopycnis vagum的ITS区相似率为95%,故可初步判断该菌株为根盘菌属（Rhizopycnis sp.）真菌。抗肿瘤实验结果中,选取20株细胞毒性较高的菌株进一步进行抗菌实验,期待从中选出一株在抗肿瘤和抗菌两方面都表现出优良特性的菌株,同时探索菌株在抗肿瘤和抗菌活性高低方面是否存在相关性。分析实验结果可以发现,35.0%的菌株对供试的四种靶标菌的生长同时具有抑制作用。这表明:喜树内生真菌代谢产物是筛选生物活性物质的一个很好的来源。菌株LR004液体发酵产物具有较高的抗菌活性,对小麦纹枯、油菜菌核、辣椒疫霉、苹果炭疽四种指示菌的生长抑制明显优于其它菌株。稳定性测试的结果显示:LR004菌株热稳定性、光稳定性和贮藏稳定性较好,而pH稳定性稍差。
李梦南[5]（2008）在《热处理废弃重组质粒DNA的有效性与安全性分析》文中认为随着现代生物技术,特别是基因工程技术的高速发展,其对生态环境与人民健康可能造成的危害越来越引起人们的重视。生物实验室产生的废弃重组DNA片段的排放是造成重组DNA向自然界扩散的途径之一,并有可能导致“基因污染”,为此生物实验室含重组DNA片段的废弃物一般需经预处理后排放。热处理是目前生物实验室处置废弃重组DNA片段、核酸等物质的主要手段。本文以pET-28b质粒为材料,采用定量PCR技术结合电泳和质粒转化等手段研究了重组DNA片段在热处理过程中的降解与失活规律及其影响因素,考察和分析了热处理（热变性）的重组质粒DNA在模拟水环境中的降解速率以及潜在的环境风险。研究结果将可初步确定热处理废弃重组DNA的有效性和安全性,并为今后建立系统的废弃重组DNA生态风险评价技术和标准提供参考价值和技术支撑。实验结果显示,热处理过程中,由于高温和煮沸过程中剪切力的作用,pET-28b质粒DNA会发生解链和断裂,其降解半衰期约为2.7～4min,但30min后仍存在一级结构完整的质粒且仍具有3%～5%的转化活性。这表明热处理并不能彻底降解、破坏重组DNA片段,而主要使其解链变性。酸性条件能加速热处理过程中质粒DNA的降解,但环境中的离子强度、牛血清白蛋白（BSA）浓度、EDTA浓度都对热处理过程中的质粒DNA具有一定的保护作用,使其在热处理过程中的降解速率得到减缓,其中EDTA对热处理过程中质粒DNA的保护作用最强。由于生物实验室废水中通常含有上述有机或无机物质,因此实际热处理过程中质粒DNA的降解半衰期可能远长于2.7～4min,这一点必须引起我们高度关注。研究发现,热变性的质粒DNA经过复性可在一定程度上恢复其转化活性,在一定范围内温度越高越利于热变性质粒的复性。因此热处理（变性）的质粒DNA进入生态系统后如不能在短时问内被彻底降解,理论上存在着复性并恢复转移活性的可能。然而研究发现进入水环境的热处理（变性）重组DNA在短时间内并不能被彻底降解。pH对热处理（变性）的质粒DNA在水环境中的降解有一定的影响,在pH值为5、6、9的情况下,经过55min的降解,便无法从水中检测到一级结构完整的质粒DNA的存在,其中pH为9时,热处理（变性）重组DNA在水环境中的降解速度最快。pH值为7和8时,水环境中的热处理（变性）质粒DNA降解速率相对较慢,到1.6h后才无法检测到一级结构完整的质粒DNA的存在。水环境中的离子强度对热处理（变性）质粒DNA有一定的保护作用,而且这种作用是随着离子强度的提高而增强。当水环境中NaCl浓度达到0.5%时,2.2h之后仍然能在定量PCR中检测到一级结构完整的质粒DNA。研究结果表明目前常用的废弃重组DNA沸水热处理手段难以彻底降解、破坏重组质粒DNA的一级结构（主要使质粒DNA变性）,并仍具有一定的转化活性。热变性的质粒DNA一定时间后能恢复生物活性,而且热处理后的重组质粒DNA进入水环境后在短时间内并未被彻底降解,因此这些热处理（变性）的重组DNA一旦进入生态系统后,理论上有足够的时间复性并可能发生基因转移,所以该热处理方法存在一定的安全隐患。有关进入水环境中的热变性重组DNA的复性与转移的验证工作正在进行之中。
闫广谋[6]（2007）在《布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△YZ-2的研究》文中研究说明当前布鲁氏菌疫苗种类繁多,但各有缺陷。比如不能区分人与动物是人工免疫接种还是野生菌感染,并且病毒强,返祖现象严重,甚至使接种的人与动物发病,而不能广泛应用,致使当前布鲁氏菌病趋年上升。本研究通过构建自杀质粒,采用定向同源重组的方法,用萤光素酶改造基因（Luc NF+）代替了布鲁氏菌弱毒疫苗YZ株Bp26基因部分片段,破坏了其免疫原性蛋白BP26表达,构建了布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△YZ-1。BMP18蛋白是布鲁氏菌主要的毒力因子之一。采用相同的方法剔除了△YZ-1的Bmp18基因,使其不表达Bmp18蛋白,构建成了布鲁氏菌毒力基因缺失突变株△YZ-2。用PCR的方法克隆出Bp26基因,使其在大肠杆菌中高效表达了His-BP26融合蛋白。用亲合层析纯化的His-BP26蛋白作为包被抗原,初步建立了用ELISA方法区分YZ与△YZ-2株接种的小鼠。用△YZ-2与YZ接种小鼠实验,通过分离小鼠脾脏的菌体数与临床症状比较,△YZ-2的毒力明显比YZ弱。
王小东[7]（2006）在《相思根瘤菌质粒的研究》文中研究说明本文研究了20株相思根瘤菌株对5种常见抗生素的抗性，并对它们的质粒分布进行了研究。在此基础上，运用接合转移的方法把质粒pMC73A从供体菌催娩克斯菌NG13引入受体菌相思根瘤菌MZ和AJ018中，并对接合子进行了结瘤试验、耐氨试验及固氮酶活性分析。结果显示： 1、参试的20株菌株对抗生素的抗性有明显的差异。绝大多数的菌株对Km、Sm敏感，其中YM2菌株对所有的抗生素都敏感，而菌株4-2对所有的抗生素都具有抗性，确定Tc为相思根瘤菌MZ、AJ018抗性筛选标记。 2、通过比较三种质粒检测的方法，确定了碱裂解法为相思根瘤菌的质粒快速检测方法。采用该方法对20株相思根瘤菌的质粒分布进行了检测，发现相思根瘤菌都只含有一个质粒，而菌株LR005没有检测到质粒。实验过程中，对质粒检测的条件进行了优化，确定相思根瘤菌质粒检测的菌液量为20ml。 3、运用接合转移的方法把质粒pMC73A从供体菌催娩克斯菌NG13引入受体菌相思根瘤菌MZ和AJ018中，接合频率都为10-8数量级。对接合子电泳检测表明，MZ接合子能检测到质粒pMC73A条带，而AJ018接合子未能检测出。