一、犬小肠缺血再灌注后一氧化氮和超氧化物歧化酶的改变及肝脏中凋亡基因的表达（论文文献综述）
张世龙[1]（2021）在《杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中指出目的:明确杜仲桃叶珊瑚苷（AU）对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）的保护效应;并通过体内、体外实验对其保护机制进行深入探讨。方法:1.明确杜仲AU是否通过抗炎、抗氧化发挥对HIRI的保护效应。40只雄性SD大鼠（SPF级）随机分为5组,每组8只。分别设假手术组（Sham）,杜仲AU低剂量组（AU-L）、中剂量组（AU-M）、高剂量组（AU-H）及缺血再灌注损伤组（IRI）。其中AU-L、AU-M和AU-H组分别予AU 1、5、10mg/kg·d腹腔注射,Sham、IRI组予相同体积生理盐水腹腔注射。连续预处理10d后,除Sham组外,其余各组均建立HIRI模型（70%肝脏缺血1h,再灌注6h）。收集大鼠血清及再灌注肝组织进行相关指标检测。肝脏HE染色观察再灌注肝组织病理损伤情况;全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平,以了解肝功能损伤情况;ELISA法检测血清中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）及白细胞介素-1b（IL-1b）的含量,了解促炎细胞因子释放情况;硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法及荧光探针技术分别检测再灌注肝组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及活性氧（ROS）生成情况,了解氧化应激水平。2.探讨杜仲AU对HIRI的保护机制。（1）杜仲AU对HIRI无菌炎症反应的影响。（1）体内实验,在整体水平上明确杜仲AU是否通过下调HMGB1的表达和/或主动分泌,影响TLR-4/NF-k B信号通路,抑制HIRI无菌炎症反应。取HIRI保护效应最优的AU组及Sham、IRI组的再灌注肝组织进行以下指标检测:实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（WB）法分别检测HMGB1、Toll样受体4（TLR-4）及高度糖基化终产物受体（RAGE）的m RNA及蛋白水平,了解HMGB1、TLR-4及RAGE的表达情况;WB检测干扰素调节因子1（IRF-1）、免疫沉淀（IP）联合WB检测乙酰化HMGB1（Ac-HMGB1）,了解HMGB1主动分泌情况;WB检测髓样分化因子88（My D88）、核因子k B-p65（p65）、磷酸化p65（P-p65）、核因子k B抑制蛋白a（Ik B-a）、磷酸化Ik B-a（P-Ik B-a）、肝组织细胞核内p65蛋白、IL-1b及TNFa等的蛋白水平,了解杜仲AU对NF-k B炎症反应通路的影响。（2）体外实验,在细胞水平进一步明确杜仲AU对TLR-4/NF-k B通路的影响。选取人正常肝细胞株HL-7702（LO2）,构建TLR-4过表达LO2稳转细胞株。分为正常LO2组（NC）、空质粒转染组（EPT）、TLR-4过表达组（OE）、TLR-4过表达+杜仲AU组（AU）和TLR-4过表达+TLR-4受体抑制剂TAK-242组（TAK）。将各组细胞接种于6孔板,AU组和TAK组用含不同浓度AU或TAK-242的完全培养基培养48h,余下三组用普通完全培养基培养48h,收集细胞悬液。CCK-8检测杜仲AU和TAK-242对LO2细胞活力的影响;WB检测各组TLR-4、My D88、P-p65和P-Ik B-a蛋白水平,探讨杜仲AU对TLR-4/NF-k B信号通路相关蛋白的影响。