一、肾细胞癌尿激酶型纤溶酶原激活物表达的研究（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中认为近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
方凌凌[2]（2021）在《LAMC1及PLAU调控微环境中CAF的活化及促进食管鳞癌进展的机制研究》文中指出食管癌发病率高,恶性程度高,预后差。其五年生存率约15%-25%。根据组织学类型:分为食管鳞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）和食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma,EAC）。食管鳞癌占食管癌90%以上,也是我国的特色癌症。其主要治疗方法是手术联合放化疗,但治疗后容易出现耐药、复发、转移,患者整体预后较差。因此,我们需要深入研究食管鳞癌发生发展机制,为其治疗提供新的研究基础。近年来,肿瘤微环境受到越来越多的重视,在促进肿瘤增殖、抑制肿瘤凋亡以及引起免疫逃逸等方面发挥着重要作用。肿瘤微环境主要由各种细胞,比如免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞,以及细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）、细胞因子等组成。细胞间可通过细胞因子相互作用。肿瘤相关成纤维细胞（Cancer associated fibroblast,CAF）作为肿瘤微环境的重要成分,可通过分泌细胞因子,重塑ECM、促血管形成、促肿瘤增殖、转移、复发等。在ESCC中,CAF分泌多种细胞因子,比如IL-6、CXCL1、PAI-1、HGF等促进肿瘤的发生、发展、耐药及转移等。和肿瘤细胞类似,CAF也具有异质性,并影响其对肿瘤的作用。比如胃肠道肿瘤中的促肿瘤CAF与抑肿瘤CAF;如胰腺导管癌中有炎性CAF与肌性CAF。同时转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGFβ）作为肿瘤微环境中的重要细胞因子,不仅直接对肿瘤细胞有双重作用,而且TGFβ可以调控CAF的异质性,间接作用于肿瘤细胞。首先,我们探索肿瘤细胞内受TGFβ调控,同时参与TME中细胞间信号分子及相互作用的致癌基因。通过分析TCGA、GEO53625的ESCC组织测序数据,以及受TGFβ-1刺激与否的ESCC细胞系的测序数据,我们最后锁定层黏连蛋白γ1（laminin subunit gamma 1,LAMC1）。通过验证,我们发现在食管磷癌中LAMC1高表达,且影响患者预后。TGFβ通过SMAD4及SP1协同转录上调LAMC1的表达;体外功能实验也显示:LAMC1通过抑制凋亡促进肿瘤细胞增殖,且通过激活Akt/NF-κB/MMP9,MMP14促进肿瘤细胞迁移。我们也发现并验证LAMC1可以通过激活NF-κB上调CXCL1的分泌。而肿瘤细胞分泌的CXCL1通过CXCR2/pSTAT3 促进炎性 CAF（inflammatory CAF,iCAF）的形成。iCAF 的上清又促进肿瘤细胞的增殖迁移。综上所述,ESCC是我国常见的恶性肿瘤,预后差。我们期望找到不仅针对肿瘤细胞本身,同时也通过TME间接影响肿瘤细胞进展的潜在治疗靶点。本研究首次揭示LAMC1在ESCC中的双重致癌机制:肿瘤细胞中受TGFβ上调的LAMC1不仅直接促进肿瘤细胞增殖迁移,也可通过上调CXCL1的分泌,促进炎性CAF转化来发挥致癌作用。这提示LAMC1可以成为ESCC的有力治疗靶点及预后标志物。肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast,CAF）在肿瘤微环境发挥.重要作用,而CAF的异质性则影响CAF的促进或抑制肿瘤效果。同时,CAF的异质性可以被肿瘤微环境中其他细胞,比如肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞等,通过旁分泌的方式影响。尿激酶型纤溶酶原激活物系统（Plasminogen Activator,Urokinase,PLAU）系统通过蛋白水解系统、细胞内外信号转导、趋化因子活化等途径介导细胞增殖、迁移、黏附等多种生物过程,在肿瘤的发生发展中起重要作用。既往很多报道证实PLAU在多种肿瘤中促进肿瘤增殖、转移复发等生物进展过程。我们探索PLAU在食管鳞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）中的功能,及肿瘤细胞分泌的PLAU对CAF异质性的影响。我们发现PLAU在ESCC中高表达,与患者预后差相关,可以作为ESCC的预后标记物。通过构建敲降或过表达PLAU食管鳞癌细胞株,并进行功能、RNA测序、验证等实验,我们发现PLAU通过激活MAPK途径促进ESCC增殖及克隆形成,并通过上调Slug及MMP9促进肿瘤细胞迁移,同时可以被Mekl/2抑制剂U0126回溯。另外,我们在体外原代培养并鉴定了CAF细胞,再通过肿瘤细胞与CAF共培养、肿瘤细胞条件培养基刺激CAF、以及重组PLAU因子刺激CAF等实验方法,结合转录组测序,细胞因子检测,及PCR验证,我们发现肿瘤细胞分泌的PLAU促进CAF向炎性CAF转化。且PLAU通过uPAR/Akt/NF-KB途径促进炎性CAF分泌IL8。受刺激后CAF分泌的IL8再反过来促进肿瘤细胞中PLAU的高表达,进一步促进ESCC肿瘤细胞增殖、侵袭。总之,PLAU不仅是ESCC的预后标记物,通过c-raf/Mek/Erk/Slug/MMP9促进肿瘤细胞增殖及迁移,而且肿瘤细胞分泌的PLAU促进炎性CAF形成,发挥促肿瘤作用,同时炎性CAF分泌的IL8又反过来上调肿瘤细胞PLAU的表达。
