一、不同培养方式对HIV产量的影响（论文文献综述）
高楠[1]（2021）在《SHIV感染恒河猴体内产生针对HIV-1广谱中和抗体机制的研究》文中进行了进一步梳理获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）又称艾滋病,是严重威胁人类公共健康的传染病之一。这种疾病由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）感染所引发。目前已有的治疗方案虽然可以有效地延长患者寿命,但由于无法完全清除HIV-1感染者体内的病毒潜伏库而不能彻底治愈艾滋病,治疗还会对患者产生一定的副作用并且由治疗引发的耐药性问题也亟待解决。因此,研发出有效的艾滋病疫苗是控制艾滋病传播的重要干预手段。广谱中和抗体（Broadly neutralizing antibodies,bn Abs）是人体经过长期感染HIV而逐渐产生的体液免疫应答,这是一类对大部分HIV-1流行株均具有较强中和能力的抗体,为HIV的治疗和预防策略提供了新的方向。因此能否诱导机体产生bn Abs也成为衡量一个疫苗有效性的重要标准。然而在HIV-1感染的人群中只有约20%患者体内能够产生这类bn Abs,并且通过对bn Abs在人体中进化过程的研究可以发现,这类抗体要经历2-4年的成熟进化才能够形成。人猴嵌合免疫缺陷病毒（Simian/human immunodeficiency virus,SHIV）感染的非人灵长类动物模型（Non-human primate,NHP）作为唯一可以用来评价HIV-1疫苗有效性的动物模型,但其能否和人类一样具有产生bn Abs的能力,且产生机制是否相同目前还不清楚。因此,建立合理的SHIV-NHP模型研究其体内bn Abs的产生及进化机制对于未来HIV-1疫苗的评价具有十分重要的意义。在先前的研究中,很少在SHIV感染的NHP体内检测到广谱中和抗体的产生,但在几项关于SHIV-NHP模型的报道中,极个别的恒河猴在感染SHIV后血浆中产生了具有交叉活性的中和抗体,但并未分离到单克隆bn Abs。这很大程度上是由于bn Abs的产生通常需要2-4年时间,而一般的猴体实验项目所持续的时间不超过2年,抗体没有足够的时间进化成熟为bn Abs。正是由于缺少合适的长期感染模型,因此目前还无法对恒河猴体内产生的中和抗体的性质及成熟过程进行细致深入的研究。因此在本篇论文的研究中,我们利用两种SHIVs分别建立感染模型,并持续跟踪6-7年。通过长期的SHIV感染在恒河猴体内诱导产生广谱中和活性,利用不同敏感度的HIV-1流行株对血浆中和活性进行分析,并分析血浆中和抗体的作用表位。在确定产生广谱中和活性的恒河猴体内分离出单克隆bn Ab,评价其中和广谱性,强度以及表位等特性。再通过分析猴体单克隆抗体（monoclonal antibodies,m Abs）的谱系以及猴体内病毒包膜蛋白的突变情况追溯bn Ab的进化过程以及与SHIV共同进化的过程,从而分析NHP体内与人体内产生广谱中和抗体的相关性,为更好地应用恒河猴模型来评价HIV-1疫苗提供理论和实验依据。首先我们选择了两种感染力较强的SHIVs(SHIV1157ipd3N4和SHIVSF162P3)通过高剂量静脉单次或者低剂量直肠多次的方式感染中国恒河猴,最终在31只恒河猴体内成功建立了感染。通过对猴体内病毒载量的检测可以发现,急性感染期猴体内的病毒载量很高,进入慢性感染期后猴体内有持续的病毒存在。我们对2只SHIV1157ipd3N4感染的恒河猴（G1015R和G1020R）持续监测至感染后6年,发现在感染后期病毒载量有持续升高的趋势,这为bn Abs的产生提供了持续的抗原刺激。随后我们对保留有不同纵向时间点血浆样本的6只恒河猴的进行了中和活性的评价,发现感染早期中和抗体的交叉活性很低,随着感染时间的延长,中和广谱度逐渐升高,感染超过6年的G1015R和G1020R可以中和超过65%的tier 2病毒。并且通过对比不同SHIVs感染恒河猴产生中和抗体的广谱度发现,SHIV1157ipd3N4诱导产生广谱中和活性的能力要强于SHIVSF162P3和SHIVCHN19P4,且直肠攻毒途径更易诱导bn Abs。中和表位特异性分析表明,V2,V3或CD4bs区域中已知bn Abs的抗性突变会降低G1015R和G1020R血浆中和抗体对病毒的敏感性,说明G1015R和G1020R产生的中和活性针对Env的V2,V3以及CD4bs区,这和人体产生的bn Abs具有相似的性质。为了进一步分析恒河猴体内产生的bn Abs,我们通过流式细胞术对猴体内的单克隆抗体进行分离。我们选择了G1015R感染后350周的外周血淋巴细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）样品,分选了针对V2区表位特异性的单个记忆B细胞,并进行抗体可变区基因的扩增,共获得了44对重轻链配对的Ig G基因,通过ELISA筛选其中对同源病毒具有结合活性的抗体,再经过大量表达纯化后进行中和抗体广谱度和强度的评价。我们共分离到12个具有中和活性的抗体,其中6个抗体具有中和多种tier 2病毒的能力。J038是其中中和能力最强的m Ab,可以中和54%的208个全球流行株,这也是目前报道的分离自SHIV感染的NHP体内广谱度最高的抗体。通过对抗体谱系进行分析可以发现6个具有交叉中和活性的抗体均来源于相同谱系（VH4-2*01 F/VK1-20*01 F）。对J038谱系抗体的识别表位进行分析,发现其识别Env主要依赖于N156位和N160聚糖以及V2环上的氨基酸残基。通过对J038 Fab-C1080 Env共结晶的晶体结构进行结合位点分析,可以发现J038所具备的18个氨基酸的HCDR3区并未插入Env V2顶端的内部,而是和V2环反向平行形成了氢键。但J038和聚糖的相互作用占据了抗体-抗原近一半的结合界面,这和分离自人体的V2特异性bn Abs的特征一致。随后,我们对J038谱系抗体的进化过程进行了追溯。通过进化树分析我们推测了J038谱系的共同祖先（Unmutated common ancestor,UCA）和各阶段的中间过渡抗体（Intermediates antibodies,IAs）,UCA和早期的IAs可以中和自体病毒但并不能中和异源病毒,表明J038谱系的广谱中和能力是通过感染过程中逐渐积累突变进化获得的。对各阶段过渡体的结合位点进行同源建模分析可以发现J038谱系抗体在进化的过程中逐渐积累了对包膜蛋白V2区N156和N160位聚糖的结合界面也验证了J038谱系广谱中和抗体的进化过程。通过比对G1015R各时期血浆中病毒env序列可以发现,J038谱系所识别的V2区已经逐渐积累了稳定的突变,其中I165L,K171R和V172A会造成病毒对J038谱系抗体的中和敏感度下降,表明在G1015R恒河猴体内病毒由于中和抗体的选择压力已经产生了逃逸突变。尽管在猴体内抗体选择压力下所产生的逃逸突变和人体内所检测到的突变不完全相同,但猴体内bn Abs和人体内bn Abs的进化过程具有很多相似之处。综上所述,本文成功建立了最长时间的SHIV-NHP感染模型,在其体内诱导产生了广谱中和活性,通过分离单克隆bn Abs获得了目前分离自SHIV感染恒河猴体内中和广谱度最高的的J038谱系抗体,通过对NHP体内产生的bn Abs的性质和进化过程进行了深入的研究发现J038识别与人源V2特异性广谱中和抗体相同的表位,在进化过程中通过积累对聚糖的结合增强广谱性。并且J038谱系的产生也对猴体的病毒产生了免疫选择压力且病毒在此压力下也积累了逃逸突变。通过这项研究对NHP体内是否能产生和人体类似bn Abs及其产生机制进行了合理的分析和阐释。通过本篇论文的研究,可以为更好地应用SHIV-NHP模型评价HIV-1疫苗提供一定的理论和实验依据。
麻云霞[2]（2021）在《文冠果种子特性变异及优良砧用种源选择》文中提出文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）,是我国特有的珍稀木本油料、药用植物、食用和蜜源树种,也是治理荒漠化、绿化荒山、美化城市的优良树种,广布于我国“三北”地区。但目前文冠果多数仍处于野生、半野生状态,类型极其混杂,种子来源不清,生长慢,产量低,生态和经济效益不高。因此,本文以26个地理种源的文冠果为研究对象,采用野外调查与室内分析相结合的方法,对文冠果种子的特性、多点苗期生长特征和作为砧木造林的适用性进行了全面系统的评价,为文冠果的良种选育和种质资源的合理利用提供理论依据。研究主要结果如下:（1）不同种源间文冠果含油率变异较大,在56.54～76.27%之间,脂肪酸含量丰富,共有18种脂肪酸,含量最高的为亚油酸和油酸,且单不饱和脂肪酸含量>多不饱和脂肪酸含量>总饱和脂肪酸含量,生物柴油特性指标均符合ASTM D6751-2010,EN 14214-2008和GB/T 20828-200等国际标准。种子内含有17种氨基酸和8种人体必需矿质元素,VB1、VB2和VE的平均含量值较高。26个种源中文冠果种子品质特性最为优质的种源有内蒙古甘旗卡、内蒙古扎鲁特、内蒙古奈曼、内蒙古库伦和山东东营,这些种源的种子是生产中食用油原料和生物柴油原料俱佳的首选资源。（2）文冠果种子形态质量指标最好的种源地为内蒙古图布信,种子的活力和含水率为93.29%和13.28%,吸水特性分为急速吸水时期、平缓吸水时期和生长吸水期三个时期。且形态和质量指标在组间和组内都具有丰富的遗传多样性,整体重复力也较高。处理方式、种源地及其交互效应对文冠果种子的发芽率、发芽指数、发芽时间存在极显着的影响。种子处理效果最好的为处理方式B—沙藏+5%PEG浸泡24小时,发芽性能最好的种源为内蒙古科尔沁。种子的形态质量和发芽指标整体呈现西—东梯度逐渐增大的地理变异趋势,与种子品质特性的变异模式类似。内蒙古科尔沁、内蒙古图布信、内蒙古扎鲁特、内蒙古舍伯吐和黑龙江牡丹江为文冠果种子形态质量和发芽特性表现最好的种源。（3）辽宁彰武（东北地区）试验点的优质文冠果优质种源有内蒙古奈曼、扎鲁特和辽宁海城,山东安丘（华东地区）试验点的优质种源有山东东营、安丘和内蒙古库伦,陕西靖边（西北地区）试验点的优质种源有内蒙古科尔沁、奈曼和北京房山,这些种源可在辽宁、山东和陕西三省或与本文试验地类似的立地环境进行推广。不同试验点的优质种源并不完全相同,其苗木保存率、苗高、地径、叶干质量和枝干质量均会随着试验地点的不同产生不同程度的变化。在同时考虑平均株高与地径的情况下,内蒙古库伦、山东东营种源的平均育种值也为最高,具有较大的育种潜力。（4）用26个种源二年生文冠果做砧木,嫁接文冠果新品种‘中石4号‘和‘中石9号‘,总体亲和性‘中石9号‘高于‘中石4号‘。内蒙古奈曼、山东东营、内蒙古库伦砧木种源嫁接成活率最高,河北张家口最低;内蒙古奈曼种源地砧木嫁接‘中石4号‘后,果实产量最高,内蒙古科尔沁种源地砧木嫁接‘中石9号‘后,果实产量最高。综合生长、生理特性和果实产量等多个指标得出:嫁接‘中石4号‘的优质砧木种源为内蒙古奈曼、内蒙古科尔沁、内蒙古库伦、北京房山和山东临沂,嫁接‘中石9号‘的优质砧木种源为陕西靖边、内蒙古科尔沁、内蒙古库伦、内蒙古奈曼、北京房山和辽宁关山。