接合子的质粒稳定性研究显示，质粒在宿主菌中具有一定的稳定性。 4、对34株接合子菌株进行结瘤实验。结果显示，所有的接合子菌株都能在马占相思的根部形成根瘤。筛选出6株结瘤能力高于野生型相思根瘤菌的菌株：MZ1、MZ2、MZ4、MZ12、AJ7、AJ9。 5、通过结瘤实验，筛选出了6个相思根瘤菌接合子，即菌株MZ1、MZ2、MZ4、MZ12、AJ7、AJ9。这6个相思根瘤菌接合子的耐氨实验和固氮酶活性研究表明：所有的菌株在（NH4）2SO4浓度为100mmolL-1、300mmolL-1、500mmolL-1的液体培养基中都能较好的生长，但各菌株在10mmolL-1（NH4）2SO4条件下不能正常固氮，不过仍具有一定的固氮能力，其固氮酶活性值(nmolml-1h-1)为：MZ1：31.231；MZ2：30.289；MZ4：29.632；MZ12：23.113；AJ7：25.328；AJ9：24.982。这表明，通过接合转移相思根瘤菌已经获得了一定的耐氨固氮能力。
解志红[8]（2005）在《斯氏假单胞菌固氮调节基因nifLA的表达调控机制研究》文中认为斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501分离自非豆科作物水稻根际,在无铵和微好氧的条件下能将空气中氮气固定为植物可以吸收利用的铵,是一种潜在的微生物肥料,具有重要的理论研究和实际应用价值。本研究采用基因敲除、酵母双杂交系统及蛋白体外结合技术,对斯氏假单胞菌A1501固氮调节基因nifLA进行了功能鉴定和表达调控机制的研究。 构建了斯氏假单胞菌A1501的粘粒基因组文库,筛选到两个阳性克隆,分别为XL1,XL2。然后以pUC19为载体,从中筛选到7.7Kb包含nifLA-like的阳性克隆,并完成了核苷酸序列分析（EMBL/GenBank登陆号为:AJ297529）。遗传学分析表明该菌nifL-like及nifA-like与棕色固氮菌（A.vinelandii）在核苷酸序列上的同源性分别为78%、85%,在氨基酸序列上的同源性分别为72%、82%,暂分别命名为nifA及nifL。利用Southern杂交证实nifL在P.stutzeri A1501中为单拷贝。 将nifHp-lacZ融合基因表达载体转入A1501野生性菌株中,在不同的铵和氧浓度诱导后测定其β—半乳糖苷酶活性,结果表明斯氏假单胞菌A1501的固氮基因表达受铵和氧的调控。为了研究nifLA的固氮调节功能,构建了nifL及nifA突变株及其互补质粒。结果显示nifA突变株及nifL极性突变株的固氮酶活性丧失;nifL非极性突变株仍有部分固氮活性,且对铵和氧不敏感,在高铵下,仍有一定的固氮活性。nifA的组成性表达质粒pVA3仅恢复nifA突变株的三分之一的固氮活性,增强了A1501及nifL非极性突变株的固氮活性。而nifL的组成性表达质粒pVL抑制了A1501及nifL非极性突变株中固氮酶的表达。过量表达的NifA增强了nifHp-lacZ的表达,而过量表达的NifL对nifHp-lacZ的表达没有大的影响,表明在A1501中存在固氮正调节蛋白NifA和负调节因子NifL。 采用酵母双杂交系统研究NifL和NifA蛋白在表达调控中的相互作用。构建了nifL和nifA全长序列及其不同结构域区段的酵母双杂交质粒。酵母双杂交实验证明NifA的中间结构域与NifL的羧基端之间在酵母体内存在直接的相互作用。构建了pET28a-nifL及pGEX2T-nifA融合表达载体。利用体外沉降方法证实NifL与NifA在细胞外也可以结合,表明斯氏假单胞菌A1501中可能存在一个通过NifL与NifA相互作用关闭nif基因表达的调控机制。 构建了A1501 nifLAp-lacZ融合表达载体,分别将其转入A1501野生型及ropN-和ntrC-突变菌株中。β半乳糖苷酶活性的测定结果表明,nifLA基因的启动子为σ54-依赖型,nifLA正常水平的表达需要σ54因子及NtrC的参与。 在上述研究的基础上,初步提出了P.stutzeri固氮基因转录调控模式,即固氮负调节因子NifL感受外界氮和氧的信号,与固氮正调节因子NifA互作,控制nif基因系统的表达。这将为今后采用基因工程手段打破联合固氮的氧和铵限制,获得稳定高效的联合固氮效率奠定重要的理论基础。
燕永亮[9]（2005）在《斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501的基因组学研究》文中指出斯氏假单胞菌A1501是我国科学家于1980年自稻田分离到的一种联合固氮菌。该菌在微好氧状态下具有明显的固氮活性,而且固氮产物能够迅速被水稻直接吸收利用。20多年来,我国科学家对该菌进行了系统的研究,在深入了解该菌固氮活性的基础上,进行了菌种的改造开发,以该菌为出发菌株的耐铵固氮工程菌是我国第一例进入商品化生产阶段的植物用基因工程固氮菌。 为了更好的开发和利用该菌株,我们对该菌进行了基因组学研究,采用全基因组“shotgun”的方法,并在实际造作中进行了技术改进。我们构建了插入片段分别为2-4K（s文库）和4-6K（L文库）的基因组随机文库。对L文库进行两端测序,打造基因组的框架,对S文库进行单向测序,填充框架内信息。通过大规模、高通量的测序平台,我们最终获得了50408个有效reads,平均有效长度为609bp,总长度30.7M。经过几轮补GAP反应、计算机拼接以及低质量区域核实,最终得到A1501的基因组精确图。 斯氏假单胞菌A1501的基因组全长4567418 bp,编码4145个ORFs。与已经完成基因组测定的三个假单胞菌P.aeruginosa PA01、P:putida KT2440和P.syringae pv.tomato DC3000相比,其基因组长度以及编码ORFs的数量只是其他三株的73%左右,但是编码区占基因组的比例相差不大。蛋白同源性比较表明,A1501菌的4145个ORFs中有2734个可以在Pseudomonas putidaKT2440中找到对应的同源蛋白;有2560个ORFs可以在Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000中找到对应的同源蛋白;有2954个ORFs可以在Pseudomonas aeruginosa PA01中找到对应的同源蛋白。2085个ORFs在这四株假单胞菌基因组里是共有的。 