吴中兴[3]（2019）在《基于TCGA数据库挖掘肺鳞癌发病机制中的关键基因及PLAU（uPA）在肺鳞癌中的促癌作用分析》文中研究表明非小细胞肺癌主要包括肺腺癌和肺鳞癌。近年来对肺腺癌的诊断及治疗取得了一定进展,但肺鳞癌的诊治仍进展缓慢。究其原因,主要是肺鳞癌的分子发病机制仍不甚明确,同时肺鳞癌缺少有效的早期诊断和靶向治疗手段,这导致了肺鳞癌患者的5年生存率较低。为此,本论文基于TCGA肺鳞癌数据库的肺鳞癌组织和癌旁组织RNA表达数据,遴选肺鳞癌组织中差异表达的mRNA、微小RNA（microRNA,miRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）;针对肺鳞癌中差异表达的mRNA、miRNA和lncRNA构建lncRNA-miRNA-mRNA的竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）网络调控图。并对ceRNA成员中编码尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator,uPA）的PLAU基因在肺鳞癌中的促癌作用进行分析。本论文的主要研究结果如下:1.基于TCGA数据库遴选关键基因PLAU。通过TCGA数据库分析375个肺鳞癌组织样本和46个癌旁组织样本中mRNA、miRNA和lncRNA的表达,与癌旁组织相比,在肺鳞癌早期组、中期组和晚期组发现了3366个差异表达mRNA、79个差异表达miRNA和151个差异表达lncRNA;其中34个miRNA上调,45个miRNA下调,68个lncRNA上调,83个lncRNA下调。对差异表达mRNA开展基因本体论（Gene Ontology,GO）富集分析,发现差异mRNA富集在“信号转导”、“细胞粘附”和“血液凝固”等GO条目。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析显示,上调基因最显着的信号通路为“细胞周期”、“代谢通路”和“p53信号通路”,而下调转录物中最显着的信号通路是“补体和凝血级联”和“细胞粘附分子”。同时将预测的86个mRNA、39个miRNA和88个lncRNA构建获得ceRNA网络。经Cox回归分析ceRNA成员的预后特点,发现PLAU（uPA）的表达与肺鳞癌患者生存期呈负相关性。分析结果提示了PLAU在肺鳞癌致病中的关键作用。2.在肺鳞癌细胞及其小鼠皮下瘤中检测PLAU表达,并分析PLAU的促癌作用。免疫组化结果表明uPA在肺鳞癌小鼠皮下肿瘤组织中的表达要高于其在小鼠正常肺组织的表达。定量PCR（quantitative PCR,qPCR）、Western Blot和免疫荧光结果表明uPA在肺鳞癌细胞SK-MES-1中mRNA和蛋白表达均高于其在肺支气管上皮细胞16-HBE-T中mRNA和蛋白表达。构建PLAU过表达质粒并转染细胞16-HBE-T,qPCR分析显示MMP9、CCNB1和N-cadherin的mRNA表达显着性上调,而E-cadherin的mRNA表达显着性下调,提示PLAU过表达增强了细胞16-HBE-T的侵袭迁移能力。划痕实验和细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）实验证明了PLAU过表达后细胞16-HBE-T的迁移和增殖能力变强。构建PLAU慢病毒干扰质粒并转染细胞SK-MES-1,qPCR分析显示MMP9、CCNB1和N-cadherin的mRNA表达显着性下调,而E-cadherin的mRNA表达显着性上调,说明PLAU的抑制降低了细胞SKMES-1的侵袭迁移能力。划痕实验和CCK-8实验证明了PLAU被抑制后细胞SKMES-1的迁移和增殖能力变弱。研究结果提示了PLAU（uPA）在肺鳞癌中的关键促癌作用,PLAU（uPA）可能是肺鳞癌潜在的分子靶点,对肺鳞癌的临床诊疗有着重要意义。综上所述,本研究对TCGA中的肺鳞癌数据开展分析,获得了有价值的mRNA、miRNA和lncRNA差异表达基因,并以此构建了ceRNA网络,为深入开展肺鳞癌发病机制研究提供了基础数据。Cox回归分析显示PLAU表达与肺鳞癌患者生存期呈负相关。PLAU在肺鳞癌细胞SK-MES-1中的表达显着高于其在肺正常细胞16-HBE-T中的表达。PLAU的过表达会促进16-HBE-T细胞的迁移和增殖特性,而抑制PLAU的表达会减弱SK-MES-1细胞的迁移和增殖能力。研究结果提示了PLAU（uPA）在肺鳞癌中的关键促癌作用,PLAU（uPA）可能是肺鳞癌潜在的分子靶点,对肺鳞癌的临床诊疗有着重要意义。
吴文惠,郭锐华,包斌,张朝燕,张依婷,傅诗情[4]（2015）在《纤溶系统酶原激活小分子调节剂与溶栓先导化合物的研究》文中研究说明1.引言纤溶/凝血系统（coagulation and fibrinolytic systems）是止血机制的核心,其主要作用是防止血液渗漏,其次担负组织修复和伤口愈合。血浆中多种酶和非酶成分之间的相互作用主导纤溶凝血系统的精细调控过程。纤溶/凝血系统的绝大部分酶是丝氨酸蛋白酶,以非活性酶原如凝血酶原（prothrombin）、纤溶酶原（plasminogen）或低活性酶原单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(sigle chain
黄翠萍[5]（2010）在《uPA、uPAR及PAI-1在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义》文中认为目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）及其受体（uPAR）和抑制剂（PAI-1）在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义。方法采用免疫组织化学（PV-9000）法检测60例上皮性卵巢癌、30例良性卵巢肿瘤及30例正常卵巢组织中uPA、uPAR及PAI-1蛋白表达,并结合临床病理因素进行分析。结果（1）uPA、uPAR、PAI-1在上皮性卵巢癌中的表达率（75%及66.7%,65%）明显高于良性肿瘤（40%、30%、33.3%）及正常组织（30%、33.3%、26.7%）,差异均有统计学意义（P<0.05）;而在良性肿瘤与正常组织中表达无明显差异。