孙林[3]（2021）在《新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂和RNase H抑制剂的设计、合成与生物活性评价》文中进行了进一步梳理艾滋病（AIDS）的主要致病原为人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。临床上通常将至少三种作用于HIV-1生命周期不同阶段的药物联合应用来治疗艾滋病,称为“高效抗逆转录病毒疗法”（HAART）。但是,由于HIV-1具有潜伏性,因此需要长期甚至终生接受药物治疗,这不可避免地带来了严重的耐药性等问题。因此,瞄准具有成药潜力的新靶标,尤其是在HIV-1生命周期的多个环节中扮演重要角色的蛋白或酶,如衣壳蛋白（CA）和核糖核酸酶H（RNase H）,研发具有新结构、新机制的药物来丰富临床治疗方案,是解决现有药物耐药难题的有效策略。HIV-1 CA是构成一个成熟的病毒颗粒所必需的结构蛋白,并将病毒基因和关键酶包裹其中。此外,CA在病毒复制的早期和晚期阶段还发挥重要的调控作用,与HIV-1的复制及感染性密切相关。目前已有多类CA抑制剂见诸报道,其中作用于CA六聚体相邻亚基N末端-C末端（NTD-CTD）界面的抑制剂尤为引人关注。NTD-CTD界面作用对于CA组装至关重要,干扰该界面可影响CA内在的柔韧性,继而破坏病毒颗粒的完整性。PF74是第一个与NTD-CTD界面的共晶结构得到解析的化合物,但是其存在药理活性低、代谢不稳定等缺陷,未能进入临床研究。最终吉利德公司在PF74基础上经过大量的结构优化发现了抗病毒活性突出的GS-6207,目前已处于临床研究阶段。但是其合成复杂、分子量大、溶解度差、临床研究已诱发病毒耐药等缺陷,使得开发新结构类型的HIV-1 CA抑制剂尤为迫切。HIV-1 RNase H能特异性地水解在逆转录过程中新生成的RNA/DNA杂合链中的RNA链。其一旦受到抑制,逆转录过程将难以延续。目前见诸报道的RNase H抑制剂大都存在抗病毒活性弱和细胞毒性大等缺陷,尚未有RNase H抑制剂进入到临床研究阶段。RNase H作为金属依赖性蛋白,使得对其进行计算机模拟研究存在局限性,从而为基于靶标的药物设计带来困难。而通过对结构多样的化合物库进行细胞水平的抗HIV表型筛选并辅之作用机制研究,以发现具有新作用机制（如RNase H抑制活性）的先导化合物,不失为一种行之有效的途径。一、含三氮唑的苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价本章以GS-CA1和GS-6207所共有的PF74苯丙氨酸基本骨架为研究起点,借鉴课题组前期发现的化合物13m的结构特征,综合运用基于靶标的药物设计原理以及骨架跃迁、生物电子等排替换等药物化学策略,将13m的1-（萘-2-亚甲基）-1H-1,2,3-三唑替换为4-苯基-1H-1,2,3-三唑,并在末端苯环上进行多样性导向的取代基修饰,以克服CA柔性靶标与小分子结合模式的难预测性,并丰富此类抑制剂的构效关系,设计并合成了 IA系列共39个结构新颖的含三氮唑的苯丙氨酸类HIV-1 CA抑制剂。体外抗HIV-1活性筛选发现,IA系列大部分化合物表现出中等的抗病毒活性（EC50=3.13μM～14.81 μM）。其中,IA-6a-9、IA-6a-10、IA-6a-11 和 IA-5b 的抗 HIV-1 活性（EC50分别为 3.13 μM、3.30μM、3.46 μM 和 3.30 μM）最为突出,但仍弱于先导 PF74（EC50=0.28μM）。SPR 实验结果显示,IA-6a-9、IA-6a-10和IA-5b与CA六聚体结合的KD值彼此接近（分别为6.04 μM、4.99 μM和4.00μM）,与三者抗病毒活性趋势一致,初步验证了作用靶点。作用阶段确证实验结果表明IA-6a-9具有抑制HIV-1复制早期和晚期双重阶段的作用特征,且其更倾向于抑制晚期阶段（IC50=0.32 μM）,与PF74活性相当（IC50=0.23 μM）。进一步的机制实验表明,IA-6a-9几乎不影响p24产量和体外CA装配。IA-6a-9的分子动力学模拟显示其与CA形成氢键的频率较低,这可能是其活性弱的原因之一。此外,IA-6a-9在人肝微粒体和血浆中的代谢稳定性与PF74相当或略有提升。总之,IA系列系统的构效关系（SAR）分析及分子动力学模拟结果,为下一轮化合物的结构优化提供了有益的指导。二、含苯磺酰胺的苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价第二章中IA系列的SAR分析和分子动力学模拟说明了氢键作用对于提升化合物活性的重要性。在本轮的结构改造中,我们通过基于靶标的药物设计,在PF74骨架基础上,首先将吲哚环替换为含有更多氢键供受体的苯磺酰胺得到ⅡA系列,再运用成环策略得到含苯并噻二嗪环的ⅡB系列,最后在ⅡB结构基础上运用骨架跃迁和生物电子等排策略得到含4-苯磺酰基哌嗪酮环的ⅡC系列,共计3个系列37个结构新颖的含苯磺酰胺的CA抑制剂。体外抗HIV-1实验结果显示,除了 ⅡA-31丧失活性外,其余所有衍生物对HIV-1 NL4-3均表现出中等至优异的抑制活性（EC50=90 nM～10.81μM）。通过从 ⅡA（EC50=5.61 μM～10.81 μM）到 ⅡB（EC50=2.11μM～5.96μM）再到 ⅡC 系列（EC50=90 nM～1.06 μM）的分层次结构优化,活性也得到逐步提升,验证了化合物设计的合理性。由此可见,哌嗪酮片段的引入是ⅡC系列具有高活性的关键。值得一提的是,ⅡC-31（EC50=90nM）作为本章抗病毒活性最好的CA抑制剂,是先导PF74（EC50=520nM）的近6倍。SPR实验显示,ⅡA-3a、ⅡA-3k、ⅡB-2a、ⅡB-2d对CA六聚体的结合亲和力（KD分别为11.80 μM、7.99 μM、1.19 μμM和1.30 μM）与其抗病毒活性趋势近乎一致,初步验证了 CA为其作用靶点。ⅡC-31对病毒复制的早期和晚期阶段均表现出最好的抑制活性（IC50分别为8.96 nM和0.24 μM）,其早期抑制活性是先导PF74（IC50=56nM）的6.25倍,这与二者的抗病毒活性水平差距一致（90 nM vs520 nM）。在ⅡA-3k、ⅡB-2a和ⅡC-31存在下,所产生的病毒p24含量相比对照DMSO仅略有改变。在体外CA装配实验中,ⅡA-3k、ⅡB-2a和ⅡC-31明显抑制了 CA的组装,而PF74则可以显着加快组装过程。此外,共晶结构显示ⅡC-31可以同时精准的结合到CA六聚体的6个相邻亚基界面,与PF74构象基本相同。ⅡC-31中新引入的哌嗪酮基团有较高的概率与Arg173、Lys70以及Gln63等形成额外氢键作用力,为其出色的抗病毒活性提供了合理的解释。随后对ⅡC-31 进行了初步的临床前成药性评价:首先,在人肝微粒体和血浆中,ⅡC-31相比PF74代谢稳定性略有提高;其次,在SD大鼠的体内药代动力学实验中,ⅡC-31表现出良好的体内PK性质和口服生物利用度（t1/2=1.2 h,F=23.0%）;最后,在昆明小鼠的急毒实验中,ⅡC-31在1000 mg/kg的单次灌胃剂量下无明显的急性毒性。综上,本研究验证了基于PF74的苯丙氨酸优势结构骨架,通过结构优化来提高化合物的抗病毒活性与成药性的可行性。ⅡC-31可以作为结构新颖的先导分子供进一步研究。三、香豆素酰胺类抗HIV-1 RNase H先导化合物的发现发挥药理活性的先导化合物是新药创制的物质基础,而基于化合物库的筛选是先导化合物发现的主要途径。特别是,本课题组经过多年积累获得的大量骨架新颖、结构多样且具有良好成药性的小分子,为表型筛选发现结构新颖的抗HIV先导化合物提供了物质保证。文献调研发现,羟基香豆素骨架具有RNase H抑制活性,同时香豆素及其衍生物可以发挥诸如抗病毒等药理活性。为了提高RNaseH抑制剂的命中率,同时降低活性筛选工作量,在本研究中,我们选取了 in-house化合物库中一类羟基香豆素酰胺类化合物（DW系列）,首先进行了细胞水平的抗HIV-1表型筛选。实验结果显示,DW-3、DW-4、DW-11、DW-25和DW-31对双突变株RES056的抑制活性（EC50 分别为 121.86 μM、101.15 μM、208.95 μM、28.56 μM 和 82.78μM）与野生株 ⅢB（EC50 分别为 113.32 μM、107.91 μM、213.06μM、19.63 μM和123.46μM）接近或相当,显示该类化合物具有显着的抗耐药潜力。分析还发现该类活性化合物符合经典的HIV-1 RNase H抑制剂药效团模型。于是进行了HIV-1RNase H抑制实验,结果显示DW-3、DW-4、DW-25、DW-31均能表现出不同水平的RNase H抑制活性（9.9 μM～68.5 μM）。以上实验结果表明此类化合物可通过作用于RNase H来发挥抗病毒活性。为了进一步提高香豆素类HIV-1 RNase H抑制剂的抗病毒活性,我们基于筛选发现的活性化合物结构,以药效团模型和RNaseH靶标结构为指导,综合运用骨架跃迁和生物电子等排策略设计合成了 36个结构新颖的香豆素类化合物。体外抗HIV-1实验显示有8个化合物表现出了不同水平的细胞活性（EC50=3.94μM～237.34 μM）,且细胞毒性极低（CC50>220 μM）。其中化合物ⅢB-2a活性最为突出,其抗HIV-1野生株活性（EC50=3.94 μM）是其他化合物的12～60倍,是先导化合物DW-4（EC50=101.15 μM）的近26倍。抗HIV-1突变株活性结果显示ⅢB-2a对5种单突变株抗耐药性良好,大多保持在个位数的耐药倍数（RF=1.43～11.27）,与上市药物依曲韦林（ETV）接近或相当（RF=0.85～4.09）,显着优于奈韦拉平（NVP）（RF=1.29～45.26）和依法韦仑（EFV）（RF=1.59～86.23）。随后的RNaseH抑制实验表明,在100 μM初筛浓度下,大部分化合物都表现出了中等及以上的靶标抑制率（57.4～87.2%）,此外,ⅢB-2a表现出了最优的RNase H抑制活性（IC50=12.3 μM）,初步验证了此类化合物可以通过抑制RNase H来发挥抗病毒作用。总之,IIIB-2a可以作为香豆素酰胺类抗RNase H先导化合物继续结构优化,以进一步提高活性和成药性。综上,本论文针对抗艾滋病临床疗法中存在的药物严重耐药性问题,从开发HIV-1新靶标——CA和RNase H抑制剂两方面入手,在基于结构的药物设计与化合物库表型筛选等药物设计和发现方法指导下,综合运用生物电子等排替换、骨架跃迁等药物化学策略,设计并合成了含三氮唑的、含苯磺酰胺的苯丙氨酸类HIV-1 CA抑制剂以及香豆素酰胺类HIV-1 RNase H抑制剂,共计6个系列112个结构全新的化合物。经细胞水平和酶水平的活性测试,以及人肝微粒体和血浆稳定性测试、大鼠PK实验等,发现了多个具有良好抗病毒活性和成药性的抗HIV-1先导化合物。本论文还成功解析了 ⅡC-31与CA六聚体的复合晶体结构,初步阐明了含哌嗪酮化合物发挥高效抗病毒活性的分子机制,为后续基于靶标的合理药物设计奠定了结构生物学基础。