（2）体内实验初步探讨杜仲AU对HIRI所致细胞凋亡的影响。取HIRI保护效应最优AU组及Sham、IRI组的再灌注肝组织进行以下指标检测:TUNEL法观察细胞凋亡现象;WB检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α）、解偶联蛋白2（UCP2）、caspase3和cleaved caspase3的蛋白水平,以初步了解杜仲AU对线粒体损伤介导细胞凋亡途径的影响。结果:1.不同剂量杜仲AU对大鼠HIRI的保护效应:AU-M组病理学评分较IRI组明显降低（P<0.05）,AU-L和AU-H组病理学评分较IRI组无明显差异（P>0.05）;与IRI组相比,三种剂量杜仲AU均能下调血清中ALT、AST、TNF-a、IL-1b和HMGB1水平,减少肝组织中ROS、MDA生成,增加肝组织SOD的表达,差异均具统计学意义（P<0.05）;其中AU-M组ALT、AST、HMGB1、TNF-a、IL-1b、MDA、ROS降低及SOD升高最为显着（P<0.05）。2.杜仲AU减轻HIRI分子机制:（1）杜仲AU对无菌炎症反应的影响:（1）体内实验,相较于IRI组,AU-M组肝组织中HMGB1、TLR-4和RAGE的m RNA及蛋白水平显着降低（P<0.05）;IRF-1和Ac-HMGB1,My D88、p65、P-p65、P-Ik B-a和入核p65,以及IL-1b、TNF-a的蛋白水平均明显降低（P<0.05）;Ik B-a蛋白水平明显升高（P<0.05）。（2）体外实验,与EPT组相比,NC组的TLR-4水平无明显变化（P>0.05）,而OE组的TLR-4水平明显升高（P<0.05）;杜仲AU（8μM）和TAK-242（4μM）预处理均能够明显减少肝细胞内TLR-4、My D88、P-p65和P-IκB-α的蛋白水平（P<0.05）,且两组之间除TLR-4水平存在差异（P<0.05）,其余指标均无显着差异（P>0.05）。（2）杜仲AU对HIRI所致细胞凋亡的影响:TUNEL染色结果显示:与Sham组相比,IRI组标记凋亡细胞的荧光明显增强,荧光区域明显增大;而AUM组的荧光较IRI组明显减弱,荧光区域也明显减小。AU-M组肝组织细胞中caspase3和cleaved caspase3蛋白水平较IRI组明显降低,而PGC-1α和UCP2蛋白水平明显升高（P<0.05）。结论:1.杜仲AU（1、5、10mg/kg·d）均可通过抗炎、抗氧化作用发挥对大鼠HIRI的保护效应,以5mg/kg·d AU保护效应最佳。2.杜仲AU可通过下调HMGB1表达及减少HMGB1主动分泌,进而抑制TLR-4/NF-k B信号通路,减轻HIRI无菌炎症反应,发挥对HIRI的保护效应。3.杜仲AU还可能通过抑制线粒体损伤介导的细胞凋亡途径,发挥对HIRI的保护效应。
万函[2]（2021）在《参附注射液调节NOS/NO信号通路保护LPS损伤的脐静脉血管内皮细胞的作用及机制》文中研究说明研究背景和目的:血栓闭塞性脉管炎（thromboangiitis obliterans,TAO）,又称为Buerger病（Buerger’s disease）,以侵犯四肢中小动静脉为主并呈现出节段性、闭塞性、血栓性、炎症性的非动脉粥样性疾病。其症状主要表现为间歇性跛行、静息痛、缺血性溃疡、化脓、雷诺氏症和坏疽等,若得不到及时治疗或治疗不当,病人就有截肢和死亡的危险。TAO发病机理至今尚未完全阐明,还没有哪一种观点可以解释TAO的所有临床表现。中、西医均认为该病与血管内皮细胞（Vascular endothelial cell,VEC）的损伤有密切关系。