（2）uPA、uPAR、PAI-1在上皮性卵巢癌组织中的表达与手术病理分期、组织学分级和有无淋巴结转移有关（P值均<0.05）,但是三者的阳性表达率与上皮性卵巢癌的病理类型无关,差异无统计学意义。（3）uPA、uPAR和PAI-1在Ⅲ-Ⅳ期的上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率显着高于Ⅰ-Ⅱ期（uPAχ2=14.400,P<0.05；PAI-1χ2=8.242,P=0.004；uPARχ2=9.6,P=0.002）；在不同组织学分级的上皮性卵巢癌组织中uPA、uPAR、和PAI-1的阳性表达率随肿瘤组织学分级越高而增加（uPAχ2=15.022,P<0.05;PAI-1χ2=29.697, P<0.05;uPARx2=36.906,P<0.05）；伴随淋巴结转移的上皮性卵巢癌组织中uPA、uPAR和PAI-1的阳性表达率高于无淋巴转移的组织（uPA x2=13.333,P<0.05；PAI-1 x2=9.573,P=0.002;uPARχ2=15.313, P<0.05）。差异均有统计学意义。结论上皮性卵巢癌组织中uPA、uPAR、PAI-1高表达与上皮性卵巢癌的发生、发展及侵袭转移密切相关,三者在侵袭转移过程中可能起着协同和互相调节的作用。
肖永光[6]（2010）在《食管鳞癌患者外周血uPAR mRNA表达及其临床意义》文中提出尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）,是一种丝氨酸蛋白水解酶,经过活化后的uPA能直接作用于细胞外基质,使基质中多种成分如纤维蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖、板层素等降解。尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）一方面通过与uPA结合,还能激活纤溶酶,提供细胞局部纤溶功能,另外,活化的纤溶酶还能激活胶原酶,使基底膜中的主要成分——胶原降解。另一方面uPAR能够介导uPA细胞内信号的传导,进而影响细胞的增殖、趋化、粘附、迁移等。尽管有证据表明uPAR在肿瘤的发生和发展过程中发挥作用,但关于食管癌患者外周血中uPAR mRNA的表达的临床研究资料却很少。现有的研究结果显示uPAR在晚期食管癌的原发病灶和转移病灶均发现有基因扩增和mRNA表达上调,据此我们推测uPAR可能是一种肿瘤分子分期、判断肿瘤预后的分子标志物。本研究拟检测uPAR在预测食管癌发生、发展和转移中的表达意义。第一部分uPAR在不同分期食管鳞状细胞癌患者外周血中的表达目的：探讨食管癌组织、转移淋巴结和食管肿瘤长度与外周血中uPAR的表达之间的关系及其意义。方法：选取经手术治疗的食管鳞状细胞癌患者共26例,其中男17例,女9例,年龄43-75岁,平均年龄61.5岁。按国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准：II期13例,III期23例。所有患者术前均未接受任何放化疗。正常健康对照组10例,其中男性6例,女性4例；年龄28-45岁,中位年龄35岁。于手术前1天和术后第14天,抽取每例食管癌患者静脉血各5ml,保存于柠檬酸钠抗凝剂真空采血管内。对照组抽出空腹血5ml,保存方法与食管癌患者相同。采用Trizol（Gibco公司）法提取总RNA,并经逆转录cDNA,行RT-PCR扩增,最后将PCR产物凝胶电泳分析。电泳完毕后取出凝胶,将其置于凝胶化学发光成像系统ChampChemi X的透射紫外线平台上,用302nm紫外线观察,并用Lane ID凝胶析软件进行半定量分析。结果：1.食管鳞癌组织中uPAR蛋白表达水平升高,结果显示uPARmRNA高表达与患者的性别、年龄、家族史、肿瘤分化、肿瘤侵润均无明显相关性,而与淋巴结转移和肿瘤的分期呈正相关,差异具有统计学意义。Logistic回归证实uPAR过表达与病人的淋巴结转移密切相关。uPAR蛋白表达阳性患者淋巴结转移的危险程度上升3.712倍,并影响肿瘤进一步进展到Ⅲ期的危险程度上升4.935倍。2、uPARmRNA高表达与淋巴结转移、肿瘤分期相关,结果显示uPAR mRNA高表达与患者的性别、年龄、家族史、肿瘤分化、肿瘤侵润均无明显相关性,而与淋巴结转移和肿瘤的分期呈正相关,差异具有统计学意义。3、不同时期uPARmRNA表达的变化,我们分析了所有食管鳞状细胞癌患者术前和术后第14天的外周血uPARmRNA表达对比,两者在术前后无显着差异,而肿瘤分期和淋巴细胞转移有显着性差异,说明uPARmRNA表达与清扫纵膈淋巴结有关。4、影响uPARmRNA高表达的Cox多因素分析,Cox多因素分析表明肿瘤侵袭深度、淋巴结转移是影响食管鳞状细胞癌患者外周血uPAR mRNA高表达的独立因素,而年龄、性别、肿瘤分化、肿瘤分期则不是影响uPAR mRNA高表达的独立因素。结论：外周血uPAR mRNA的高表达与肿瘤的侵润和转移相关,故监测外周血uPARmRNA的表达可以作为检验食管鳞状细胞癌转移的指标之一。第二部分食管鳞状细胞癌患者外周血中uPAR表达的预后意义目的：探讨食管鳞状细胞癌患者外周血中uPAR的表达与生存预后的关系及其意义。方法：选取经手术治疗的食管鳞状细胞癌患者共19例,其中男13例,女6例,中位年龄57.4岁（年龄范围42-70岁）。按国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准：II期12例,III期7例。所有患者术前均未接受任何放化疗。正常健康对照组10例,其中男性7例,女性3例；年龄28-45岁,中位年龄35岁。于手术前1天和术后第14天,抽取每例食管癌患者静脉血各5ml,分别测量外周血中CEA,CEAmRNA和uPARmRNA的滴度。对照组抽出空腹血5ml,保存方法及测量项目与食管癌患者相同。结果：1、食管鳞癌患者外周血CEA表达水平升高,我们用酶联免疫法（ELISA）测定所有食管鳞状细胞癌患者和志愿者外周血CEA浓度。志愿者外周血CEA浓度的平均值为3.1±1.4ng／ml,食管鳞状细胞患者外周血中CEA浓度平均值为32.8±11.6,与正常自愿者相比两者之间有显着性差异（P值<0.01）。2、Cox多因素分析表明淋巴结转移、患者术后肿瘤复发和生存期是影响食管鳞状细胞癌患者外周血uPAR mRNA高表达的独立因素,而肿瘤分化程度、肿瘤分期和肿瘤分期则不是影响uPARmRNA高表达的独立因素。3、采用Kaplan-Meier进行单因素分析的结果显示外周血中uPARmRNA表达阴性的病例组平均的生存时间较阳性病例长。经log-rank检验,两者之间具有显着的统计学意义（p=0.03）,证实uPARmRNA表达与食管鳞状细胞癌的预后之间具有一定的相关性。Cox多因素分析显示uPARmRNA高表达与病人预后不良之间的这种相关性受其它因素影响,表明uPARmRNA并非是一个独立的预后因素。结论：外周血uPAR mRNA的高表达与肿瘤的预后和复发相关,故监测外周血uPAR mRNA的表达可以作为检验食管鳞状细胞癌远期预后和近期复发转移的指标之一。