安丽[4]（2021）在《F蛋白与SeNPC1在SeMNPV感染宿主吸附阶段及在对杆状病毒超感染排斥中的作用》文中提出甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）危害包括白菜、花椰菜、青菜等多种农作物,其分布广泛且具较强的、间歇性的爆发性,对农业经济造成严重损失。杆状病毒专一性感染节肢动物,致病性强且对人畜无害,作为生物杀虫剂广泛应用于防治森林和农作物害虫。甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV）作为环境友好型杀虫剂能有效控制甜菜夜蛾种群数量,利用SeMNPV对甜菜夜蛾进行生物防治备受关注。尽管病毒感染宿主通常造成宿主死亡,但某些情况下病毒不造成宿主死亡,而在宿主体内形成潜伏感染（Latent infection）。当潜伏感染细胞被相同或相似病毒二次感染时,对再次感染的病毒产生排斥,即超感染排斥（Superinfection exclusion）。该排斥机制的研究对抗病毒策略的开发具有重要意义。病毒吸附是病毒成功侵染宿主细胞的第一步。参与吸附的病毒蛋白与宿主细胞表面吸附受体的相互作用作为病毒感染的限速步骤,在病毒感染过程中具有重要作用。前期本实验室通过对SeMNPV无稀释传代建立了SeMNPV潜伏感染细胞株P8-Se301-C1,该细胞对同源SeMNPV具超感染排斥作用,但不影响异源苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,Ac MNPV）的再次感染,初步表明对SeMNPV超感染排斥在吸附阶段已产生。目前SeMNPV感染昆虫宿主细胞吸附侵染阶段机制,以及病毒吸附在超感染排斥机制中作用尚未阐明。本研究分别从病毒吸附蛋白及宿主细胞表面吸附受体两方面入手,研究SeMNPV病毒囊膜蛋白F蛋白和细胞受体SeNPC1在SeMNPV感染甜菜夜蛾细胞吸附阶段,以及P8-Se301-C1细胞对杆状病毒超感染排斥中的作用,阐明SeMNPV感染甜菜夜蛾细胞吸附阶段分子机制,初步解析P8-Se301-C1细胞对杆状病毒吸附阶段超感染排斥机制。主要研究结果如下:1.通过抗体封闭法封闭SeMNPV的F蛋白位点,病毒在Se301细胞表面的吸附量显着下降。此外,通过Bac-to-Bac系统,把Ac MNPV中的GP64蛋白替换为SeMNPV的F蛋白而构建出重组病毒v Ac WT-GP64KO-F,发现该重组病毒对Se301细胞的吸附能力显着高于野生型Ac MNPV。表明SeMNPV囊膜蛋白F蛋白不仅参与SeMNPV感染Se301细胞的吸附阶段,并且可在Ac MNPV感染Se301细胞的吸附阶段发挥重要作用。2.Ac MNPV在Se301及P8-Se301-C1细胞表面吸附量相当。而v Ac WT-GP64KO-F在P8-Se301-C1细胞表面的吸附量显着低于Se301细胞的,即,SeMNPV F蛋白替换Ac MNPV GP64后影响了P8-Se301-C1细胞对重组Ac MNPV的吸附,导致P8-Se301-C1细胞对异源病毒Ac MNPV在吸附阶段产生排斥。结果表明蛋白在P8-Se301-C1细胞对杆状病毒的超感染排斥中起着关键作用。3.免疫荧光实验结果发现在P8-Se301-C1细胞中未观察到F蛋白信号,表明P8-Se301-C1细胞中Se8转录本可能并没有翻译为F蛋白,P8-Se301-C1细胞对SeMNPV的超感染排斥并非由于F蛋白占据细胞表面吸附位点而影响二次入侵病毒吸附细胞所致。4.使用蛋白酶K和衣霉素处理Se301细胞后,SeMNPV吸附量显着下降,表明SeMNPV在Se301细胞表面的吸附受体本质为糖基化蛋白。以糖基化蛋白为筛选条件,在Se301细胞的转录组数据中挖掘并筛选获得受体相关蛋白NPC1（Niemann-Pick type C1）。无缝克隆Se301细胞Senpc1基因,生物信息学分析表明,Senpc1编码的SeNPC1蛋白为具有多个跨膜域的糖基化蛋白。5.利用NPC1抑制剂处理Se301细胞后影响SeMNPV吸附及子代病毒产量。其中,SeMNPV在细胞表面SeMNPV吸附量下降40.12%,BV产量下降约10倍,多角体产量下降94.28%。通过RNA干扰（RNA interfering）技术干扰Se301细胞中npc1转录本后,SeMNPV在细胞表面的吸附量下降44.76%,但总BV及多角体产量不受影响。以上结果表明SeNPC1蛋白参与SeMNPV感染Se301细胞的吸附阶段。6.对SeMNPV F蛋白及SeNPC1蛋白Domain C进行三级结构建模及分子对接分析,表明F蛋白与SeNPC1蛋白Domain C存在相互作用。该结果暗示F蛋白与SeNPC1分别作为病毒吸附蛋白与宿主吸附受体发生互作。荧光定量PCR检测表明,P8-Se301-C1细胞中Senpc1表达量较Se301细胞的下调5倍,推测Senpc1表达下调降低了SeMNPV对细胞的吸附,从而导致P8-Se301-C1对SeMNPV在吸附阶段的超感染排斥。
张君[5]（2021）在《Na+/K+ ATPaseβ3亚基对乙型肝炎病毒抑制作用及机制的研究》文中提出乙型肝炎病毒（HBV）感染导致全世界超过2.5亿人罹患多种肝病。每年有140万人死于与HBV相关的疾病,包括肝硬化,肝衰竭和肝细胞癌。目前,仅核苷酸类似物和干扰素（IFN）被批准用于治疗HBV感染的患者。HBV的基因组是一个3.2kb的部分双链松弛环状DNA基因组（rc DNA）,感染后,HBV基因组被传递到细胞核中并转化为共价闭合的环状DNA（ccc DNA）。ccc DNA依次形成一个微染色体,并用作转录不同病毒转录本的模板,包括3.5kb pre C mRNA和前基因组RNA（pg RNA）,两个包膜mRNA（2.4kb和2.1kb）和X mRNA（0.7kb）。在病毒转录物中,pre C mRNA编码前核心蛋白。pg RNA可翻译为病毒HBc和Pol蛋白,也可作为HBV基因组复制的模板。2.4kb和2.1kb的包膜mRNA编码LHBs,MHBs和SHBs蛋白。此外,0.7kb X mRNA可翻译产生HBx蛋白。四个启动子S1P,S2P,XP和CP调节和控制病毒前基因组RNA和蛋白质的转录。在宿主细胞质中发生病毒RNA转化为HBV蛋白后,病毒pg RNA被封装到核心颗粒中。在核心颗粒内部,pg RNA进一步逆转录为病毒DNA（ss DNA和ds DNA）。然后,将含有HBV DNA的成熟病毒颗粒包裹起来并从宿主细胞中释放出来。乙肝病毒颗粒和亚病毒颗粒是乙肝病毒复制过程中产生的主要病毒颗粒。乙型肝炎e抗原（HBe Ag）是HBc Ag的另一种形式,易位进入内质网腔进行蛋白水解加工,并以可溶性蛋白的形式分泌。虽然目前HBe Ag的功能仍然不明确,但是HBs Ag和HBe Ag被认为对HBV传播和临床诊断很重要。ATP1B3（也称为CD298）,是Na+/K+ATPase的三个调节性β亚基之一,于1998年被首次发现和鉴定。先前的研究表明,ATP1B3不仅参与了Na+/K+泵的活性,还可以调节T细胞活化的独立Na+/K+ATPase活性。近期研究表明Na+/K+ATPase的β亚基与某些病毒感染有关。例如ATP1B1被鉴定为人类巨细胞病毒（HCMV）UL136蛋白以及甲型和乙型流感病毒的M2蛋白的伴侣。此外,ATP1B3还可以减少Hela细胞中BST-2介导的人类免疫缺陷病毒1产生的限制。并且近期研究表明ATP1B3与肠病毒71（EV71）的3A蛋白相互作用,并通过增强I型干扰素的产生来抑制EV71复制。与此同时,BST-2被鉴定为是一种可诱导IFN的抗病毒蛋白,它阻止了各种包膜病毒的释放,例如HIV,Lassa,Marburg和埃博拉病毒。现有研究证明BST-2将新生的HBV病毒粒子束缚在质膜上。同时,通过酵母双杂交筛选鉴定了ATP1B3和BST-2存在相互作用。那么ATP1B3是否参与HBV的传播?以及ATP1B3和BST-2之间的关系是否与HBV的传播有关?本研究探讨ATP1B3对HBV复制的影响,并得出了以下的实验结果及结论:1.ATP1B3能够抑制HBV抗原的分泌。本研究将HBV感染性克隆质粒转染进Hep G2细胞中,同时转染ATP1B3表达质粒,通过ELISA的方法检测上清中HBs Ag的含量。通过与对照组对比,实验组HBs Ag含量明显减少。在Hep G2.2.15和Hep AD38细胞中过表达ATP1B3,同样能够减少细胞培养上清中HBs Ag的产生。相对地,在细胞中使用小干扰RNA和短发夹RNA介导ATP1B3的沉默,能够增加上清中HBs Ag的含量。同时,ATP1B3并未下调细胞内HBV复制中间体（HBV DNA）和转录本（HBV RNA）的含量。它表明ATP1B3能损害病毒蛋白的表达,但不能损害病毒复制和转录。以上结果说明,ATP1B3能够抑制HBV抗原的分泌。2.ATP1B3激活Hep G2细胞中的NF-κB信号传导通路。通过双萤光素酶报告基因检测Hep G2细胞中ATP1B3对NF-κB活化的影响。观察到ATP1B3以剂量依赖性方式激活NF-κB信号通路。核质分离实验证实ATP1B3诱导NF-κB亚基P65转运进核内。TAK1蛋白可以激活NF-κB。将TAK1转染到sh RNA介导的ATP1B3沉默的Hep G2中,NF-κB的激活受到强烈抑制。使用NF-κB抑制剂Bay11-7082证实了抑制NF-κB活性能显着降低HBs Ag的表达。推测ATP1B3可以通过激活NF-κB以抑制HBV。3.ATP1B3诱导IFN-α/ISGs和IL-6抑制HBV。ATP1B3上调Hep G2细胞中IFN-α和IL-6的表达。实时定量PCR的结果表明ATP1B3可以明显诱导OAS2和BST-2,但不能诱导ISG-15和ISG-56的表达。这些研究结果表明ATP1B3诱导的BST-2的表达可有助于对HBV抗原的抑制功能。进一步研究发现,与HEK293T细胞相比,Hep G2细胞中BST-2的表达被IFN-α显着上调。因此,以上研究表明,ATP1B3可以通过NF-κB/IFNs诱导BST-2,从而促进肝细胞对HBV的抑制。4.ATP1B3与BST-2合作促进HBs Ag限制抑制HBV。为了证明ATP1B3和BST-2在限制HBV方面的协同作用,我们研究了ATP1B3在BST-2阴性细胞HEK293T中对HBV的抑制作用。结果显示ATP1B3对BST-2阳性细胞Hep G2的HBs Ag产生的抑制作用强于BST-2阴性HEK293T细胞,表明BST-2可能是ATP1B3限制肝细胞中HBs Ag的合作者。5.ATP1B3促进蛋白酶体依赖的细胞内HBs Ag的降解。蛋白质印迹显示ATP1B3的过表达显着降低了LHBs,MHBs的细胞内蛋白水平,SHBs略有减少,Core蛋白则没有显示出任何下降。CHX追踪分析证实了ATP1B3的表达加速了细胞中HBs的降解。蛋白酶体抑制剂MG132能够明显抑制ATP1B3诱导的降解,并且呈剂量依赖性。6.ATP1B3与LHBs和MHBs在细胞中相互作用并共定位。通过免疫荧光分析研究了ATP1B3与HBV蛋白的共定位。作为跨膜蛋白,ATP1B3单独位于细胞膜上。当与LHBs和MHBs共表达时,ATP1B3在核周区域周围呈点状分布,并与LHBs和MHBs一起在细胞质中扩散,而HBc表现出聚集的胞质分布并且几乎与ATP1B3共定位。我们推测,ATP1B3由于与HBs相互作用将其从膜扩散到细胞质,从而被强力降解。ATP1B3跨膜区的缺失几乎导致ATP1B3不再与LHBs,MHBs和SHBs共定位。我们推测跨膜区域可能是负责HBs结合和降解的功能域。通过免疫共沉淀进一步确认了ATP1B3与HBs之间存在相互作用。7.ATP1B3诱导LHBs和MHBs的多聚泛素化。用泛素或靶向蛋白抗体染色时,当存在ATP1B3时,LHBs和MHBs的多泛素化程度要强于不存在ATP1B3的情况。我们还发现了在48位（K48）仅包含一个赖氨酸的泛素突变体足以用于ATP1B3介导的HBs泛素化。在使用阴性的泛素突变体后,完全阻断了ATP1B3介导的LHBs和MHBs的降解,这进一步证实ATP1B3介导的HBV包膜蛋白降解是蛋白酶体依赖性方式。综上所述,本研究运用分子生物学、病毒学等研究手段,证明了ATP1B3对HBV的抑制作用,并揭示了ATP1B3通过核因子κB（NF-κB）/IFN-α和NF-κB/白介素-6（IL-6）途径成为HBV复制的新型宿主限制子。此外,本研究证明了ATP1B3诱导其结合蛋白BST-2拮抗Hep G2细胞中的HBs Ag。同时,ATP1B3促进了蛋白酶体依赖性的HBV包膜蛋白的降解,并且通过第48位赖氨酸泛素化促使HBs加速降解。我们得出结论,ATP1B3作为一种新型抗病毒因子,可以采用多种机制来对抗HBV。我们的工作突出了ATP1B3可以作为HBV感染的潜在治疗靶标。