基因根据其已知的功能或与已知功能基因的同源性,可以划分为三类:1,与其他生物中己知功能的基因具有同源性;2,与已报导的未知功能的基因同源;3,与所有已报导基因没有同源性。在A1501中,第一类基因有3366个,占ORFs总数的81.2%;第二类基因有473个,占ORFs总数的11.4%;第三类基因,即A1501基因组独特的ORFs有316个,占ORFs总数的7.6%。 将这些ORFs按照COGs库进行分类,划分为23个功能组以及未知功能组和假设功能组,共25个组。每个功能组的基因在该菌的生命活动中起不同的作用。对这些基因的初步分析表明,在长期的进化过程中,A1501菌形成了一套与自身环境高度适应的系统。如:厌氧状态下,该菌可以以硝酸盐或亚硝酸盐为底物进行反硝化作用,产生能量;具有鞭毛结构,可以自由运动并在趋化剂的诱导下到达植物的根部,获得碳源;具有Ⅳ型菌毛结构,可以特异性粘附在植物的根表甚至进入根组织,从而与植物保持长期稳定的共生关系。 斯氏假单胞菌A1501基因组的完成是该菌研究过程中的一个突破,是国际上第一例完成的联合固氮菌的基因组,对于我们从整体上全面认识联合固氮菌的遗传背景、代谢网络以及固氮机制提供了最全面、最原始的基础数据,为进一步开展功能基因组学,蛋白质组学等相关研究奠定了坚实的基础。
管乐[10]（2003）在《巴西固氮螺菌Sp7中与NifA有相互作用的因子的筛选和功能分析》文中研究指明在巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）Sp7中，NifA蛋白是固氮基因（nifgene）的转录激活蛋白，筛选和鉴定与其有相互作用的因子是研究NifA蛋白的一个途径。首先，将A．brasilense Sp7的nifA全序列构建在pGBD-C2载体上，得到重组质粒pGBD-nifA，以其为诱饵，筛选Sp7质粒基因组文库（构建在pGAD系列质粒上）。诱饵质粒和文库质粒共转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）PJ69-4A，通过检测报告基因his3、ade2及lacZ的表达进行筛选，初筛得到109个阳性酵母菌落。分别对其中的AD/library质粒进行分离纯化，将每个纯化质粒再次与诱饵质粒共转化酵母PJ69-4A进行验证，得到11个阳性克隆，测序结果显示其中有4个不同的基因片段，分别命名为S4、S35、S64和S65。对这4个片段进行核苷酸序列和蛋白序列的同源性比对，发现它们与一些功能保守的结构域具有同源性。为了进一步验证这些克隆的编码产物与NifA蛋白的相互作用，将它们与nifA基因互换载体后共转化酵母，仍然可以激活三个报告基因的表达，而阳性克隆移码表达的重组质粒和pGBD-nifA的共转化物则不能在选择性平板上生长。 用单交换的方法构建部分二倍体突变株，对阳性因子进行功能分析。通过抗性平板筛选，及接合子的PCR鉴定，得到了相应的突变株，以Sp7野生型为对照，测定了突变株在不同的铵浓度下的固氮酶活，发现它们与野生型存在一定差异，推测这些阳性因子可能参与固氮调控的信号传导，但它的具体功能及与NifA蛋白的作用方式有待进一步的研究。
二、I 根瘤菌的遗传改造及其应用 II DNA超螺旋对nif基因表达的调节作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、I 根瘤菌的遗传改造及其应用 II DNA超螺旋对nif基因表达的调节作用（论文提纲范文）
（1）胡萝卜软腐果胶杆菌苎麻脱胶增效的关键酶及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 苎麻韧皮及结构成分 |
| 1.2 苎麻韧皮脱胶研究进展 |
| 1.3 苎麻生物脱胶关键酶研究进展 |
| 1.4 苎麻脱胶菌株研究进展 |
| 1.5 本文研究意义及主要内容 |
| 2 P.carotovorum HG-49 苎麻脱胶增效的关键酶高效表达、酶特性及其应用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 P.carotovorum HG-49 内源关键酶的筛选及其与HG-49 联合脱胶性能评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 P.carotovorum HG-49 内源葡甘聚糖酶Cel5M的酶特性分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 葡甘聚糖酶Cel5M的同源表达工程菌构建及应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间完成论文和专利情况 |
（2）炭基肥与化肥配施对水稻产量和土壤养分的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 研究背景、目的和意义 |
| 1.2 炭基肥对水稻产量和土壤的影响 |
| 1.2.1 炭基肥对水稻产量的影响 |
| 1.2.2 炭基肥对土壤养分的影响 |
| 1.3 化肥减施对水稻产量和土壤养分的影响 |
| 1.3.1 化肥减施对水稻产量的影响 |
| 1.3.2 化肥减施对土壤养分的影响 |
| 1.4 紫云英还田对水稻产量和土壤养分的影响 |
| 1.4.1 紫云英还田对水稻产量的影响 |
| 1.4.2 紫云英还田对土壤养分的影响 |
| 1.5 研究内容和技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验地介绍 |
| 2.2 实验设计与田间管理 |
| 2.2.1 紫云英种植与利用 |
| 2.2.2 炭基肥施用 |
| 2.2.3 化肥施用量 |
| 2.2.4 田间管理 |
| 2.3 测定指标与方法 |
| 2.3.1 水稻产量及产量构成 |
| 2.3.2 水稻茎蘖动态 |
| 2.3.3 水稻各生育时期干物质的测定 |
| 2.3.4 水稻各生育时期氮磷钾含量的测定 |
| 2.3.5 土壤氮磷钾含量的测定 |
| 2.4 数据统计与分析 |
| 3 炭基肥与化肥配施对水稻生长和产量的影响 |
| 3.1 炭基肥与化肥配施对水稻产量的影响 |
| 3.2 炭基肥与化肥配施对水稻产量构成因素的影响 |
| 3.3 炭基肥与化肥配施对水稻茎蘖动态的影响 |
| 3.4 炭基肥与化肥配施对水稻干物质的影响 |