张中华[7]（2009）在《骨桥蛋白与尿激酶型纤溶酶原激活物在喉鳞状细胞癌中的表达及意义》文中研究指明目的检测骨桥蛋白（osteopontin,OPN）和尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator,uPA）在喉鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中的表达,并从肿瘤组织的临床病理特征方面进行对照分析,探讨二者在喉癌组织发生发展及侵袭转移中的意义,为临床早期监测肿瘤的生物学行为以及判断预后提供理论依据。方法选择2007年3月至2008年7月山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉头颈外科施行手术切除并经病理证实为喉鳞状细胞癌的标本64例,术前均未经放射治疗或化学治疗。另取18例癌旁距肿瘤1cm相对正常粘膜作为对照。应用免疫组织化学方法对64例喉鳞状细胞癌组织和18例癌旁相对正常粘膜组织进行免疫组织化学染色,根据显色细胞比率和癌细胞显色强度分别对OPN和uPA的阳性表达数进行判读,再根据患者性别、年龄,以及肿瘤原发部位、组织分化程度、临床分期,有无淋巴结转移等方面的不同,分别对OPN和uPA进行阳性计数。利用统计学软件计算出各个对应组的x2值和P值,比较对应组之间有无差异。根据喉癌组织中OPN和uPA共同阳性表达数,进行Spearman相关分析,看二者在喉鳞状细胞癌组织中的表达有无相关性。P＜0.05为差异具有统计学意义结果64例喉癌标本中OPN、uPA蛋白染色阳性率分别为62.5%（40/64）、65.6%（42/64）;18例正常组织中OPN、uPA蛋白染色阳性率分别为11.1%（2/18）、0（0/18）。二者比较,x2值分别为14.849和24.216,P＜0.05,差别有统计学意义,癌组织中OPN和uPA的表达率明显高于癌旁正常组织。OPN与uPA蛋白在Ⅲ～Ⅳ期喉癌组织中阳性率分别为73.8%和76.2%,明显高于在Ⅰ～Ⅱ期喉癌组织中的表达（P＜0.05）,并且二者在越晚期的癌组织中显色细胞比率及显色强度均越高。有淋巴结转移组中OPN与uPA的表达率亦明显高于无淋巴结转移组（P＜0.05）。在年龄、性别、部位及分化程度不同的对应组进行比较,二者表达均无明显差异（P＞0.05）。喉癌组织中OPN与uPA蛋白表达的相关性分析,rS=0.663,OPN与uPA在喉癌组织中的表达呈正相关（P＜0.05）。结论OPN及uPA蛋白的表达在喉癌组织中明显增高且与喉癌的临床分期和淋巴结转移有关（P＜0.05）,而与患者年龄、性别及肿瘤的部位、分化程度无关（P＞0.05）。OPN和uPA在喉癌组织中正相关表达,提示二者在肿瘤的发生和发展过程中起着协同作用。检测喉癌组织中OPN和uPA的表达情况可作为反映喉鳞状细胞癌生物学行为的客观参考指标,有助于了解喉癌浸润转移的倾向,并为选择术式和判断预后提供依据。
管宏伟[8]（2009）在《P73、P53和uPA在口腔鳞癌中的表达及意义》文中认为目的:本课题通过检测口腔鳞状细胞癌组织和癌旁正常口腔粘膜中P73蛋白、P53蛋白、uPA的表达情况,探讨其表达与临床病理因素及预后之间的关系及三者表达之间的相关性,为口腔鳞状细胞癌的早期诊断和防治提供理论基础和科学依据。方法:用免疫组织化学通用型两步法检测50例口腔鳞癌患者的癌旁正常组织和癌组织中P73、P53蛋白和uPA的表达。利用计算机图像分析得出平均吸光度（averageoptical density,AOD）并进行统计学分析。结果:1.口腔鳞癌中P73的表达明显高于癌旁正常组织（u=2.798,P<0.01）。P73的表达与肿瘤T分期（r=0.288,P<0.05）、肿瘤侵袭方式（r=0.327,P<0.05）、临床分期（r=0.315,P<0.05）及区域淋巴结转移（r=0.374,P<0.01）有明显的正相关性,与性别、年龄、生长部位、病理分级无明显的相关性。2.口腔鳞癌中P53的表达明显高于癌旁正常组织（u=2.913,P<0.01）。P53的表达与肿瘤病理分级（r=0.283,P<0.05）、区域淋巴结转移（r=0.294,P<0.05）有相关性,与口腔鳞癌的性别、年龄、T分期、生长部位、生长方式及临床分期无明显的相关性。3.口腔鳞癌中uPA的表达明显高于癌旁正常组织（u=2.749,P<0.01）。uPA的表达与口腔鳞癌的生长部位、病理分级无明显的相关性,与T分期（r=0.322,P<0.05）、生长方式（r=0.375,P<0.01）、临床分期（r=0.291,P<0.05）、淋巴结状况（r=0.391,P<0.01）有明显的正相关性。4.口腔鳞癌组织中P73与P53的表达无明显相关性（r=0.172,P>0.05）;uPA与P53的表达无明显相关性（r=0.227,P>0.05）;uPA与P73的表达有明显相关性（r=0.297,P>0.05）。结论:1.P73可能不是抑癌基因。2.P73、P53、uPA的表达与口腔鳞癌的发生发展密切相关,可作为判断肿瘤浸润转移、估计预后和指导治疗的参考指标。3.P73蛋白的过表达与P53基因突变无关。P73与P53可能是相互独立的影响口腔鳞癌预后的因素。4.P73与uPA可能在口腔鳞癌的发展中可能有相互协同作用,其相互作用机制还有待深入研究。