深入研究血栓闭塞性脉管炎的治疗对策是目前临床研究的重要课题,而中医在本病的治疗上取得了显着成绩,中西医结合治疗可以明显改善本病治愈率、并降低复发率。过氧化是引起VEC凋亡的主要因素之一,损伤后的VEC形态及功能均发生改变,是促进TAO血管内血栓形成的重要原因。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是革兰阴性杆菌细胞壁的主要组成部分,常被作为一种刺激物来诱导内皮细胞损伤。目前国内外尚无有效治疗方法从根本上治愈该病,针对TAO可能的发病机制,临床上多采取对症治疗减轻患者病痛。参附注射液（Shenfu injection,SFI）是由红参、附子经现代工艺研制而成的中药注射剂,主要成份包括人参皂苷和乌头类生物碱。中医认为SFI具有回阳救逆、益气摄血的功效,我们前期研究发现SFI可能通过其加强对血小板聚集的抑制作用,提高血管的抗血栓功能,减少TAO模型大鼠血栓形成,以及改善其病变体征。一氧化氮（Nitric oxide,NO）是一种旁分泌因子,可影响血管张力和血小板功能,防止白细胞粘附并减少内膜增生。本课题拟在前期实验的基础上,基于NOS/NO信号通路,采用LPS诱导原代培养HUVECs的离体TAO模型,进一步探索SFI抗血栓闭塞性脉管炎的作用及其机制。方法:1.原代HUVEC的获取、培养、传代、冻存及鉴定。2.MTT法检测筛选不同浓度LPS对HUVEC损伤程度,确定LPS诱导HUVEC损伤的合适浓度。3.MTT法检测不同浓度SFI对LPS损伤HUVEC生长的影响,确定实验分组。4.Griess法检测HUVEC上清液中NO含量检测,Q-PCR检测SFI对LPS诱导的HUVEC中e NOS、i NOS的m RNA表达的影响。5.通过流式细胞仪检测SFI对LPS诱导的HUVEC细胞凋亡的影响。6.在荧光显微镜下,RH-123染色法测定HUVEC的线粒体膜电位水平,DHE染色评价HUVEC细胞活性氧水平。结果:1.从脐带分离出来的HUVEC最初为圆形或椭圆形,1d后可融合成疏松的单层细胞,贴壁生长,常为多角形及短梭形;6d后可完全融合成连续的细胞单层,为扁平、多角形或梭形,胞核明显,细胞呈鹅卵石样镶嵌排列,边界清楚,无重叠生长现象。2.不同浓度（0—100g/ml）的LPS孵育HUVEC 24小时,结果显示LPS可引起VEC死亡,10?g/ml LPS可使细胞存活率降至56.13%,其后随浓度增加,细胞生存率降低不明显,因此我们选定10?g/ml的LPS诱导VEC损伤模型。3.与对照组相比,LPS模型组的细胞存活率明显偏低（P<0.001）。与LPS模型组相比,随着SFI剂量的增加,细胞存活率明显提高（P<0.05）。4.与对照组相比,LPS模型中NO含量明显增加（P<0.01）;与LPS模型组相比,各剂量SFI组,HUVEC上清液中NO含量显着减低,差异有统计学意义（P<0.05）。5.与对照组相比,LPS模型组e NOS的m RNA表达明显降低（P<0.01）;与LPS模型组相比,SFI低、中、高剂量组e NOS的m RNA表达显着增加（P<0.05或P<0.01）,而且随着SFI剂量增多,e NOS的m RNA表达上调的也越明显。6.与对照组相比,LPS模型组i NOS的m RNA表达明显增加（P<0.01）;与LPS模型组相比,SFI低、中、高剂量组i NOS的m RNA表达显着降低（P<0.05或P<0.01）,而且随着SFI剂量增多,i NOS表达下调的也越明显。7.散点图结果显示,对照组见少量损伤或早期凋亡细胞,与对照组相比,LPS模型组见大量早期凋亡细胞（Q4）及少量晚期凋亡细胞（Q2）（P<0.01）;被低、中、高剂量的SFI预处理后的凋亡率明显降低,较LPS模型组显着降低（P<0.01或P<0.05）,其中,中剂量组SFI预处理后凋亡率最低。