| 3.5 炭基肥与化肥配施对水稻养分吸收的影响 |
| 3.5.1 炭基肥与化肥配施对植株氮素的影响 |
| 3.5.2 炭基肥与化肥配施对植株磷素的影响 |
| 3.5.3 炭基肥与化肥配施对植株钾素的影响 |
| 4 炭基肥与化肥配施对土壤理化性状的影响 |
| 4.1 炭基肥与化肥配施对土壤容重的影响 |
| 4.2 炭基肥与化肥配施对土壤养分的影响 |
| 4.2.2 炭基肥与化肥配施对土壤有机质的影响 |
| 4.2.3 炭基肥与化肥配施对土壤氮素的影响 |
| 4.2.4 炭基肥与化肥配施对土壤有效磷的影响 |
| 4.2.5 炭基肥与化肥配施对土壤速效钾的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 炭基肥与化肥配施对水稻产量的影响 |
| 5.2 炭基肥与化肥配施对水稻干物质的影响 |
| 5.3 炭基肥与化肥配施对水稻养分吸收的影响 |
| 5.4 炭基肥与化肥配施对土壤养分的影响 |
| 6 结论、创新与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）嗜酸性喜温硫杆菌启动子的筛选和性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 生物冶金 |
| 1.1.1 生物冶金技术简介 |
| 1.1.2 生物冶金中的微生物 |
| 1.1.3 喜温硫杆菌主要代谢途径简介 |
| 1.1.3.1 碳代谢途径的简单分析 |
| 1.1.3.2 氮代谢途径的简单分析 |
| 1.1.3.3 硫代谢途径的简单分析 |
| 1.2 细菌启动子研究方法 |
| 1.2.1 启动子概述 |
| 1.2.2 启动子识别方法简介 |
| 1.2.2.1 基于结构特征进行的细菌启动子识别 |
| 1.2.2.2 基于启动子在基因组中的分布特征进行启动子识别 |
| 1.2.2.3 基于计算机建模的启动子识别方法 |
| 1.2.2.4 基于RNA聚合酶的特殊亚基进行启动子识别 |
| 1.2.3 启动子克隆的方法 |
| 1.2.3.1 启动子探测质粒载体筛选启动子 |
| 1.2.3.2 利用PCR技术克隆启动子 |
| 1.2.4 启动子研究方法 |
| 1.2.5 硫杆菌启动子的研究现状 |
| 1.3 本论文的研究内容及意义 |
| 1.3.1 本论文主要研究内容 |
| 1.3.2 本论文的的理论及应用价值 |
| 第二章 A.caldus MTH-04基因启动子预测及序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 生物信息学软件 |
| 2.3 A.caldus MTH-04各代谢途径基因启动子预测及序列分析 |
| 2.3.1 碳代谢基因启动子预测 |
| 2.3.2 氮代谢基因启动子预测 |
| 2.3.3 硫代谢基因启动子预测 |
| 2.3.4 其它基因启动子预测及序列分析 |
| 2.4 A. caldus MTH-04各代谢途径基因启动子序列的特征分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 A. caldus MTH-04基因启动子探测质粒构建及启动子活性检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 培养基和培养条件 |
| 3.2.2.1 LB培养基 |
| 3.2.2.2 抗生素使用浓度 |
| 3.2.2.3 培养条件 |
| 3.2.3 试剂和仪器 |
| 3.2.3.1 试剂 |
| 3.2.3.2 仪器 |
| 3.2.4 分子生物学实验 |
| 3.2.4.1 PCR扩增反应 |
| 3.2.4.2 DNA片段纯化 |
| 3.2.4.3 DNA片段的切胶回收 |
| 3.2.4.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.4.5 细菌基因组的提取 |
| 3.2.4.6 质粒的提取与纯化 |
| 3.2.4.7 限制性内切酶的酶切反应 |
| 3.2.4.8 连接酶的连接反应 |
| 3.2.4.9 E.coli感受态细胞的制备 |
| 3.2.4.10 质粒的转化 |
| 3.2.4.11 超声波破碎细胞 |
| 3.2.4.12 蛋白质含量测定 |
| 3.2.4.13 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 3.2.4.14 GusA蛋白的酶活测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 启动子探测质粒的构建 |
| 3.3.2 Ptac启动子重组质粒的构建 |
| 3.3.3 各启动子在E.coli DH5α中的活性检测 |
| 3.4 各基因启动子活性与他们在硫代谢途径中的作用的初步分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 mRNA表达水平与比活结果的相关性验证 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 培养基与培养条件 |
| 4.2.3 试剂与仪器 |
| 4.2.3.1 试剂 |
| 4.2.3.2 仪器 |
| 4.2.4 E.coli中总RNA的提取 |
| 4.2.5 RNA质量评价 |
| 4.2.6 RNA完整性检测 |
| 4.2.7 去除样品中残留的基因组DNA |
| 4.2.8 反转录合成cDNA |
| 4.2.9 定量PCR |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 pET-28a-gusA质粒的构建 |
| 4.3.2 GusA的诱导表达 |
| 4.3.3 RNA样品的检测 |
| 4.3.4 RT-PCR |
| 4.3.4.1 RT-PCR引物设计 |
| 4.3.4.2 RT-PCR结果 |
| 4.3.5 比活与mRNA表达水平相关性分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 启动子在A.caldus MTH-04中的活性检测与分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 培养基与培养条件 |