李月梅[9]（2009）在《uPA、PAI-1、ER、PR在子宫内膜癌组织中的表达及相关性研究》文中提出目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）和纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）及雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）在子宫内膜癌组织中的表达及相关性,并结合临床病理特征分析其在子宫内膜癌浸润侵袭转移过程中的作用。方法:采用免疫组织化学方法（PV-6000二步法）检测了15例正常子宫内膜（对照组）、18例子宫内膜增生过长（内膜增生组）及52例子宫内膜癌组织（内膜癌组）中uPA、PAI-1及ER、PR的表达,分析探讨其与子宫内膜癌手术病理分期、组织学分级、组织学类型等的关系;及uPA、PAI-1和ER、PR表达的相关性研究。结果:1.内膜癌组患者uPA和PAI-1含量均显着高于内膜增生组及对照组,差异有显着性（P＜0.05）。内膜增生组与对照组,差异无统计学意义（P＞0.05）。2.内膜癌组患者uPA和PAI-1含量随着手术病理分期及组织学分级的增高、肌层浸润深度的增加及淋巴结的转移而升高,差异有显着性（P＜0.05）;而与患者病理类型无关（P＞0.05）。3.随着uPA表达的增强,PAI-1的表达也明显增高,两者呈正相关（r=0.924,P＜0.01）;子宫内膜癌组织uPA的表达与PR的表达呈明显负相关（r=-0.785,P＜0.01）;与ER的表达无相关性（r=-0.257,P＞0.05）。结论:子宫内膜癌组织中uPA、PAI-1的高表达与子宫内膜癌的发病、侵袭、转移和预后密切相关;uPA、PAI-1在子宫内膜癌组织中的表达有较高的一致性。提示uPA与PAI-1在子宫内膜癌的发生发展浸润侵袭转移过程中可能起着协同和互相调节的作用;子宫内膜癌组织uPA与PAI-1的表达呈显着正相关,uPA与PR的表达呈显着的负相关性,鉴于PR阳性已被公认为子宫内膜癌患者孕激素治疗的参考指标,因此认为uPA、PAI-1对子宫内膜癌的病情评估、是否选择孕激素治疗、预后判断具有重要意义。
刘斐斐[10]（2008）在《MMP-1、MMP-2和uPA在喉鳞癌中的表达及意义》文中研究表明目的探讨基质金属蛋白酶-1、2（MMP-1、MMP-2）和尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）在喉鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化染色方法检测50例喉鳞癌患者的癌组织和癌旁正常组织中的MMP-1、MMP-2和uPA的表达。结果喉鳞癌组织中MMP-1、MMP-2和uPA的表达量明显高于癌旁正常组织（P＜0.01）。高分化鳞癌与中低分化鳞癌中MMP-1、MMP-2和uPA的表达明显高于癌旁正常组织（P＜0.01）,高分化鳞癌与中低分化鳞癌中MMP-1、MMP-2和uPA的表达水平基本一致（P＞0.05）。MMP-1的表达与喉鳞癌的临床分期、淋巴结状况有明显的正相关性（r分别是0.360、0.381）,与T分期、病理分级无明显的相关性。MMP-2和uPA的表达与喉鳞癌的T分期、病理分级、临床分期均无相关性,却与淋巴结状况有明显的正相关性（r分别是0.296、0.381）。喉鳞癌中MMP-2与uPA的表达呈正相关性（r=0.405,P＜0.01）。结论MMP-1、MMP-2和uPA的表达与喉鳞癌的侵袭、转移关系密切,有望在临床上成为判断侵袭、转移的指标。联合检测MMP-1、MMP-2和uPA,对于了解喉鳞癌区域性淋巴结转移的可能性和手术方法的选择具有一定的意义。
二、肾细胞癌尿激酶型纤溶酶原激活物表达的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肾细胞癌尿激酶型纤溶酶原激活物表达的研究（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）LAMC1及PLAU调控微环境中CAF的活化及促进食管鳞癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分 受TGFβ上调的LAMC1通过NF-κB/CXCL1/STAT3促进炎性CAF形成并促进食管鳞癌进展 |
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 一、实验试剂 |
| 二、主要仪器设备 |
| 三、溶液配制 |
| 实验方法 |
| 一、食管鳞癌组织标本的收集和组织芯片 |
| 二、免疫组织化学染色及评分 |
| 三、食管鳞癌细胞系和MRC-5和CAF培养 |
| 四、细胞免疫荧光实验 |
| 五、条件培养基的制备 |
| 六、共培养系统 |
| 七、细胞总RNA的提取 |
| 八、RT-qPCR检测mRNA的表达 |
| 九、Western blot检测蛋白质表达水平 |
| 十、构建稳转敲降及过表达细胞系 |
| 十一、染色质免疫沉淀实验(ChIP) |
| 十二、酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 十三、Luminex液相悬浮芯片 |
| 十四、RNA测序 |
| 十五、细胞功能试验 |
| 十六、动物实验 |
| 十七、统计方法 |
| 实验结果 |
| 一、筛选被TGFβ1正向调控且参与肿瘤微环境细胞间作用的致癌基因LAMC1,其在食管鳞癌组织中高表达并与患者预后相关 |
| 1.1 食管鳞癌中TGFβ1正向调控基因 |
| 1.2 参与肿瘤微环境中细胞间互作的基因 |
| 1.3 LAMC1在食管鳞癌组织中高表达,且与预后相关 |
| 1.4 LAMC1的表达量与临床病理指标的相关性 |
| 二、TGFβ1诱导LAMC1的表达 |
| 2.1 LAMC1受TGFβ1的上调呈时间浓度依赖性 |
| 2.2 LAMC1受TGFβ1/SMAD4及SP1通路直接调控 |