表明SFI明显抑制了LPS对HUVEC的损伤作用,降低了HUVEC细胞凋亡率。8.与对照组相比,LPS模型组黄绿色荧光增强,提示大量细胞发生凋亡。与LPS模型组相比,低、中和高剂量SFI预处理后黄绿色荧光减弱,提示细胞凋亡数量明显减少,其中,中剂量SFI预处理后,黄绿色荧光最弱,提示细胞凋亡的数量最少。9.与对照组相比,LPS模型组的红色荧光较强,提示细胞活性氧水平明显偏高。与LPS模型组相比,低、中和高剂量SFI预处理后红色荧光变弱,显示SFI降低了细胞活性氧的水平。而且,随着SFI剂量的增多,HUVEC细胞活性氧水平反而降低。结论:1.SFI预处理明显抑制LPS诱导的HUVEC的损伤、提高其存活率,表明参附注射液对LPS诱导损伤的HUVEC有保护作用。2.SFI减少LPS诱导的HUVEC上清液中NO的含量、降低其活性氧水平,以及抑制细胞凋亡,显示参附注射液对LPS诱导损伤的HUVEC保护作用可能与其调节NO含量、减少氧化应激和抑制细胞凋亡有关。3.SFI上调e NOS的m RNA表达、下调i NOS的m RNA表达,提示SFI可能经NOS/NO信号通路使NO含量保持合适的浓度从而产生对LPS诱导损伤的HUVEC的保护作用。
刘环秋[3]（2021）在《CCN1敲低通过ERK通路对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究》文中研究表明研究背景:肝缺血/再灌注损伤（HIRI）,是肝移植和肝切除后对肝脏造成不可逆损伤的重要的危险因素,是临床上一个非常具有挑战性的问题。器官缺血-再灌注损伤（IRI）是临床治疗中一个非常常见也非常棘手并且一直没有得到解决的难题。到目前为止,肝移植仍然是治疗终末期肝病和肝恶性肿瘤唯一有效的治疗手段,但是由于供体的短缺导致大量的病人不能如愿等到供体就已经死亡。活体肝移植虽然在很大程度上缓解了供体短缺的问题,但是关于供体供肝之后出现严重并发症的病例也有报道,因此人们对活体肝移植也变的越来越谨慎。近年来,人们不断尝试使用老龄化供肝、脂肪肝以及心脏死亡供肝等边缘性供肝来缓解供体的不足,然而这些边缘性供肝对缺血再灌注损伤更加敏感,也导致了临床上HIRI病例的增加。肝移植和肝切除术后肝IRI是导致患者术后并发症和死亡率增加的主要原因,大约有10%的早期移植失败是由肝IRI引起的,此外IRI还增加了肝功能障碍和器官排斥的风险。无肝期缺血以及新肝期再灌注引起的肝脏IRI是导致肝部分切除和肝移植术后肝功能衰竭的主要原因。然而到目前为止尚没有可以治疗肝IRI的有效方法。因此,对肝脏IRI的病理机制的研究,以及建立临床上有效并且易于实施的技术手段,对于肝脏IRI预防和治疗至关重要。CCN1/Cyr61是CCN蛋白家族的一员,通过结合不同的配体,调节不同的细胞过程,如细胞粘附、迁移、分化、增殖和凋亡,参与血管生成、炎症和纤维组织修复的过程。CCN1甚至被确定为心肌及肾损伤的早期生物标志物,根据肝IRI中CCN1水平的增加,我们推测CCN1可能参与调节肝IRI的过程。参与炎症反应和细胞凋亡的CCN1在肝缺血再灌注损伤时表达上调,但其内在的机制尚未知晓。内质网广泛存在于真核细胞,是负责蛋白质合成、折叠、转运和成熟的细胞器,内质网通过激活未折叠蛋白反应来抵抗由于内质网应激引起的细胞损伤,恢复细胞功能。据报道内质网应激在肝IRI的发病机制中起着至关重要的作用;研究显示细胞内CCN1可以通过内质网应激触发未折叠蛋白反应激活诱导肝星形细胞凋亡。因此我们拟通过在体内建立肝缺血-再灌注（IR）模型,体外建立了低氧/复氧（HR）模型,以探讨CCN1在肝IRI中是否通过ERK通路调节细胞凋亡、炎症反应或内质网应激。