| 5.2.3 试剂与仪器 |
| 5.2.4 A.caldus总RNA的提取及质量检测 |
| 5.2.5 大肠杆菌和喜温硫杆菌的接合转移 |
| 5.2.5.1 大肠杆菌和喜温硫杆菌的接合 |
| 5.2.5.2 接合转移子的鉴定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 pSDU1-Pxxxx+gusA的构建 |
| 5.3.2 接合后的筛选验证 |
| 5.3.3 RNA样品检测 |
| 5.3.4 RT-PCR |
| 5.3.4.1 RT-PCR引物设计 |
| 5.3.4.2 RT-PCR结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）喜树内生真菌产喜树碱及生物活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 内生真菌分离结果 |
| 4.1.1 不同部位内生真菌的分离 |
| 4.1.2 不同地理来源内生真菌的分离 |
| 4.2 喜树碱产生菌的筛选 |
| 4.2.1 内生真菌的液体培养及代谢产物的提取 |
| 4.2.2 利用薄层分析(TLC)进行产物的初步分析 |
| 4.2.3 利用高效液相色谱法分析(HPLC)作进一步分析 |
| 4.3 LR051菌株发酵条件的研究 |
| 4.3.1 营养性因素对LR051菌株产喜树碱量的影响 |
| 4.3.2 培养基优化前后对喜树碱产生的影响 |
| 4.4 代谢产物喜树碱的提取工艺 |
| 4.4.1 菌丝体与大分子杂质的去除 |
| 4.4.2 最佳萃取试剂的选择 |
| 4.4.3 最佳萃取体积比的选择 |
| 4.4.4 最佳萃取次数的确定 |
| 4.4.5 LR051代谢产物喜树碱的最佳提取方案流程 |
| 4.5 LR051代谢产物的分离纯化 |
| 4.5.1 30 L发酵罐生产 |
| 4.5.2 喜树碱粗样硅胶柱层析 |
| 4.5.3 喜树碱样品纯度的鉴定 |
| 4.6 细胞毒性实验方法的优化 |
| 4.6.1 不同细胞浓度对喜树碱抗肿瘤活性的影响 |
| 4.6.2 不同作用时间对喜树碱抗肿瘤活性的影响 |
| 4.7 以抗肿瘤活性为指标的菌株筛选 |
| 4.7.1 活性菌株的初筛实验 |
| 4.7.2 活性菌株的复筛实验 |
| 4.7.3 复筛后的菌株对Hela细胞作用实验 |
| 4.7.4 高抗肿瘤活性菌株LR126的分类鉴定 |
| 4.8 以抗菌活性为指标的菌株筛选 |
| 4.8.1 20株内生真菌对小麦纹枯的生长抑制 |
| 4.8.2 7株内生真菌对四种病原真菌的生长抑制 |
| 4.8.3 活性菌株LR004对植物病原菌油菜菌核的菌丝生长抑制 |
| 4.8.4 活性菌株LR004稳定性测试 |
| 讨论 |
| 1、药用植物喜树的选择 |
| 2、内生真菌分离培养以及菌株鉴定中存在的问题 |
| 3、喜树内生真菌与喜树碱 |
| 4、提高内生真菌产喜树碱产量的途径 |
| 5、菌株LR051代谢产物中喜树碱的提取工艺 |
| 6、菌株LR051代谢产物中喜树碱的分离纯化鉴定 |
| 7、细胞毒性试验方法 |
| 8、抗肿瘤实验 |
| 9、抑菌实验 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文目录 |
（5）热处理废弃重组质粒DNA的有效性与安全性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 现代生物技术带来的环境问题及其研究现状 |
| 1.1.1 基因重组生物的安全性 |
| 1.1.1.1 重组基因安全问题的提出与发展 |
| 1.1.1.2 基因重组生物的生态风险与研究现状 |
| 1.1.2 生物实验室安全性问题 |
| 1.1.2.1 生物实验室废弃污染物类型与排放现状 |
| 1.1.2.2 国内外有关生物技术安全保障的法律法规 |
| 1.1.2.3 生物实验室废弃重组DNA片段的处理处置及存在的问题 |
| 1.2 研究背景、意义以及研究内容和技术路线 |
| 1.2.1 研究背景与意义 |
| 1.2.2 研究内容 |
| 1.2.3 技术路线 |
| 1.2.4 课题来源 |
| 第2章 热处理过程中质粒DNA的降解/变性规律 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 质粒DNA制备 |
| 2.2.2.2 质粒DNA热变性时间梯度处理 |
| 2.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.2.4 荧光定量PCR检测 |
| 2.2.2.5 质粒DNA转化效率检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 热处理过程中质粒DNA结构的时间变化规律 |
| 2.3.2 热处理过程中质粒DNA残留转化活性的时间变化规律 |
| 2.3.3 热处理过程中质粒DNA的降解速率与降解半衰期 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 热处理过程中质粒DNA降解/变性的环境影响因素 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 pH梯度热处理 |
| 3.2.2.2 NaCl梯度热处理 |
| 3.2.2.3 BSA梯度热处理 |
| 3.2.2.4 EDTA梯度热处理 |
| 3.2.2.5 质粒转化与定量PCR检测 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 pH对质粒DNA热处理的影响 |
| 3.3.2 NaCl对质粒DNA热解过程的影响 |
| 3.3.3 BSA对质粒DNA热解的影响 |
| 3.3.4 EDTA对质粒DNA热解的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 热处理重组质粒DNA的复性及其在模拟水环境中的降解 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 质粒DNA的温度梯度复性 |
| 4.2.2.2 模拟水环境的建立 |