| 三、LAMC1通过抑制细胞凋亡促进食管鳞癌细胞增殖 |
| 3.1 LAMC1促进体外食管鳞癌细胞增殖和抑制细胞凋亡 |
| 3.2 LAMC1增强食管鳞癌细胞的小鼠皮下成瘤能力 |
| 四、LAMC1促进食管鳞癌细胞迁移 |
| 4.1 LAMC1在体外促进食管鳞癌细胞迁移 |
| 4.2 LAMC1增强食管鳞癌细胞的小鼠肺定植能力 |
| 五、LAMC1促进肿瘤细胞增殖及迁移的下游机制 |
| 5.1 RNA-seq |
| 5.2 在食管鳞癌中LAMC1对NF-κB信号通路的调控作用 |
| 5.3 LAMC1通过促进Akt/NF-κB /MMP9-MMP14通路促进肿瘤细胞迁移 |
| 5.4 LAMC1通过NF-κB/caspase9-caspase3-caspase PARP cascade抑制凋亡,促进增殖 |
| 六、LAMC1通过NF-κB促进肿瘤细胞分泌CXCL1 |
| 6.1 LAMC1促进CXCL1的分泌 |
| 6.2 LAMC1通过促进NF-κB激活转录调控CXCL1 |
| 七、LAMC1通过分泌CXCL1促进炎性CAF形成 |
| 7.1 RNA-seq结果提示LMAC1通过分泌CXCL1促进炎性CAF形成 |
| 7.2 shLAMC1肿瘤细胞与CAF细胞共培养验证 |
| 7.3 shLAMC1肿瘤细胞条件培养基与CAF细胞共培养验证 |
| 7.4 人重组CXCL1因子促进炎性CAF形成 |
| 八、CXCL1通过CXCR2/STAT3通路促进炎性CAF形成 |
| 8.1 shLAMC1肿瘤细胞与CAF细胞共培养提示炎性CAF内CXCR2/STAT3激活 |
| 8.2 shLAMC1肿瘤细胞条件培养基与CAF细胞共培养提示炎性CAF内CXCR2/STAT3激活 |
| 8.3 人重组CXCL1因子通过CXCR2/STAT3通路促进炎性CAF形成 |
| 九、CXCL1激活的炎性CAF促进食管鳞癌增殖、迁移 |
| 9.1 体外CAF细胞与肿瘤细胞共培养提示CXCL1激活的炎性CAF促进肿瘤细胞增殖、迁移 |
| 9.2 体内CXCL1预处理CAF细胞促进肿瘤细胞皮下成瘤能力及MMP9高表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PLAU通过uPAR/Akt/NF-κB/IL8通路促进CAF向炎性CAF转化并促进食管鳞癌进展 |
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 一、实验试剂(与第一部分不同的如下) |
| 二、主要仪器设备 |
| 三、溶液配制 |
| 实验方法 |
| 一、食管鳞癌组织标本的收集和组织芯片 |
| 二、免疫组织化学染色及评分 |
| 三、细胞培养 |
| 四、构建稳转敲降及过表达PLAU细胞株 |
| 五、原代培养CAF及正常成纤维细胞NF |
| 六、收集条件培养基(Conditional medium,CM) |
| 七、构建共培养体系 |
| 八、RNA提取和实时定量PCR (RT-qPCR) |
| 九、Western blot检测蛋白质表达水平 |
| 十、Luminex液相悬浮芯片 |
| 十一、酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 十二、RNA测序 |
| 十三、细胞增殖实验 |
| 十四、细胞克隆形成实验 |
| 十五、细胞迁移实验 |
| 十六、裸鼠皮下成瘤实验 |
| 十七、肺定植实验 |
| 十八、统计方法 |
| 实验结果 |
| 一、PLAU在食管鳞癌组织中高表达,且与患者预后相关 |
| 1.1 PLAU在食管鳞癌组织中高表达且患者预后差 |
| 1.2 PLAU的表达量与临床病理指标的相关性 |
| 二、PLAU在体内外促进食管鳞癌细增殖及肿瘤生长 |
| 2.1 构建稳定过表达和敲降PLAU细胞系 |
| 2.2 PLAU促进体外食管鳞癌细胞克隆形成及增殖 |
| 2.3 PLAU增强食管鳞癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力 |
| 三、PLAU促进食管鳞癌细胞迁移 |
| 3.1 PLAU在体外促进食管鳞癌细胞迁移 |
| 3.2 PLAU增强食管鳞癌细胞的小鼠肺定植能力 |
| 四、PLAU通过MAPK通路促进肿瘤细胞增殖及迁移 |
| 4.1 RNA-seq |
| 4.2 食管鳞癌中PLAU对MAPK信号通路的调控作用 |
| 4.3 PLAU通过MAPK通路促进肿瘤细胞增殖及迁移 |
| 五、肿瘤细胞分泌的PLAU刺激CAF促进食管鳞癌细胞增殖及迁移 |
| 5.1 肿瘤细胞分泌的PLAU刺激的CAF促进肿瘤细胞增殖 |
| 5.2 肿瘤细胞分泌的PLAU刺激后的CAF促进肿瘤细胞迁移 |
| 5.3 肿瘤细胞分泌的PLAU刺激的CAF促进肿瘤的皮下成瘤能力 |
| 六、肿瘤细胞分泌的PLAU促进炎性CAF形成 |
| 6.1 RNA-seq提示肿瘤细胞分泌PLAU促进炎性CAF形成 |
| 6.2 RT-qPCR及CAF条件培养基蛋白芯片结果验证 |
| 七、肿瘤细胞分泌PLAU活化的炎性CAF分泌IL8 |
| 7.1 重组PLAU刺激CAF分泌IL8 |
| 7.2 过表达PLAU肿瘤细胞与CAF共培养验证肿瘤细胞分泌的PLAU刺激CAF分泌IL8 |
| 7.3 PLAU通过uPAR/Akt/NF-κB促进炎性CAF分泌IL8 |
| 八、炎性CAF分泌IL8促进肿瘤细胞PLAU表达 |
| 8.1 重组PLAU活化的CAF反过来促进肿瘤细胞内PLAU的表达 |
| 8.2 IL8上调PLAU的表达且呈时间浓度依赖性 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 在学期间发表论文 |