研究目的:（1）CCN1在肝缺血再灌注损伤中的作用;（2）CCN1敲低是否可以对肝缺血再灌注损伤起到保护作用;（3）肝IRI时,CCN1在内质网应激中的作用,以及它是否通过内质网应激调节肝IRI过程;（4）为肝缺血再灌注损伤提供进一步的理论基础;（5）为临床肝缺血再灌注损伤的预防和治疗提供新的方向。实验方法:（1）通过阻断肝脏左叶和中叶的血管,然后再灌注建立小鼠的缺血/再灌注损伤模型;（2）使用选取成年雄性C57BL/6小鼠建立小鼠肝缺血再灌注损伤模型,使用两个针对CCN1的小干扰RNA（si RNA）来敲低CCN1,分别通过组织形态学、免疫荧光、Western blot、实时定量PCR、TUNEL等技术检测Sham组、IR组、IR+si-NC组、IR+si-CCN1-1组和IR+si-CCN1-2组肝细胞功能状况、炎症因子及凋亡相关蛋白表达情况;（3）使用两个针对CCN1的小干扰RNA（si RNA）来敲低CCN1,分别在体外建立小鼠AML-12肝细胞系,建立缺氧/复氧模型,通过组织形态学、免疫荧光、Western blot、实时定量PCR、TUNEL等技术检测观察Sham组、IR组、IR+si-NC组、IR+si-CCN1-1组和IR+si-CCN1-2组肝细胞功能状况、炎症因子及凋亡相关蛋白表达情况。（4）数据以平均±SD,使用T检验或单因素方差分析方法进行统计,利用软件graphpad prism进行统计学分析,p值小于0.05有显着性差异。结果:（1）肝缺血再灌注损伤时CCN1的表达会上调,并且CCN1敲低后能够降低肝细胞损伤和凋亡的严重程度;（2）在敲低CCN1后,促炎因子如TNF-α、IL-6,促凋亡蛋白caspase-9,caspase-3,Bax和CHOP水平下降而抗凋亡因子Bcl-2的表达增加;（3）敲低CCN1也可以抑制激活ER应激和ERK通路激活的蛋白质的水平;（4）体外实验表明,敲低CCN1可以抑制炎症反应,细胞凋亡和ER应激,而在未改变CCN1水平的情况下,添加TPA能够使这种保护效应减弱或消失。结论:（1）CCN1敲低对肝IRI的肝细胞具有保护作用;（2）CCN1敲低主要通过抑制ERK通路激活来实现对肝细胞的保护作用;（3）CCN1敲低能抑制肝IRI时的炎症反应;（4）CCN1敲低能抑制肝IRI时细胞凋亡的发生。总体而言,CCN1敲低可以通过抑制ERK通路激活,抑制炎症、凋亡和ER应激,从而抑制肝IRI的程度,这可能是未来肝移植和肝切除引起的肝IRI临床预防和治疗的突破口。
卢建升[4]（2020）在《大鼠HIRI模型中Hcy代谢与肝龙胶囊预处理的作用》文中指出目的:建立大鼠HIRI模型,观察氧化应激、Hcy及相关代谢酶在HIRI中的变化,以及肝龙胶囊对HIRI预处理的作用,为后续的研究奠定基础。方法:1、将60只SD大鼠随机分为Sham组、HI组和HIR组,其中HIR组设置4个再灌注时间段,包括HIR3 h组、HIR6 h组、HIR12 h及HIR24 h组,每组10只。建立大鼠HIRI模型,观察大鼠的生存情况与状态,肝组织HE染色观察病理学,确定大鼠HIRI模型建立情况。2、检测大鼠HIRI模型中血浆AST、ALT活力和肝组织的HA、LN含量,以及实时荧光定量PCR测定肝组织OPN、α-SMA mRNA表达水平,观察大鼠肝脏损伤情况。3、检测大鼠HIRI模型肝组织中XOD、GSH-Px、CAT、NOS及SOD的活力,和GSH、NO、MDA的含量,来验证氧化应激反应参与HIRI的发生。4、检测大鼠HIRI模型肝组织中Hcy的含量,实时荧光定量PCR测定大鼠肝组织MS、CβS、MTHFR、BHMT及ER-αmRNA的表达水平,评价Hcy及代谢、ER-α在HIRI中的作用。5、将40只SPF级SD大鼠随机分为5组,即正常对照组、模型组、肝龙胶囊（GL）低、中、高剂量组(60、120、240 mg·kg-1),每组8只。各组大鼠按1m L·100 g-1的给药容积灌胃相应剂量的药物或生理盐水,1次/d,持续14 d。