| 4.2.2.3 水环境中热变性质粒DNA降解效率分析 |
| 4.2.2.4 质粒DNA的定量PCR检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 热处理质粒DNA的复性效率 |
| 4.3.2 热变性质粒DNA在不同pH水环境中的降解与残留时间 |
| 4.3.3 水环境中的离子强度对热变性质粒降解的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论与建议 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△YZ-2的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 布鲁氏菌疫苗研究的进展 |
| 第二章 布鲁氏菌免疫分子与其分子遗传物质的研究进展 |
| 第三章 布鲁氏菌诊断技术的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 同源重组载体pBLs 与pBBs 的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 布鲁氏菌Bp26 与Bmp18 基因缺失株的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 布鲁氏菌BP26 蛋白基因的克隆、表达及纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 布鲁氏菌 YZ 与△YZ-2 鉴别诊断方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 △YZ-2 毒力的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师与作者简介 |
（7）相思根瘤菌质粒的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 生物固氮的研究 |
| 1.1 生物固氮研究的重要意义 |
| 1.2 固氮微生物的种类和特点 |
| 1.3 国际生物固氮研究发展概况 |
| 1.4 我国生物固氮研究的状况 |
| 2 根瘤菌质粒的研究 |
| 2.1 根瘤菌质粒的提取和检测 |
| 2.2 根瘤菌质粒与基因重排有关的遗传单位 |
| 2.3 根瘤菌质粒的稳定性 |
| 2.4 根瘤菌质粒的可转移性 |
| 3 相思根瘤菌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 相思根瘤菌抗生素抗性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 菌株纯化 |
| 2.2.2 菌株活化 |
| 2.2.3 根瘤菌抗生素抗性多样性研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株在固体培养基上的生长分析 |
| 3.2 菌株在液体培养基中的生长分析 |
| 3.3 菌株对各种抗菌素的抗性范围的确定 |
| 3.4 MZ和AJ018抗性筛选标志的确定 |
| 4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 根瘤菌质粒快速检测 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 根瘤菌质粒的快速检测 |
| 2.2.1 SDS凝胶裂解法 |
| 2.2.2 修改的Ecarkhard法 |
| 2.2.3 碱裂解法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 质粒的快速检测 |
| 3.2 相思根瘤菌的质粒分布 |
| 4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 相思根瘤菌的接合实验 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 双亲本接合实验 |
| 2.2.2 接合子的电泳检测 |
| 2.2.3 接合子的稳定性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 接合实验 |
| 3.2 接合子的电泳检测 |
| 3.3 接合子的稳定性 |
| 4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 相思根瘤菌接合子菌株结瘤研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 相思根瘤菌的耐氨实验及固氮酶活性的测定 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 根瘤菌固氮酶活性测定 |
| 2.2.2 耐氨实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 相思根瘤菌的耐氨实验 |
| 3.2 相思根瘤菌固氮酶活性研究 |
| 4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）斯氏假单胞菌固氮调节基因nifLA的表达调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 固氮基因表达调节机理的研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 Klebsiella pneumoniae (K.p)固氮调节的分子机制 |
| 2.1 固氮基因簇(nifcluster)的结构与功能 |
| 2.2 固氮酶结构基因(nifHDK)操纵子的表达 |
| 2.3 NifA正调节蛋白与NifL负调节蛋白之间的相互作用 |
| 3 Azotobacter vinelandii (A.v)固氮调节的分子机制 |
| 3.1 固氮基因簇的结构与功能 |
| 3.2 固氮酶结构基因(nifHDK)的表达调节 |
| 3.3 调节基因(nifLA)的表达调节 |
| 3.4 NifA和NifL相互作用 |
| 4 Azospirillum brasilense (A.b)固氮调节的分子机制 |