| 文献综述 肿瘤相关成纤维细胞异质性及其在食管鳞癌中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）基于TCGA数据库挖掘肺鳞癌发病机制中的关键基因及PLAU（uPA）在肺鳞癌中的促癌作用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号对照表 |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 肺癌简介 |
| 1.1.2 肺鳞癌的研究进展 |
| 1.2 TCGA数据库简介及研究现况 |
| 1.3 ce RNA的研究进展 |
| 1.3.1 ce RNA假说的提出及其简介 |
| 1.3.2 ce RNA与癌症的关系 |
| 1.4 PLAU(uPA)的研究进展 |
| 1.4.1 PLAU(uPA)的结构及功能 |
| 1.4.2 uPA在肿瘤临床研究中的进展 |
| 1.5 PLAU(uPA)在肿瘤发展中的作用 |
| 1.5.1 ECM的蛋白水解 |
| 1.5.2 uPA与肿瘤细胞增殖 |
| 1.5.3 uPA与细胞粘附和迁移 |
| 1.6 本课题的研究思路与内容 |
| 第二章 基于TCGA数据库遴选肺鳞癌关键致病基因PLAU |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 肺鳞癌临床变量RNA序列数据的计算分析 |
| 2.2.2 肺鳞癌中差异mRNA的GO和KEGG pathway分析 |
| 2.2.3 种子匹配分析和ce RNA网络的构建 |
| 2.2.4 ce RNA网络关键成员的临床特征 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 肺鳞癌中差异表达的mRNA |
| 2.3.2 肺鳞癌中差异表达mRNA的GO分析 |
| 2.3.3 肺鳞癌中差异表达mRNA的通路分析 |
| 2.3.4 肺鳞癌中差异表达的mi RNA |
| 2.3.5 肺鳞癌中差异表达的lnc RNA |
| 2.3.6 肺鳞癌中lnc RNA-mi RNA-mRNA的ce RNA网络图 |
| 2.3.7 关键的ce RNA及其相关的临床特征 |
| 2.3.8 肺鳞癌中PLAU(uPA)的特征 |
| 2.4 实验讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 肺鳞癌中PLAU的表达及PLAU的促癌作用分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验细胞、动物及质粒 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验试剂的配置 |
| 3.2.4 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 肺细胞总RNA的提取 |
| 3.3.3 RNA浓度、纯度及完整性测定 |
| 3.3.4 逆转录反应 |
| 3.3.5 肺细胞中各基因的PCR反应 |
| 3.3.6 q PCR检测肺细胞中各基因mRNA表达 |
| 3.3.7 Western Blot测定细胞蛋白表达 |
| 3.3.8 免疫荧光测定肺细胞uPA蛋白 |
| 3.3.9 构建肺鳞癌细胞的小鼠皮下移植瘤模型 |
| 3.3.10 免疫组化检测小鼠皮下瘤组织及正常肺组织 |
| 3.3.11 制备PLAU基因片段 |
| 3.3.12 过表达质粒的连接、转化与提取 |
| 3.3.13 慢病毒重组质粒的构建 |
| 3.3.14 慢病毒的包装及转染 |
| 3.3.15 细胞转染 |
| 3.3.16 划痕实验 |
| 3.3.17 CCK-8 细胞活性检测 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 小鼠皮下肿瘤组织及正常肺组织中uPA蛋白表达 |
| 3.4.2 肺正常及肺鳞癌细胞中uPA mRNA和蛋白表达 |
| 3.4.3 构建PLAU过表达质粒 |
| 3.4.4 质粒转染荧光图及uPA mRNA表达 |
| 3.4.5 uPA过表达后对细胞 16-HBE-T各基因mRNA表达量影响 |
| 3.4.6 uPA过表达后对细胞 16-HBE-T迁移的影响 |
| 3.4.7 uPA过表达后对细胞 16-HBE-T增殖的影响 |
| 3.4.8 慢病毒的滴度测定 |
| 3.4.9 慢病毒质粒转染荧光图及uPA mRNA表达 |
| 3.4.10 uPA被抑制后对细胞SK-MES-1 各基因表达量的影响 |
| 3.4.11 uPA被抑制后对细胞SK-MES-1 迁移的影响 |
| 3.4.12 uPA被抑制后对细胞SK-MES-1 增殖的影响 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 本文主要结论 |
| 4.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）uPA、uPAR及PAI-1在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法与步骤 |
| 1.3 结果判定 |
| 1.4 统计学分析 |
| 第二章 实验结果 |
| 2.1 uPA、uPAR、PAI-1在不同卵巢组织表达及分布 |
| 2.1.1 uPA在卵巢组织中的表达 |
| 2.1.2 uPAR在卵巢组织中的表达 |
| 2.1.3 PAI-1在卵巢组织中的表达 |
| 2.2 上皮性卵巢癌组织中uPA、uPAR、PAI-1的表达与临床病理指标的关系 |
| 附图 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 uPA与PAI-1在卵巢癌中的表达及意义 |
| 3.2 uPAR在卵巢癌中的表达及意义 |
| 3.3 uPA、uPAR及PAI-1与上皮性卵巢癌的关系 |
| 3.4 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述的参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）食管鳞癌患者外周血uPAR mRNA表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、引言 |