末次给药结束后各组进行相应操作,并观察肝组织HE染色病理学变化,检测血浆中AST、ALT活力,测定肝组织中MDA、Hcy、HA、LN含量和XOD、SOD活力,来评价肝龙胶囊对大鼠肝脏缺血预处理的作用。结果:1、通过半肝血流阻断法阻断大鼠肝左叶和中叶的血供,使大鼠肝脏约70%肝组织缺血90 min后再灌注血流建立HIRI的模型成功诱导肝损伤,且建模动物存活率达83.3%。与Sham组和HI组比较,HIR组大鼠肝脏脏器系数的差异均无统计学意义（P>0.05）。2、HE染色结果显示,Sham组镜下可观察到肝组织汇管区及中央静脉结构正常完整,肝细胞呈索状排列整齐,大小均匀,形态正常,无变性和坏死,肝窦明显扩张;HI组肝细胞索状排列不整齐,分布不均匀,有少量变性和坏死,肝窦被挤压变形且有明显淤血,有较少炎性细胞浸润;HIR3 h组和HIR6 h组肝细胞排列不齐且不均匀,有少量变性与坏死,肝窦挤压变形且有大量红细胞滞留,有少量炎性细胞浸润;HIR12 h组和HIR24 h组肝细胞排列不整齐且分布均匀,大小不均匀,有不同程度变性、水肿与坏死,肝窦被挤压变形甚至消失且有红细胞淤滞。HIR组的肝组织损伤以HIR24 h组最为严重,其肝细胞出现水肿和局灶坏死,且有大量炎性细胞浸润。3、与Sham组和HI组比较,大鼠肝脏缺血且再灌注一定时间后,HIR组肝组织中XOD活力和NO、MDA含量均有不同程度上升,其中以HIR24 h组的升高最明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,而GSH含量和GSH-Px、NOS、CAT及SOD活力不同程度下降,以HIR6 h组和HIR12 h组的下降最明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Sham组比较,HI组肝组织中SOD、GSH-Px活力下降,差异明显且有统计学意义（P<0.01）,而GSH、NO、MDA含量和XOD、CAT、NOS活力的变化差异无统计学意义（P>0.05）。4、与Sham组比较,HI组和HIR组大鼠血浆AST和ALT的活力均有不同程度的显着升高,差异均有统计学意义（P<0.01）,尤其以HIR6 h组和HIR12 h组两组活力的升高最明显;与HI组比较,HIR3 h、HIR6 h和HIR12 h组大鼠血浆的AST活力和HIR组大鼠血浆的ALT活力均有不同程度升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。与Sham组和HI组比较,HIR12 h组及HIR24 h组大鼠肝组织HA、LN含量均明显升高,差异明显且具有统计学意义（P<0.01）。5、RT-q PCR结果显示,与Sham组和HI组比较,HIR6 h组、HIR12 h组和HIR24 h组大鼠肝组织OPN mRNA的表达量均不同程度显着增高,HIR组大鼠肝组织α-SMA mRNA的表达量也均不同程度显着增加,其中OPN、α-SMA mRNA的表达量增高以HIR24 h组明显,差异明显,有统计学意义（P<0.01）。HI组大鼠肝组织α-SMA和OPN mRNA的表达量较Sham组亦有增加,但差异没有统计学意义（P>0.05）。6、与Sham组和HI组比较,HIR12 h组和HIR24 h组大鼠肝组织中Hcy含量均显着升高,其中HIR24 h组含量最高,差异明显,具有统计学意义（P<0.01）。HI组大鼠肝组织中Hcy含量较Sham组升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与Sham组比较,HI组和HIR组大鼠肝组织的MS mRNA表达量均不同程度降低,CβS mRNA的表达量均增加;HIR6 h组、HIR12 h组及HIR24 h组大鼠肝组织MTHFR mRNA的表达量和HIR组大鼠肝组织的BHMT mRNA的表达量均有不同程度增加,差异均具有统计学意义（P<0.05）。