| 4.1 固氮基因簇的定位、结构与功能 |
| 4.2 固氮酶结构基因(nifHDK)的表达调节 |
| 4.3 正调节基因组成型表达 |
| 4.4 NifA的激活——P_Ⅱ蛋白的作用 |
| 4.5 固氮酶活性的调节—DraT-DraG调节系统 |
| 5 不同种属固氮菌的NifL-NifA固氮调控机理的比较 |
| 5.1 NifL结构域 |
| 5.2 配基结合对NifL-NifA互作的影响 |
| 5.3 固氮酶的表达调控 |
| 5.4 NifL感应氧的调控机制 |
| 5.5 NifL与NifA动态定位 |
| 5.6 NifL抑制固氮酶的机制 |
| 5.7 固氮菌中NifL-NifA复合物调控小结 |
| 6 本论文的立题依据 |
| 第二章 固氮调节基因nifLA的克隆及序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基与抗生素 |
| 1.3 酶、试剂及试剂盒 |
| 1.4 β-半乳糖苷酶活性分析试剂 |
| 1.5 克隆nifL及nifA所用的引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 A1501菌株基因组DNA的分离 |
| 2.2 A1501基因组DNA的部分酶切 |
| 2.3 质粒载体的制备 |
| 2.4 基因组DNA部分酶切片段与去磷酸化质粒pLA2917的连接 |
| 2.5 噬菌体蛋白包装连接产物 |
| 2.6 包装体转染大肠杆菌 |
| 2.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) |
| 2.8 PCR产物的纯化 |
| 2.9 酶切及连接反应(Sambrook et al., 1989) |
| 2.10 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收 |
| 2.11 Southern杂交 |
| 2.12 高效率转化感受态细胞的制备、转化 |
| 2.13 菌株固氮活性测定 |
| 2.14 乙烯的标定 |
| 2.15 β-半乳糖苷酶活性分析 |
| 2.16 总蛋白的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 铵和氧对斯氏假单胞菌A1501固氮酶活性的影响 |
| 3.2 铵和氧对固氮结构基因nifH表达的影响 |
| 3.3 斯氏假单胞菌A1501粘粒文库的构建 |
| 3.4 菌落PCR筛选阳性菌株 |
| 3.5 Southern杂交验证阳性菌株 |
| 3.6 nifLA-like的亚克隆 |
| 3.7 固氮菌nifL及nifA的聚类分析 |
| 3.8 固氮调节基因nifLA的序列分析 |
| 3.9 nifL基因拷贝数的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DNA文库构建 |
| 4.2 基因拷贝数的鉴定 |
| 4.3 斯氏假单胞菌A1501中不存在大质粒 |
| 第三章 固氮调节基因nifL和nifA的功能研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 酶、试剂和试剂盒 |
| 1.3 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌总RNA的提取 |
| 2.2 第一链cDNA的合成 |
| 2.3 其它的实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 固氮调节基因nifL极性与非极性突变株的构建 |
| 3.2 nifA突变株和nifL突变株的固氮表型 |
| 3.3 RT-PCR验证nifL突变株中NifA的表达 |
| 3.4 nifA组成性表达质粒pVA3的构建 |
| 3.5 重组质粒pVA3对A1501野生型及突变株固氮酶活性的影响 |
| 3.6 nifL组成性表达质粒pVL的构建 |
| 3.7 重组质粒pVL对A1501突变株及野生型固氮酶活性的影响 |
| 3.8 过量表达的NifA及NifL蛋白对固氮酶转录活性的影响 |
| 3.9 不同转录因子对固氮酶表达活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 P. stutzeri A1501中是否存在DraT-DraG调节系统 |
| 4.2 利用RT-PCR鉴定基因的转录 |
| 第四章 利用酵母双杂交系统研究NifA与NifL的互作 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 酵母培养基 |
| 1.3 酵母转化用溶液及缓冲液 |
| 1.4 其它的实验方法 |
| 1.5 引物 |
| 2 酵母双杂交系统的原理 |
| 3 方法 |
| 3.1 酵母感受态细胞的制备及转化 |
| 3.2 酵母质粒DNA的提取 |
| 3.3 β-半乳糖甘酶活性滤纸分析 |
| 3.4 β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)活性的测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 NifA，NifL及其不同结构域重组质粒的构建 |
| 4.2 NifL蛋白与NifA蛋白之间相互作用的研究 |
| 4.3 NifL蛋白与NifA蛋白之间作用区域的定位 |
| 4.4 NifL蛋白与NifA蛋白结构域 |
| 5 讨论 |
| 5.1 酵母双杂交系统已成为研究蛋白互作的重要手段 |
| 5.2 斯氏假单胞菌中存在一个NifL-NifA调控系统 |
| 第五章 NifL与NifA的体外互作 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液及缓冲液 |
| 1.3 酶，试剂及主要仪器 |
| 1.4 蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.5 纯化His-Tag融合蛋白的NTA缓冲液的配制 |
| 1.6 GST重组蛋白质亲和纯化(GSH-Sepharose)缓冲液的配制 |
| 1.7 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析 |