曾艳平[6]（2021）在《三种不同手术入路方式治疗脊柱交界区结核的临床疗效分析》文中指出背景:近几十年随着全球大量移民、HIV患者数量的增加及耐药菌株的传播,给全球结核病的防治带来了新的挑战。当前中国是全球结核病第二大国,患者数量占全球结核总数的17%,防控形势严峻。脊柱结核作为一种常见的肺外结核病,是骨与关节结核的最常见及最严重形式。该病不仅对患者生活质量造成不小负担,同时也加重了患者的社会和经济负担。脊柱交界区结核,是处于脊柱特殊区域的结核,其发生在脊柱应力过渡区,存在进展为脊柱后凸畸形并发截瘫的高风险,然而目前相关研究报道较少。脊柱交界区结核可分为:颅颈交界结核、颈胸交界结核、胸腰交界结核及腰骶交界结核,其中胸腰椎交界结核最为常见,颅颈交界结核最为少见。目前,脊柱交界区结核的治疗并无相关指南。一般认为,轻、中度脊柱交界结核可以通过保守治疗（即:抗结核化学疗法、全身营养支持、部分制动）达到治愈效果。对于合并脊柱不稳、神经功能损害、大面积椎旁脓肿、严重后凸畸形,以及耐药结核的患者,需要进行手术干预。外科手术根据入路的不同,可分为前入路手术、后入路手术及前后联合入路手术,且各手术方式有其适应症及优缺点。各脊柱交界区结核存在局部解剖结构、承力特点、病灶范围的不同,手术治疗方案尚无统一的共识及标准,而当前其手术治疗的相关研究少,严重影响着手术医生的决策。本研究通过三个部分研究三种不同手术入路方式治疗各脊柱交界区结核的临床疗效,并探讨各手术入路方式的适应症,以期能够帮助医道同仁选择合适的个体化手术治疗策略,为脊柱交界区结核的临床手术治疗和科研交流提供借鉴与参考。第一部分:三种不同手术入路方式治疗颈胸椎交界结核的临床疗效分析目的:评估三种不同手术入路方式治疗颈胸椎交界结核的临床疗效。方法:回顾性分析了我院在2004年9月至2019年9月期间行手术治疗的65例颈胸交界结核患者。根据手术入路的不同共分为三组:A组,前入路,共35例;B组,后入路,共18例;C组,前后联合入路,共12例。三组中共36例术前出现神经功能损伤。通过统计分析各组术前、术后及末次随访的Cobb角、VAS、ASIA、NDI、JOA等指标,以评估各组的临床疗效。结果:A组平均年龄、随访时间、住院时间分别为37.1±16.6 y、15.7±13.2 mon、21.4±9.7d,B组分别为26.4±12.9 y、21.8±13.0 mon、28.4±8.2 d,C组分别为31.3±15.9 y、23.4±12.8mon、26.3±6.8 d,各指标组间统计学上均无显着性差异（P>0.05）。各组手术时间、术中失血量,A组分别为244.4±117.6 min、373.4±433.7 ml,B组为218.0±47.0 min、222.2±134.2 ml,C组为374.8±43.6 min、741.7±281.1 ml。三组中C组失血量最大,手术时间最长,与A组、B组相比,统计学上均有显着差异（P<0.05）。术前、末次随访的ESR分别为:A组,42.9±23.5 mm/h、9.7±5.6 mm/h;B组,45.9±29.1 mm/h、5.7±3.1mm/h;C组,61.3±27.2 mm/h、6.3±3.4 mm/h。术前、术后及末次随访的Cobb角分别为:A组,15.7±10.6°、10.4±9.3°及11.0±7.7°;B组,19.8±7.7°、10.0±3.1°及11.0±3.2°;C组,13.8±5.3°、7.6±2.9°及8.3±2.8°。各组术后、末次随访的Cobb角明显改善,与各组术前相比,差异显着有统计学意义（P<0.05）。各组伴神经功能损伤的患者大部分于末次随访时有不同程度的改善。各组术后、末次随访的VAS评分与术前值比较,均明显降低（P<0.05）。同样,各组术后、末次随访的JOA和NDI值,与术前相比,数值均有明显改善（P<0.05）。第二部分:三种不同手术入路方式治疗胸腰交界区结核的临床疗效分析目的:评估三种不同手术入路方式治疗胸腰交界结核的临床疗效。方法:回顾性研究自2004年9月至2019年9月在我院行手术治疗的122例胸腰交界结核患者。根据手术入路的不同共分为三组:A组,前入路,共37例;B组,后入路,共57例;C组,前后联合入路,共28例。三组中共46例术前伴发神经功能损伤。通过统计分析各组术前、术后及末次随访的Cobb角、VAS、ASIA等指标,以评估各组的临床疗效。结果:各组中,平均年龄、随访时间、住院时间,A组分别为35.5±13.6 y、20.3±13.0 mon、22.4±4.7d,B组为42.5±15.6 y、18.8±13.7 mon、19.8±8.3 d,C组为35.7±14.2 y、23.4±10.6mon、27.5±10.9 d。A组平均手术时间为332.7±91.6 min,B组为319.4±137.0 min,C组为434.8±121.4 min,结果显示三组中C组平均手术时间最长,与A组、B组相比,统计学上有显着差异（P<0.05）。A组术中失血量为923.8±421.3 ml,B组为967.5±813.5ml,C组为1157.1±994.6 ml。术前、末次随访的ESR分别为:A组,53.9±25.0 mm/h、9.5±5.6 mm/h;B组,46.1±27.6 mm/h、12.4±11.9 mm/h;C组,49.2±27.0 mm/h、11.6±10.6mm/h。各组术前、术后及末次随访的Cobb角分别为:A组,22.8±8.8°、14.9±5.3°及18.3±6.3°;B组,21.5±10.8°、7.4±4.9°及10.3±5.4°;C组,23.4±14.7°、9.7±6.0°及12.8±7.6°。与术前相比,三组术后及末次随访的Cobb角有明显改善,差异显着且有统计学意义（P<0.05）。各组伴神经功能损伤的患者大部分于末次随访时有不同程度的改善。三组术后、末次随访的VAS评分与术前值比较,均明显降低（P<0.05）。第三部分:三种不同手术入路方式治疗腰骶交界区结核的临床疗效分析目的:评估三种不同手术入路方式治疗腰骶交界结核的临床疗效。方法:回顾性分析2004年4月至2020年4月期间在我院行手术治疗的72例腰骶交界结核患者。根据手术入路的不同共分为三组:A组,前入路,共34例;B组,后入路,共25例;C组,前后联合入路,共13例。三组共19例术前伴神经功能损伤。通过统计分析各组术前、术后及末次随访的Cobb角,VAS、ASIA等指标,以评估各组的临床疗效。结果:各组平均年龄、随访时间、住院时间,A组为37.4±13.3 y、16.6±14.8 mon、16.6±4.3d,B组为42.7±15.2 y、23.1±25.1 mon、26.3±6.8 d,C组为33.5±13.5 y、20.3±11.4 mon、23.6±7.6 d。各组手术时间、术中失血量,A组为181.2±77.2 min、375.3±271.4 ml,B组为320.0±169.1 min、910.0±861.9 ml,C组为454.1±154.3 min、1046.2±598.1 ml,结果显示三组中A组术中失血量最少、手术时间最短,与B、C组相比,统计学上有显着差异（P<0.05）。术前和末次随访的ESR分别为:A组,48.1±28.2 mm/h和13.3±16.3mm/h;B组,39.6±25.3 mm/h和21.0±22.5 mm/h;C组,52.8±32.3 mm/h和21.0±28.9mm/h。各组术前、术后及末次随访时的腰骶角分别为:A组,34.4±11.6°、36.7±6.5°及36.1±8.1°;B组,31.3±12.6°、34.6±7.8°及33.5±8.5°;C组,25.8±8.2°、34.3±6.8°及32.7±5.6°。而三组腰椎生理性前凸角（L1-S1）术前、术后及末次随访分别为:A组,45.0±14.7°、48.5±13.2°及47.6±12.5°;B组,40.2±16.2°、45.0±12.4°及43.7±13.7°;C组,31.8±15.6°、37.2±13.6°及36.5±13.2°。与术前相比,三组术后及末次随访的腰骶角和腰椎生理性前凸角有明显改善,差异显着且有统计学意义（P<0.05）。大部分伴神经功能损伤的患者在末次随访时有不同程度的改善。三组术后、末次随访的VAS评分与术前值进行比较,均明显降低（P<0.05）。结论:1、前路、后路及前后路联合手术入路均可有效治疗颈胸椎交界结核,后入路适应症狭窄,应选择性使用,前后路联合入路手术时间长、失血量大、创伤大、手术技能要求较高,需严格把握其适应症,而前入路疗效好且其适应症较广;2、对于胸腰椎交界区结核,三种手术入路均能实现病灶的清除、脊髓及神经根的减压、脊柱的稳定及后凸畸形的矫正和维持,后入路手术具有创伤小、手术时间短、住院时间短及适应症广的特点,而对于前方巨大脓肿、多节段病变及严重后凸畸形的患者,建议采用前后路联合手术;3、前入路手术治疗腰骶椎交界结核,其创伤小、手术时间短、失血量少、住院时间短且其适应症广,而对于严重后凸畸形或前中柱破坏严重仅通过前路难以有效固定的患者,建议采用前后路联合手术,对于病灶位于后柱而无前方大脓肿的患者可采用后路手术;4、单靠任一手术入路不能治疗所有脊柱交界区结核患者,每种入路方案都有其适应症,应在合理的抗结核药物治疗基础上,制定出个体化手术治疗方案,手术入路的选择应根据病变范围、一般情况及术者的熟悉程度综合考虑。
吕卉[7]（2020）在《甘肃省甘草病害及其对品质和产量的影响》文中认为甘草是甘肃省乃至我国重要的道地中药材之一,具有重要的药用、饲用及其食用价值。随着大面积连续多年的栽培,病害已经成为甘草生产的主要限制性因素之一。为明确甘肃省甘草主栽产区病害的发生、发展、危害病原与治理策略,本研究以甘肃省的河西瓜州县和陇中榆中县的乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis）为研究对象,于2014-2019年连续多年,开展了系列的温室、室内及田间试验,在确定病害种类及其病原菌的基础上,重点对主要病害的危害、发生规律、防治措施及其对品质和产量的影响等方面进行了研究,获得如下主要结果。1、通过对甘肃省17个县25个乡镇的栽培甘草的病害调查,共发现15种病害,其中真菌病害14种,寄生性菟丝子病害1种。发现世界新病害1种:外亚隔孢壳叶斑病（Xenodidymella glycyrrhizae sp.nov.）;世界新记录寄主病害2种:小光壳叶斑病（Leptosphaerulina australis）和田野菟丝子病害（Cuscuta campestris）;我国新记录寄主病害5种:黄萎病（Verticillium dahliae）、细交链格孢黑斑病（Alternaria alternata）、极细链格孢黑斑病（A.tenuissima）、菌核病（Sclerotium sp.）和葡柄霉叶斑病（Stemphylium sp.）。确定了主要病害:锈病（Uromyces glycyrrhizae）、细交链格孢黑斑病（A.alternata）、根腐病（Fusarium solani、F.oxysporum）和外亚隔孢壳叶斑病（X.glycyrrhizae）。2、通过连续3年的调查,进一步明确了锈病、细交链格孢黑斑病、根腐病和外亚隔孢壳叶斑病的发生规律。锈病在河西瓜州县始发于5月初,高峰期为6月和9月,最大病情指数分别为69.1和49.83;而在陇中榆中县锈病的发生较晚,始发期一般在6月初,8～9月出现一次发病高峰,最大病情指数为10.73。细交链格孢黑斑病在河西瓜州县和陇中榆中县均从6月中旬开始发病,8～9月达到高峰期,两地最大病情指数分别为14.59和26.12。根腐病在瓜州县和榆中县两地均有发生,其中8～9月为瓜州县根腐的高发期,最大病情指数为22.46,而榆中县根腐病发生轻微。外亚隔孢壳叶斑病仅在榆中县发生,该病于每年5月发生,于7月时达到病害高峰,最大病情指数为36.56。3、通过对田间取样与室内测试分析,明确了锈病、叶斑病和根腐病等主要病害对甘草产量和品质的影响。随着三种病害严重度的增加,其株高、根长、地上干重和地下干重均呈下降趋势,最高损失达45.3%、70.3%、75.7%和66.6%;与粗蛋白含量呈显着负相关（P<0.05）,最高可减少43.7%;而与粗纤维、中性和酸性洗涤纤维均呈显着正相关（P<0.05）,最高分别可增加44.0%,44.3%,50.2%;与根部甘草酸的含量呈显着负相关（P<0.05）,与根腐病根部甘草苷含量呈显着负相关（P<0.05）。不同病害的发生,对18种氨基酸的含量影响存在差异。4、通过室内杀菌剂筛选和田间评定,初步明确了主要病害的化学防治措施。室内杀菌剂筛选结果表明,30%苯甲·丙环唑EC对3种甘草叶斑类病原菌A.alternata,X.glycyrrhizae和L.australis的生长抑制作用最好,抑菌率达72%以上,其毒力EC50<0.2 mg/L。50%多菌灵对2种甘草根腐类病原F.oxysporium和F.solani的生长抑制效果较好,抑菌率均能达80%以上。在大田防治试验发现,25%粉锈宁WP2000～2500倍液、25%嘧菌酯SC1000倍液和43%戊唑醇SC3000倍液对甘草锈病防治率达81%以上;30%苯甲·丙环唑EC2000倍液、25%吡唑醚菌酯EC1500倍液、25%嘧菌酯SC1000倍液对黑斑病防治率达80%以上。