| 四、正文 |
| 第一部分 uPAR mRNA在食管鳞状细胞癌患者外周血中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 食管鳞状细胞癌外周血中uPAR表达的预后意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 五、综述 |
| 正文 |
| 参考文献 |
| 六、攻读博士学位期间所发表的论文 |
| 七、后记 |
（7）骨桥蛋白与尿激酶型纤溶酶原激活物在喉鳞状细胞癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）P73、P53和uPA在口腔鳞癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 病例选择 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 免疫组织化学染色 |
| 1.6 结果判断 |
| 1.7 图像分析 |
| 1.8 统计学处理 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）uPA、PAI-1、ER、PR在子宫内膜癌组织中的表达及相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法与步骤 |
| 1.3 结果判定 |
| 第二章 实验结果 |
| 2.1 子宫内膜组织uPA和PAI-1翻译水平的表达 |
| 2.2 ER、PR在子宫内膜癌组织中的表达及其与病例特征的关系 |
| 2.3 子宫内膜癌组织中uPA的表达与PAI-1、ER、PR表达的相关性 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 uPA系统与肿瘤的浸润转移 |
| 3.2 uPA、PAI-1的表达与子宫内膜癌的关系 |
| 3.3 uPA、PAI-1的表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系 |
| 3.4 ER、PR的表达与子宫内膜癌的关系 |
| 3.5 子宫内膜癌组织uPA与PAI-1、ER、PR表达的相关性 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 问题与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 尿激酶型纤溶酶原激活剂系统与妇科肿瘤 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）MMP-1、MMP-2和uPA在喉鳞癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 病例选择 |
| 1.2 试剂、仪器和材料 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 仪器和材料 |
| 1.3 免疫组织化学染色 |
| 1.4 免疫组化结果的判定 |
| 1.5 统计学处理 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 MMP-1、MMP-2、uPA在癌旁正常组织和喉鳞癌中的分布 |
| 2.2 癌旁正常组织与喉鳞癌中MMP-1、MMP-2、uPA的表达 |
| 2.3 癌旁正常组织、高分化鳞癌、中低分化鳞癌中MMP-1、MMP-2、uPA的表达 |
| 2.4 喉鳞癌中MMP-1、MMP-2、uPA的表达与临床病理指标的关系 |
| 2.5 喉鳞癌中MMP-1、MMP-2、uPA的表达与临床病理指标间的相关性 |
| 2.6 喉鳞癌组织中MMP-2和uPA表达的相关性 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 MMP-1在喉鳞癌中的表达和意义 |
| 3.2 MMP-2在喉鳞癌中的表达和意义 |
| 3.3 uPA在喉鳞癌中的表达和意义 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述的参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、肾细胞癌尿激酶型纤溶酶原激活物表达的研究（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]LAMC1及PLAU调控微环境中CAF的活化及促进食管鳞癌进展的机制研究[D]. 方凌凌. 北京协和医学院, 2021
- [3]基于TCGA数据库挖掘肺鳞癌发病机制中的关键基因及PLAU（uPA）在肺鳞癌中的促癌作用分析[D]. 吴中兴. 西安电子科技大学, 2019(02)
- [4]纤溶系统酶原激活小分子调节剂与溶栓先导化合物的研究[A]. 吴文惠,郭锐华,包斌,张朝燕,张依婷,傅诗情. 第十二届海洋药物学术年会会刊, 2015
- [5]uPA、uPAR及PAI-1在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义[D]. 黄翠萍. 青岛大学, 2010(04)
- [6]食管鳞癌患者外周血uPAR mRNA表达及其临床意义[D]. 肖永光. 武汉大学, 2010(05)
- [7]骨桥蛋白与尿激酶型纤溶酶原激活物在喉鳞状细胞癌中的表达及意义[D]. 张中华. 山东大学, 2009(05)
- [8]P73、P53和uPA在口腔鳞癌中的表达及意义[D]. 管宏伟. 青岛大学, 2009(11)
- [9]uPA、PAI-1、ER、PR在子宫内膜癌组织中的表达及相关性研究[D]. 李月梅. 青岛大学, 2009(10)
- [10]MMP-1、MMP-2和uPA在喉鳞癌中的表达及意义[D]. 刘斐斐. 青岛大学, 2008(07)