| 2.2 可溶性分析 |
| 2.3 发酵时间的优化 |
| 2.4 NifA-His融合蛋白的纯化 |
| 2.5 GST-NifLc融合蛋白的纯化 |
| 2.6 在谷胱甘肽层析柱中的细胞外蛋白结合实验 |
| 2.7 在NTA层析柱中细胞外蛋白结合实验 |
| 2.8 以T7·Tag Antibody AP Conjugate为抗体的蛋白杂交程序 |
| 2.9 以GST·Tag Antibody AP Conjugate为抗体的蛋白杂交程序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pET28a-NifA融合表达载体pETA的构建 |
| 3.2 pGEX2T-NifLc融合表达载体pGLc的构建 |
| 3.3 融合蛋白的诱导表达及发酵时间的优化 |
| 3.4 融合蛋白的可溶性分析 |
| 3.5 SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况及大量纯化 |
| 3.6 分别以T7·Tag抗体和GST·Tag抗体检测NifL与NifA在细胞外的结合 |
| 4 讨论 |
| 第六章 固氮斯氏假单胞菌nifLA基因表达的调控机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 酶、试剂和试剂盒 |
| 1.3 引物 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 nifLAp-lacZ融合表达载体的构建过程 |
| 3.2 固氮斯氏假单胞菌nifLA基因启动区的克隆 |
| 3.3 nifLA基因启动子片段克隆到pLA2917载体上 |
| 3.4 lacZ-Km盒克隆到nifLA启动子后的编码区 |
| 3.5 nifLAp-lacZ融合基因在野生型菌株及突变菌株中的表达 |
| 3.6 ONPG法定量测定结合子的β-半乳糖苷酶活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NifA是固氮菌的转录激活蛋白 |
| 4.2 nifLA调控不同固氮菌的异同 |
| 4.3 斯氏假单胞菌固氮基因的转录调控模式 |
| 第七章 结论 |
| 1 本论文的工作中得到的确定结果 |
| 2 本项研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1.A1501固氮调节基因nifLA的核苷酸序列及推断的开放读码框 |
| 附录2.斯氏假单胞菌nifLA基因启动子区 |
| 附录3.重组质粒pET28a-nifL的构建流程 |
| 附录4.pGAD-nifA，pGAD-nifL，pGAD-nifAm质粒构建图 |
| 附录5.重组质粒pGBD-nifA，pGBD-nifL和pGBD-nifLc的构建 |
| 个人简介 |
（9）斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501的基因组学研究（论文提纲范文）
| 第一章 论文综述 |
| 1.1 微生物基因组学研究现状 |
| 1.2 假单胞菌的基因组研究 |
| 1.3 斯氏假单胞菌A1501的研究现状 |
| 1.4 本研究的立题依据 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 斯氏假单胞菌A1501的基因组测定 |
| 3.2 基因组注释以及生物信息学分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 测序策略的选取 |
| 4.2 A1501菌的基因组注释 |
| 4.3 结语及下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（10）巴西固氮螺菌Sp7中与NifA有相互作用的因子的筛选和功能分析（论文提纲范文）
| 第一部分 固氮基因调控研究进展 |
| 1.1 导言 |
| 1.2 自生固氮菌固氮基因调控 |
| 1.3 根瘤菌固氮基因调控简述 |
| 1.4 联合固氮菌固氮基因调控 |
| 第二部分 酵母双杂合系统原理 |
| 2.1 酿酒酵母gal基因及GAL4蛋白 |
| 2.2 酵母双杂合系统原理 |
| 2.3 酿酒酵母PJ69-4A双杂合系统特点 |
| 第三部分 材料与方法 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 第四部分 实验结果和分析 |
| 4.1 巴西固氮螺菌Sp7质粒基因组文库的筛选及阳性验证 |
| 4.2 4个阳性克隆的初步功能分析 |
| 4.3 总结和讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、I 根瘤菌的遗传改造及其应用 II DNA超螺旋对nif基因表达的调节作用（论文参考文献）
- [1]胡萝卜软腐果胶杆菌苎麻脱胶增效的关键酶及应用研究[D]. 王亚伟. 华中科技大学, 2019(01)
- [2]炭基肥与化肥配施对水稻产量和土壤养分的影响[D]. 刘炜. 江西农业大学, 2019(03)
- [3]嗜酸性喜温硫杆菌启动子的筛选和性质研究[D]. 石世强. 山东大学, 2015(04)
- [4]喜树内生真菌产喜树碱及生物活性的研究[D]. 陆荣. 安徽农业大学, 2008(09)
- [5]热处理废弃重组质粒DNA的有效性与安全性分析[D]. 李梦南. 同济大学, 2008(07)
- [6]布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△YZ-2的研究[D]. 闫广谋. 吉林大学, 2007(02)
- [7]相思根瘤菌质粒的研究[D]. 王小东. 南昌大学, 2006(12)
- [8]斯氏假单胞菌固氮调节基因nifLA的表达调控机制研究[D]. 解志红. 中国农业大学, 2005(05)
- [9]斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501的基因组学研究[D]. 燕永亮. 中国农业大学, 2005(05)
- [10]巴西固氮螺菌Sp7中与NifA有相互作用的因子的筛选和功能分析[D]. 管乐. 中国农业大学, 2003(03)