柳颖[8]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中研究表明目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
张慧敏[9]（2020）在《卤盐胁迫三株耐盐真菌群体感应抑制活性次生代谢产物研究》文中研究表明耐盐真菌是一类能够在高浓度的盐介质中仍能正常生长的微生物,具有独特的基因类型,高盐的特殊生存环境往往能够激活耐盐真菌某些特定的沉默基因,诱导一连串的微生物代谢途径,最终产生结构新颖的活性化合物。耐盐真菌作为药物发现的重要来源,近年来受到研究人员的广泛关注。细菌群体感应系统介导多种生物效应,可调控致病菌相关毒力因子的表达（促进病原菌胞外酶与毒素的产生、细菌运动、生物被膜的形成等）,作为开发抗感染药物的新靶点,受到了高度重视。从中华补血草、野生大豆、蔓荆及罗布麻的根、茎、叶、果实等组织及根际土中分离纯化得到152株耐盐真菌,分别编号为L1-L152。通过对耐盐真菌的海水条件下大米培养基发酵产物的薄层色谱分析（TLC）、高效液相色谱分析（HPLC）和群体感应（QS）抑制活性评价,发现其发酵产物的化学种类多样。本文采用不同的发酵方法对筛选得到的3株耐盐真菌（L129,L36,L130）进行大规模发酵,用乙酸乙酯提取菌株的次生代谢产物后,综合使用正相硅胶色谱、葡聚糖凝胶色谱（Sephadex LH-20）、中压制备色谱等柱色谱技术进行分离,高压半制备色谱和半制备高效液相色谱技术进行纯化。得到的化合物的结构通过红外光谱（IR）、紫外光谱（UV）、核磁共振（NMR）、圆二色谱（CD）和质谱（MS）等手段进行鉴定。本文共分离得到33个化合物,其中29个已鉴定其结构:peniquinone A和B（1和2）,penizofuran A（3）,quinadoline D和A（4和5）,3,4-dimethoxy-5-methylphenol（6）,orcinol（7）,1,3,5,6-tetrahydroxy-8-methylxanthone（8）,mucorisocoumarins A（9）,penicillic acid（10）,dihydropenicillic acid（11）,dechlorogriseofulvin（12）,griseofulvin（13）,isogriseofulvin（14）,dehydrogriseofulvin（15）,trans-capsaicin（16）,dihydrocapsaicin（17）,linoleic acid（18）,dibutylphthalate（19）,2,4-dihydroxy-5,6-dimethylbenzaldehyde（20）,4,5-dimethylbenzene-1,3-diol（21）,4,5,6-trimethylbenzene-1,3-diol（22）,2,4-dihydroxy-5,6-dimethylbenzoic acid（23）,asterric acid（24）,methyl dichloroasterrate（25）,dihydrogeodin（26）,iizukine B（27）,questin（28）,nafuredin A（29）,化合物1-4为新化合物。最后采用打孔法对部分化合物进行群体感应抑制（紫色杆菌CV026,Chromobacterium violaceum 026）活性测试,采用药敏片扩散法对部分化合物进行抗细菌（金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）活性测试及抗真菌（香蕉炭疽菌Colletotrichum musae ACCC31244、毛核炭疽菌Colletotrichum coccodes ACCC 36067、芒果采后炭疽病菌Colletotrichum asianum T0408、水稻稻瘟病菌Magnaporthe grisea ACCC 37631）活性测试,采用MTT法对部分化合物进行细胞毒（人乳腺癌细胞MCF-7,人肺癌细胞A549,人神经胶质瘤细胞U87,人前列腺癌细胞PC3）活性测试。活性测试结果显示,化合物1和2对MCF-7,U87和PC3细胞株均表现出较好的细胞毒性,IC50分别为12.39,9.01,14.59μM和25.32,13.45,19.93μM;化合物13和14对香蕉炭疽菌具有显着的抗真菌活性,MIC值均为0.1μg/片,化合物14也显示对毛核炭疽菌的抗真菌活性,MIC值为0.1μg/片;化合物2和8对紫色杆菌CV026的QS抑制活性均较弱,MIC值均为20μg/孔,化合物10为青霉酸,是经典的强群体感应抑制剂。
秦晓莲[10]（2020）在《病毒直接注射法制备转基因鸡的研究与优化》文中认为转基因动物自出现便引起了科学界的广泛关注,随着科学,医药的发展,转基因动物生物反应器如牛乳腺生物反应器得到了进一步的研究。鸡因其独特的生殖、鸡蛋内环境的稳定使得转基因鸡输卵管生物反应器成了药物蛋白生产理想的生物反应器。为了探究转基因鸡制备的方法,本研究进行了系统的研究。慢病毒载体显微注射法是制备转基因鸡的主要方法,为了探究影响显微注射转基因鸡孵化的因素,探究不同的开口位置对孵化率的影响,采取了钝端开口、赤道面开口的方式。结果显示:对照组孵化率90.00%;钝端开口组孵化率53.33%,赤道面组孵化率80.00%。可以看出,赤道面组孵化率明显高于钝端开口组。为了探究注射方式对鸡胚存活率、种蛋孵化率的影响,本实验进行了胚下腔、血管注射对比试验。结果如下:对照组孵化率93.33%;胚下腔注射组孵化率33.33%,血管注射组孵化率53.33%。可以看出,血管注射组孵化率明显高于胚下腔组。本研究设计了慢病毒载体,通过显微注射制备转基因鸡。采血后,通过Elisa鉴定,共有10只阳性鸡,但目的蛋白含量最高不超过100ng/m L。为了使鸡生产更多的目的蛋白且能够通过病毒载体法实现精准基因编辑鸡,本试验用腺病毒作为CRISPR/Cas9递送系统对鸡胚输卵管细胞、鸡胚成纤维细胞进行了敲入检测试验,尝试了将重组腺病毒直接注射到鸡胚中产生靶基因敲除鸡的方法,建立鸡CRISPR/Cas9重组腺病毒系统。通过提取转染了腺病毒CRISPR/Cas9的细胞基因组进行PCR扩增后,进行酶切,结果显示腺病毒递送CRISPR/Cas9在CEF中的靶向效率是40.7%。设计了三个供体腺病毒（HDR,HMEJ和MMEJ）,与CRISPR/Cas9-tale腺病毒共感染CEF,测定CEF中的敲入效率。通过实验发现HMEJ的敲入效率最高。为了探究将供体递送到插入部位的方法,以进一步提高KI效率,构建了Cas9和转录激活器样效应器（TALE）的融合蛋白,并通过PCR从具有TALE靶向序列的HMEJ供体中扩增出三种不同的-HMEJ供体即5’-Bait-HMEJ,Inside-BaitHMEJ,5’-Bait-HMEJ。通过单细胞PCR,发现Inside-Bait-HMEJ在鸡胚成纤维细胞中敲入效率最高。探究了Cas-TALE+HMEJ,Cas-TALE+Inside-Bait-HMEJ腺病毒在输卵管细胞的敲入效率,进行Western blot检测。实验表明:CasTALE+HMEJ,Cas-TALE+Inside-Bait-HMEJ都可以敲入输卵管细胞,使其产生目的蛋白,Elisa实验表明Cas-TALE+Inside-Bait-HMEJ的敲入效率更高。本试验通过慢病毒载体赤道面显微注射血管成功制备了转基因鸡,验证了腺病毒作为CRISPR/Cas9递送系统可以对鸡胚成纤维细胞、鸡输卵管细胞敲入,为以后转基因鸡的生产提供了参考。
二、不同培养方式对HIV产量的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同培养方式对HIV产量的影响（论文提纲范文）
（1）SHIV感染恒河猴体内产生针对HIV-1广谱中和抗体机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 艾滋病 |
| 1.1.1 艾滋病简介 |
| 1.1.2 艾滋病治疗方案研究进展 |
| 1.1.3 艾滋病疫苗研究进展 |
| 1.1.4 艾滋病疫苗的研究模型 |
| 1.2 抗HIV-1 广谱中和抗体 |
| 1.2.1 广谱中和抗体功能及表位 |
| 1.2.2 抗HIV-1 广谱中和抗体产生及进化机制研究 |
| 1.2.3 广谱中和抗体在艾滋病预防和治疗中的应用 |
| 1.3 抗HIV-1 广谱中和抗体的分离与评价技术 |
| 1.3.1 单克隆广谱中和抗体的分离 |
| 1.3.2 单克隆广谱中和抗体评价体系 |
| 1.4 立题依据及实验设计 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 实验设计 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 质粒与基因合成 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 恒河猴饲养及伦理审查 |
| 2.2.3 病毒载量检测 |
| 2.2.4 假病毒制备及TCID50 检测 |
| 2.2.5 免疫印迹法 |
| 2.2.6 中和实验 |
| 2.2.7 单点突变PCR |
| 2.2.8 单细胞流式分选 |
| 2.2.9 抗体可变区扩增 |
| 2.2.10 单克隆抗体表达 |
| 2.2.11 亲和层析纯化蛋白 |
| 2.2.12 酶联免疫吸附反应 |
| 2.2.13 生物膜干涉实验 |
| 2.2.14 单基因组扩增 |
| 2.2.15 抗体进化分析 |
| 2.2.16 抗原抗体结晶复合物结构分析 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 SHIV长期感染恒河猴模型的建立 |
| 3.1.1 SHIV攻毒策略 |
| 3.1.2 恒河猴体内病毒载量检测 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 SHIV感染恒河猴血浆中和抗体评价 |
| 3.2.1 血浆内抗体中和广谱度及强度评价 |
| 3.2.2 不同SHIVs感染恒河猴产生中和抗体广谱度对比 |
| 3.2.3 血浆内抗体中和表位评价 |
| 3.2.4 表位特异性中和抗体产生过程 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 SHIV感染恒河猴体内广谱中和抗体基因分离 |
| 3.3.1 表位特异性记忆B细胞分选 |
| 3.3.2 抗体可变区基因扩增 |
| 3.3.3 抗体可变区基因谱系分析 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 单克隆抗体表达与纯化 |
| 3.4.1 建立单克隆抗体线性表达体系 |
| 3.4.2 小量表达抗体检测抗原结合活性 |
| 3.4.3 完整抗体表达质粒构建及大量表达单克隆抗体 |
| 3.4.4 小结 |
| 3.5 单克隆抗体中和能力评价 |
| 3.5.1 Small global panel评价抗体中和能力 |
| 3.5.2 Large global panel评价抗体中和能力 |
| 3.5.3 小结 |
| 3.6 中和抗体谱系分析 |
| 3.6.1 抗体可变区谱系来源分析 |
| 3.6.2 抗体进化及脱靶抗体分析 |
| 3.6.3 小结 |
| 3.7 J038 谱系抗体中和表位分析 |
| 3.7.1 J038 谱系抗体表位内氨基酸依赖性分析 |
| 3.7.2 J038 谱系抗体结合抗原形式分析 |
| 3.7.3 小结 |
| 3.8 抗原-抗体复合物晶体结构分析 |
| 3.8.1 Cryo-EM揭示J038 结合Env的 V2 区域 |
| 3.8.2 Env-J038 结合V2 区氨基酸位点分析 |
| 3.8.3 Env-J038 结合V2 区糖基化位点分析 |
| 3.8.4 小结 |
| 3.9 J038 谱系抗体进化过程分析 |
| 3.9.1 推测抗体共同祖先及中间过渡体 |
| 3.9.2 共同祖先及中间过渡体抗原亲和力检测 |
| 3.9.3 共同祖先及中间过渡体中和能力检测 |
| 3.9.4 共同祖先及中间过渡体与Env相互作用界面分析 |
| 3.9.5 小结 |
| 3.10 中和抗体与病毒共进化分析 |
| 3.10.1 SHIV感染恒河猴体内病毒变异程度分析 |
| 3.10.2 病毒包膜蛋白突变对血浆中间抗体的影响 |
| 3.10.3 病毒包膜蛋白V2 区突变对单克隆中和抗体的影响 |
| 3.10.4 小结 |
| 3.11 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）文冠果种子特性变异及优良砧用种源选择（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 文冠果研究概述 |
| 1.2.1 文冠果生物学特性 |
| 1.2.2 文冠果地理分布 |
| 1.2.3 文冠果综合价值 |
| 1.2.4 文冠果繁殖技术 |
| 1.3 植物种质资源研究进展 |
| 1.3.1 植物种质资源的含义 |
| 1.3.2 种质收集状况及意义 |
| 1.3.3 种质资源评定与利用 |
| 1.4 地理变异与种源试验研究进展 |
| 1.4.1 地理种源变异的研究 |
| 1.4.2 种源试验研究 |
| 1.5 早期选择的相关研究 |
| 1.5.1 苗木早期选择的意义 |
| 1.5.2 苗木早期选择的可行性 |
| 1.5.3 苗木早期选择年龄的确定 |
| 1.5.4 苗木早期选择的方法 |
| 1.5.5 苗木生长与环境因子 |
| 1.6 ASReml和 GGE双标图应用研究 |
| 1.6.1 ASReml的应用研究 |
| 1.6.2 GGE双标图的应用研究 |
| 1.7 研究意义与内容 |
| 1.7.1 研究目的与意义 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 1.7.3 技术路线 |
| 2 文冠果种子品质特性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 实验试剂和仪器 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.4 环境数据测定 |
| 2.1.5 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同种源文冠果油脂特性研究 |
| 2.2.2 不同种源文冠果营养特性研究 |
| 2.2.3 文冠果种子品质特性熵值法评价 |
| 2.3 小结 |
| 3 文冠果种子形态和发芽特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.3 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同种源文冠果种子形态和质量指标分析 |
| 3.2.2 不同种源文冠果种子发芽能力指标分析 |
| 3.2.3 文冠果种子生物学特性相关性分析 |
| 3.2.4 文冠果种子形态和发芽特性地理变异规律 |
| 3.2.5 文冠果种子形态和发芽特性熵值法分析 |
| 3.3 小结 |
| 4 文冠果苗期评价及早期选择 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验地点 |
| 4.1.2 试验材料和设计 |
| 4.1.3 统计分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同种源文冠果在三个试验地点的苗期生长状况观测 |
| 4.2.2 不同种源文冠果在三个试验地点的BLUP-GGE分析 |
| 4.2.3 文冠果苗期生长指标的相关性 |
| 4.2.4 文冠果苗期生长性状的聚类分析 |
| 4.2.5 文冠果苗期生长性状育种值分析 |
| 4.3 小结 |
| 5 文冠果砧木造林表现 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验地点 |
| 5.1.2 试验材料 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.1.4 指标测定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 文冠果不同嫁接组合亲和性的表现 |
| 5.2.2 文冠果不同嫁接组合生长表现 |
| 5.2.3 文冠果不同嫁接组合生理指标测定 |
| 5.2.4 文冠果不同嫁接组合果实表型和产量测定 |
| 5.2.5 不同种源砧木综合评价 |
| 5.3 小结 |
| 6 讨论 |
| 6.1 文冠果种质资源评价 |
| 6.2 文冠果种源×试验地互作效应研究 |
| 6.3 文冠果砧木嫁接新品种研究 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（3）新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂和RNase H抑制剂的设计、合成与生物活性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 艾滋病与HIV病毒 |
| 一、艾滋病及其流行现状 |
| 二、HIV-1病毒结构 |
| 三、HIV-1生命周期 |
| 四、抗艾滋病化学治疗 |
| 第二节 HIV-1衣壳蛋白:抗病毒药物研究新靶标 |
| 一、HIV-1衣壳蛋白的结构和功能 |
| 二、HIV-1衣壳蛋白抑制剂研究进展 |
| 三、HIV-1 CA六聚体相邻亚基NTD-CTD界面:作为药物设计新靶标的优势 |
| 第三节 HIV-1 RNase H:抗病毒药物研究新靶标 |
| 一、HIV-1 RNase H的结构和功能 |
| 二、HIV-1 RNase H抑制剂研究进展 |
| 第四节 抗病毒先导化合物的发现和结构优化策略 |
| 一、先导化合物发现策略 |
| 二、先导化合物优化策略 |
| 第五节 本章小结 |
| 第二章 含三氮唑的苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价 |
| 第一节 目标化合物的设计 |
| 第二节 目标化合物的合成 |
| 一、仪器与试剂 |
| 二、目标化合物的合成路线 |
| 三、目标化合物的合成步骤 |
| 四、合成实验讨论 |
| 第三节 目标化合物的活性评价 |
| 一、体外抗HIV-1活性实验 |
| 二、化合物与HIV-1衣壳蛋白相互作用研究 |
| 三、化合物抗HIV-1作用阶段确证实验 |
| 四、衣壳蛋白(p24)含量测定实验 |
| 五、体外衣壳蛋白装配实验 |
| 第四节 化合物在体外人肝微粒体和人血浆代谢稳定性评价 |
| 一、化合物在人肝微粒体中的代谢稳定性研究 |
| 二、化合物在人血浆中的代谢稳定性研究 |
| 第五节 分子动力学模拟研究 |
| 第六节 本章小结 |
| 第三章 含苯磺酰胺的苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价 |
| 第一节 目标化合物的设计 |
| 第二节 目标化合物的合成 |
| 一、仪器与试剂 |
| 二、目标化合物的合成路线 |
| 三、目标化合物的合成步骤 |
| 四、合成实验讨论 |
| 第三节 目标化合物的活性评价 |
| 一、体外抗HIV活性实验 |
| 二、化合物与HIV-1衣壳蛋白相互作用研究 |
| 三、化合物抗HIV-1作用阶段确证实验 |
| 四、衣壳蛋白(p24)含量测定实验 |
| 五、体外衣壳蛋白装配实验 |
| 六、体外逆转录酶抑制实验 |
| 第四节 分子动力学模拟与蛋白共晶结构研究 |
| 一、IIA-3k和IIB-2a的分子动力学研究 |
| 二、IIC-31与HIV-1 CA初步的共晶结构研究 |
| 第五节 IIC-31的初步成药性评价 |
| 一、体外人肝微粒体和人血浆稳定性实验 |
| 二、急性毒性实验 |
| 三、临床前药代动力学实验 |
| 第六节 本章小结 |
| 第四章 香豆素酰胺类抗HIV-1 RNase H先导化合物的发现 |
| 第一节 表型筛选发现香豆素酰胺类HIV-1 RNase H抑制剂 |
| 一、抗HIV活性筛选 |
| 二、初步作用机制研究 |
| 第二节 新型香豆素酰胺类HIV-1 RNase H抑制剂的设计 |
| 第三节 目标化合物的合成 |
| 一、仪器与试剂 |
| 二、目标化合物的合成路线 |
| 三、目标化合物的合成步骤 |
| 第四节 目标化合物的生物活性评价 |
| 一、体外抗HIV活性实验 |
| 二、RNaseH抑制实验 |
| 第五节 分子模拟研究 |
| 第六节 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 第一节 总结 |
| 一、基于结构的新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价 |
| 二、表型筛选发现香豆素酰胺类HIV-1 RNase H苗头化合物及其结构优化 |
| 三、本论文创新点 |
| 四、本论文不足之处 |
| 第二节 展望 |
| 一、对本课题的进一步研究思路 |
| 二、新一代抗艾滋病药物的研究趋势 |
| 参考文献 |
| 附录-部分代表性化合物谱图 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间科研及奖励情况 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）F蛋白与SeNPC1在SeMNPV感染宿主吸附阶段及在对杆状病毒超感染排斥中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒及其分类 |
| 1.1.2 杆状病毒的应用 |
| 1.1.3 杆状病毒的生活周期及感染细胞过程中主要功能基因 |
| 1.2 病毒的隐性感染 |
| 1.2.1 隐性感染 |
| 1.2.2 病毒的超感染排斥及研究意义 |
| 1.2.3 病毒超感染排斥的机制 |
| 1.2.4 昆虫病毒的超感染排斥及其机制 |
| 1.3 超感染排斥研究目的与意义 |
| 1.4 病毒受体及NPC1 |
| 1.4.1 病毒入侵宿主细胞 |
| 1.4.2 昆虫NPC1 概述 |
| 1.4.3 NPC1 在病毒侵染宿主细胞过程中的作用 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 F蛋白在病毒吸附阶段及P8-Se301-C1 对杆状病毒超感染排斥中的作用 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 P8-Se301-C1 细胞对SeMNPV超感染排斥发生在吸附阶段的验证 |
| 2.2.2 SeMNPV F蛋白对宿主Se301 细胞表面SeMNPV BV吸附量的影响 |
| 2.2.3 F蛋白在P8-Se301-C1 细胞对杆状病毒超感染排斥中的作用 |
| 2.2.4 P8-Se301-C1 细胞中Se8 转录未翻译为F蛋白参与超感染排斥 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 P8-Se301-C1 对 Se MNPV 超感染排斥发生在吸附阶段 |
| 2.3.2 囊膜蛋白F参与SeMNPV感染甜菜夜蛾细胞Se301 的吸附和膜融合两个阶段 |
| 2.3.3 Ac MNPV在不同昆虫细胞表面吸附量不同 |
| 2.3.4 F蛋白参与P8-Se301-C1 细胞对杆状病毒吸附阶段的超感染排斥 |
| 2.3.5 P8-Se301-C1 细胞中的Se8 转录本未翻译为F蛋白 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 宿主Se301 细胞表面SeMNPV病毒受体本质的鉴定 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验设备 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 神经氨酸酶、蛋白酶K及衣霉素药物使用浓度筛选 |
| 3.2.2 SeMPV BV感染宿主细胞吸附的受体本质为蛋白质 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 甜菜夜蛾 SeNPC1 蛋白在SeMNPV感染甜菜夜蛾 Se301 细胞中的作用 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验设备 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 甜菜夜蛾Senpc1 基因的克隆鉴定 |
| 4.2.2 甜菜夜蛾SeNPC1 的生物信息学分析 |
| 4.2.3 SeNPC1在SeMNPV感染Se301 细胞中的作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 甜菜夜蛾Senpc1 鉴定及分析 |
| 4.3.2 甜菜夜蛾SeNPC1 参与SeMNPV感染Se301 细胞的吸附阶段 |
| 4.3.3 SeNPC1 可能参与P8-Se301-C1 细胞对SeMNPV吸附阶段的超感染排斥 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 SeMNPV F蛋白与SeNPC1 的生物信息学互作分析 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 F蛋白与SeNPC1 蛋白三级结构建模 |
| 5.2.2 SeMNPV F蛋白与SeNPC1 Domain C蛋白模型质量评估分析 |
| 5.2.3 F蛋白与SeNPC1 蛋白Domain C分子对接及相互作用分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间主要研究成果 |
（5）Na+/K+ ATPaseβ3亚基对乙型肝炎病毒抑制作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 背景知识 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 ATP1B3与BST-2 |
| 1.1.3 NF-κB信号通路 |
| 1.1.4 泛素化降解 |
| 1.2 论文设计 |
| 1.2.1 论文目的和意义 |
| 1.2.2 实验思路及方案设计 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要试剂与材料 |
| 2.1.3 质粒与细胞系 |
| 2.1.4 引物合成及测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒过表达载体构建 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞复苏、传代与转染 |
| 2.2.4 稳转细胞系的构建 |
| 2.2.5 短干扰RNA(si RNA)的化学合成及转染 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR(q PCR) |
| 2.2.8 Southern blot检测HBV核心颗粒DNA |
| 2.2.9 Northern blot检测HBV RNA |
| 2.2.10 核质分离 |
| 2.2.11 免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) |
| 2.2.13 免疫荧光共定位 |
| 2.2.14 Luciferase双荧光报告实验 |
| 2.2.15 统计学方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 ATP1B3 抑制HBV的表达 |
| 3.1.1 HepG2 细胞中外源ATP1B3 抑制HBV抗原的产量 |
| 3.1.2 HepG2 细胞中梯度过表达的外源ATP1B3使HBV抗原的产量梯度减少 |
| 3.1.3 HepG2 细胞中过表达ATP1B3对HBV抗原的产量减少不存在非特异性 |
| 3.1.4 HepG2 细胞中下调内源ATP1B3 的表达能够增加HBV抗原的分泌 |
| 3.1.5 HepG2.2.15和Hep AD38 细胞中外源ATP1B3 抑制HBV抗原的产量 |
| 3.1.6 HepG2.2.15和Hep AD38 细胞中下调内源ATP1B3 的表达增加HBV抗原的分泌 |
| 3.1.7 过表达ATP1B3 不影响HBV的 DNA和 RNA |
| 3.1.8 小结 |
| 3.2 ATP1B3 激活HepG2 细胞中的NF-κB信号通路 |
| 3.2.1 过表达ATP1B3 以剂量依赖性的方式激活NF-κB信号通路 |
| 3.2.2 过表达ATP1B3 促进磷酸化p65 向核内转移 |
| 3.2.3 ATP1B3 的敲低减弱了TAK1对NF-κB的激活 |
| 3.2.4 抑制NF-κB信号通路会削弱ATP1B3对HBV的抑制作用 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 ATP1B3 通过诱导IFN-α/ISG和 IL-6 的产生抑制HBV |
| 3.3.1 过表达ATP1B3 诱导IFN-α和 IL-6 的产生 |
| 3.3.2 过表达ATP1B3 诱导ISGs表达增加 |
| 3.3.3 IFN-α诱导BST-2 的表达 |
| 3.3.4 敲低 ATP1B3使BST-2 的表达降低 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 ATP1B3与BST-2 协作促进对HBs Ag的限制 |
| 3.4.1 ATP1B3 独立于BST-2 抑制HBV |
| 3.4.2 使用NF-κB抑制剂能够减弱ATP1B3 诱导的BST-2 表达 |
| 3.4.3 过表达BST-2 促进了ATP1B3对HBs Ag的抑制 |
| 3.4.4 敲低BST-2使ATP1B3对HBs Ag的抑制减弱 |
| 3.4.5 小结 |
| 3.5 ATP1B3 促进蛋白酶体依赖的细胞内HBs Ag降解 |
| 3.5.1 鉴定ATP1B3 限制HBV需要的功能区 |
| 3.5.2 ATP1B3对HBV的抑制不依赖于其Na~+/K~+ATP酶的活性 |
| 3.5.3 ATP1B3 影响HBV蛋白水平 |
| 3.5.4 ATP1B3使HBV的 S蛋白表达减少 |
| 3.5.5 ATP1B3 加速HBs的降解 |
| 3.5.6 ATP1B3 通过蛋白酶体途径降解HBs |
| 3.5.7 ATP1B3 突变体降解HBs |
| 3.5.8 小结 |
| 3.6 ATP1B3与LHBs和 MHBs在细胞中相互作用并共定位 |
| 3.6.1 ATP1B3与HBs共定位 |
| 3.6.2 ATP1B3与HBS存在相互作用 |
| 3.6.3 HBs与 ATP1B3 存在相互作用 |
| 3.6.4 小结 |
| 3.7 ATP1B3 诱导LHBs和 MHBs的多聚泛素化 |
| 3.7.1 ATP1B3 诱导HBs的多聚泛素化 |
| 3.7.2 ATP1B3 通过K48 诱导HBs的泛素化 |
| 3.7.3 ATP1B3 降解HBs需要泛素化 |
| 3.7.4 小结 |
| 3.8 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）三种不同手术入路方式治疗脊柱交界区结核的临床疗效分析（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 三种不同手术入路方式治疗颈胸交界区结核的临床疗效 |
| 2.1 背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 典型病例 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 三种不同手术入路方式治疗胸腰交界区结核的临床疗效分析 |
| 3.1 背景 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 典型病例 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 三种不同手术入路方式治疗腰骶交界区结核的临床疗效分析 |
| 4.1 背景 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 典型病例 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 耐药结核研究新进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 结核疫苗研发新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）甘肃省甘草病害及其对品质和产量的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 甘草的概述 |
| 2.1.1 甘草的命名和分类 |
| 2.1.2 甘草的形态特征和分布 |
| 2.1.3 甘草的生态学特性 |
| 2.1.4 甘草的化学成分和药理作用 |
| 2.1.5 甘草的用途 |
| 2.1.6 甘草的栽培 |
| 2.2 甘草真菌病害的研究进展 |
| 2.2.1 甘草真菌病害的研究历史 |
| 2.2.2 甘草真菌病害及其病原种类 |
| 2.2.3 其它潜在微生物 |
| 2.2.4 甘草病害的发生与发展规律 |
| 2.2.5 甘草属病害防治 |
| 第三章 甘草病害调查和病原鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 调查地点 |
| 3.2.2 病害调查和采样 |
| 3.2.3 病原菌的分离纯化 |
| 3.2.4 病原菌的鉴定 |
| 3.2.5 致病性测定 |
| 3.2.6 其它病害 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 甘草病害种类 |
| 3.3.2 甘草主要病害和病原 |
| 3.3.3 其它菌株对甘草影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 甘草主要病害发生规律 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 病害及定点调查点的选择 |
| 4.2.2 气象数据收集 |
| 4.2.3 病害调查 |
| 4.2.4 数据处理与分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 甘草锈病的发生规律 |
| 4.3.2 甘草黑斑病的发生规律 |
| 4.3.3 甘草根腐病的发生规律 |
| 4.3.4 甘草外亚隔孢壳叶斑病的发生规律 |
| 4.3.5 甘草主要病害发生和环境因素的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 主要病害对甘草产量、品质的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 样地及采集病株 |
| 5.2.2 株高和生物量的测定 |
| 5.2.3 常规营养成分的测定 |
| 5.2.4 无机元素的测定 |
| 5.2.5 甘草酸和甘草苷的测定 |
| 5.2.6 氨基酸的测定 |
| 5.2.7 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 病害对甘草株高、根长及生物量的影响 |
| 5.3.2 病害对甘草常规营养成分的影响 |
| 5.3.3 病害对甘草无机元素含量的影响 |
| 5.3.4 病害对甘草酸和甘草苷的影响 |
| 5.3.5 不同病害甘草产量和品质的变化率 |
| 5.3.6 病害对甘草氨基酸的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 杀菌剂防治甘草病害的初步研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 室内杀菌剂筛选 |
| 6.2.1.1 供试菌株 |
| 6.2.1.2 供试杀菌剂 |
| 6.2.1.3 杀菌剂及培养基的配制 |
| 6.2.1.4 测量方法 |
| 6.2.2 田间杀菌剂药效试验 |
| 6.2.3 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 室内杀菌剂筛选 |
| 6.3.2 田间杀菌剂筛选 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论与创新 |
| 7.1 主要结论与讨论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 后续工作 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 资助项目 |
| 在校期间的研究成果及获得奖励 |
| 致谢 |
（8）杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（9）卤盐胁迫三株耐盐真菌群体感应抑制活性次生代谢产物研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 耐盐真菌的分离纯化与筛选 |
| 材料与方法 |
| 1 实验仪器 |
| 2 实验材料与试剂 |
| 3 培养基及其成分 |
| 4 耐盐真菌的分离纯化 |
| 5 耐盐真菌的发酵与筛选 |
| 结果 |
| 1 耐盐真菌的获得 |
| 2 耐盐真菌发酵粗提物的筛选 |
| 讨论 |
| 第二部分 耐盐真菌Penicillium sp.L129 的次生代谢产物研究 |
| 材料与方法 |
| 1 实验仪器 |
| 2 实验材料与试剂 |
| 3 耐盐真菌Penicillium sp.L129 的发酵 |
| 4 耐盐真菌Penicillium sp.L129 次生代谢产物的提取分离 |
| 5 化合物的活性评价 |
| 结果 |
| 1 化合物结构解析 |
| 2 化合物的理化性质和波谱数据 |
| 3 QS抑制活性评价 |
| 4 抗真菌活性评价 |
| 5 细胞毒活性评价 |
| 讨论 |
| 第三部分 耐盐真菌Aspergillus flavipes L36 发酵条件优化及次生代谢产物研究 |
| 材料与方法 |
| 1 实验仪器 |
| 2 实验材料与试剂 |
| 3 耐盐真菌Aspergillus flavipes L36 的发酵条件探究 |
| 4 耐盐真菌Aspergillus flavipes L36 的发酵 |
| 5 耐盐真菌Aspergillus flavipes L36 次生代谢产物的提取分离 |
| 结果 |
| 1 化合物结构解析 |
| 2 化合物的理化数据及波谱数据 |
| 讨论 |
| 第四部分 耐盐真菌L130发酵条件优化及次生代谢产物研究 |
| 材料与方法 |
| 1 实验仪器 |
| 2 实验材料与试剂 |
| 3 耐盐真菌L130的发酵 |
| 4 耐盐真菌L130次生代谢产物的提取分离 |
| 结果 |
| 1 化合物结构解析 |
| 2 化合物的理化数据及波谱数据 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）病毒直接注射法制备转基因鸡的研究与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 动物转基因研究综述 |
| 1.2 转基因动物技术 |
| 1.3 转基因鸡研究进展 |
| 1.4 动物生物反应器 |
| 1.5 转基因鸡生物反应器研究进展 |
| 1.6 转基因鸡生物反应器的优势与应用价值 |
| 1.7 慢病毒研究简介 |
| 1.8 腺病毒 |
| 1.9 基因编辑简介 |
| 1.10 传统的基因编辑手段 |
| 1.10.1 锌指核酸酶(ZFN) |
| 1.10.2 转录激活物样效应核酸酶(TALEN) |
| 1.11 CRISPR-CAS9 系统的演化 |
| 1.12 CRISPR-Cas9 最新发展 |
| 1.12.1 基因功能的筛选 |
| 1.12.2 诊断和基因治疗的细胞和动物模型的建立 |
| 1.12.3 利用融合蛋白进行转录研究 |
| 1.12.4 基因组的荧光成像 |
| 1.12.5 抗菌和抗病毒应用 |
| 1.13 CRISPR-CAS9 系统未来发展 |
| 1.14 研究目的与意义 |
| 第二章 慢病毒注射法制备转基因鸡 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 种蛋来源 |
| 2.1.2 主要实验材料与仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 开口位置对孵化率的影响 |
| 2.2.2 注射方式对孵化率的影响 |
| 2.2.3 Her-2慢病毒载体注射 |
| 2.3 慢病毒载体转入检测 |
| 2.3.1 组织荧光观察 |
| 2.3.2 鸡血采集 |
| 2.3.3 血细胞基因组提取 |
| 2.3.4 凝胶电泳检测 |
| 2.3.5 PCR检测 |
| 2.3.6 血清Elisa检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 开口位置对孵化率的影响 |
| 2.4.2 注射方式对孵化率的影响 |
| 2.4.3 慢病毒注射制备嵌合体鸡 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 用腺病毒作为CRISPR/Cas9 递送系统对鸡胚成纤维细胞与输卵管细胞敲入检测 |
| 前言 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 种蛋来源 |
| 3.1.2 主要实验材料与仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 腺病毒递送CRISPR/CAS9在CEF中的靶向效率的检测 |
| 3.2.1 原代鸡胚成纤维细胞的培养 |
| 3.2.2 细胞传代 |
| 3.2.3 细胞冻存 |
| 3.2.4 病毒转染 |
| 3.2.5 提取转染细胞基因组 |
| 3.2.6 PCR扩增 |
| 3.2.7 PCR产物回收于纯化 |
| 3.2.8 酶切 |
| 3.3 CRISPR/Cas9 腺病毒与三种供体腺病毒感染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 3.3.1 病毒转染 |
| 3.3.2 单细胞PCR检测细胞KI效率 |
| 3.4 三种不同的-HMEJ供体5'-Bait-HMEJ,Inside-Bait-HMEJ,5'-Bait-HMEJ敲入效率检测 |
| 3.4.1 敲入效率检测 |
| 3.5 CRISPR/Cas9 腺病毒在输卵管细胞的敲入 |
| 3.5.1 鸡原代输卵管细胞的培养 |
| 3.5.2 病毒转染鸡原代输卵管细胞 |
| 3.5.3 Western blot检测 |
| 3.5.4 Elisa实验 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.6.1 腺病毒递送CRISPR/CAS9在CEF中的靶向效率的检测 |
| 3.6.2 不同腺病毒供体在CEF中敲入检测 |
| 3.6.3 不同-HMEJ供体在CEF中敲入检测 |
| 3.6.4 CRISPR/Cas9 腺病毒在输卵管细胞的敲入检测 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士阶段研究成果 |
四、不同培养方式对HIV产量的影响（论文参考文献）
- [1]SHIV感染恒河猴体内产生针对HIV-1广谱中和抗体机制的研究[D]. 高楠. 吉林大学, 2021(01)
- [2]文冠果种子特性变异及优良砧用种源选择[D]. 麻云霞. 内蒙古农业大学, 2021
- [3]新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂和RNase H抑制剂的设计、合成与生物活性评价[D]. 孙林. 山东大学, 2021(11)
- [4]F蛋白与SeNPC1在SeMNPV感染宿主吸附阶段及在对杆状病毒超感染排斥中的作用[D]. 安丽. 贵州师范大学, 2021(12)
- [5]Na+/K+ ATPaseβ3亚基对乙型肝炎病毒抑制作用及机制的研究[D]. 张君. 吉林大学, 2021(01)
- [6]三种不同手术入路方式治疗脊柱交界区结核的临床疗效分析[D]. 曾艳平. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [7]甘肃省甘草病害及其对品质和产量的影响[D]. 吕卉. 兰州大学, 2020
- [8]杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制[D]. 柳颖. 浙江大学, 2020(01)
- [9]卤盐胁迫三株耐盐真菌群体感应抑制活性次生代谢产物研究[D]. 张慧敏. 青岛大学, 2020(01)
- [10]病毒直接注射法制备转基因鸡的研究与优化[D]. 秦晓莲. 广西大学, 2020(02)