其中MS mRNA的表达量在再灌注12 h时降低最明显,CβS与MTHFR mRNA的表达量在再灌注24 h时增高最显着,BHMT mRNA的表达量在再灌注6 h时增高最为明显。与HI组比较,HIR3 h组、HIR6 h组及HIR12 h组组大鼠肝组织的MS mRNA表达量均降低,而HIR24h组MS mRNA表达量增加,差异明显,有统计学意义（P<0.01）;HIR24 h组大鼠肝组织CβS mRNA的表达量显着增加,差异明显,有统计学意义（P<0.01）;HIR组大鼠肝组织MTHFR与BHMT mRNA的表达量增加,但差异无统计学意义（P>0.05）。7、研究结果发现,与模型组比较,大鼠在不同浓度的肝龙胶囊预处理后,肝组织病理形态均有不同程度改善;GL中剂量组大鼠血浆AST、ALT的活力明显降低（P<0.01）;GL低、中、高剂量组大鼠肝组织SOD活力不同程度升高（P<0.05）,MDA含量降低（P<0.05）,GL中、高剂量组大鼠肝组织活力和Hcy含量显着降低（P<0.01）;给药组大鼠肝组织HA、LN含量仅有GL中剂量组的下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1、大鼠肝脏缺血-再灌注能引起肝脏损伤,再灌注加剧肝脏的损伤。2、验证了氧化应激参与HIRI的发生,其中初步将Hcy与HIRI联系研究发现,Hcy可能通过自身氧化产生大量活性氧损伤肝组织。4、HIRI导致MS基因表达异常,使Hcy甲基化径的代谢紊乱,导致Hcy在体内蓄积。5、一定剂量的肝龙胶囊对大鼠HIRI预处理具有保护肝脏作用,可能通过减轻Hcy的自身氧化作用和减少ROS的产生,以及提高抗氧化作用,减轻肝细胞的损伤。
焦智慧[5]（2020）在《ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究》文中进行了进一步梳理肝脏是哺乳动物最大的实质器官,具有加工储存营养物质、代谢药物毒物、分泌胆汁、合成蛋白质等重要功能。肝脏缺血再灌注损伤是外科手术中常见的一种临床综合征,20世纪90年代出现了腹腔镜的肝切除术,腹腔镜手术可以最大程度的减少腹壁神经和肌肉的损伤,减少出血、术后疼痛和粘连,加快手术恢复。尽管采用微创外科手术,在肝切除、肝移植、出血性休克等临床手术中仍不可避免的出现肝脏缺血再灌注损伤,严重会导致肝炎以及术后肝功能的衰竭。对于晚期肝功能不全的有效治疗办法是原位肝移植,但也面临着器官短缺,费用昂贵、免疫排斥和移植并发症等问题,因此,寻找能够减轻肝脏缺血再灌注损伤以及提高肝脏再生能力的安全有效的治疗办法是目前肝脏外科亟待解决的问题之一。脂肪间充质干细胞（ADSCs）能够自我更新、具有多向分化能力、来源丰富、取材损伤小,是目前细胞疗法理想的种子细胞。ADSCs主要依靠分化和旁分泌发挥作用,旁分泌指干细胞释放的多种生物因子在微环境里通过细胞基质在局部以及临近组织对靶细胞发挥的生物学作用。随着对旁分泌机制的深入研究,发现ADSCs分泌的多种细胞因子具有促进血管生成,抑制炎症反应,调节免疫应答,修复组织再生等多种生物学功能。ADSCs在体外培养的过程中,会将细胞因子等生物活性物质分泌到培养液中,这种含有细胞分泌物的培养液为脂肪间充质干细胞的条件培养液（ADSC-CM）。尽管ADSCs在临床上对许多疾病有治疗效果,但ADSCs具有免疫原性,对植入ADSCs的不可控分化仍是重要的安全隐患。因此,使用ADSC-CM的无细胞疗法成为绕过细胞疗法局限性的一种再生医学治疗方法。目前有关肝脏缺血再灌注损伤的动物模型以啮齿类动物为主,而从比较医学角度,小型猪与人的同源性好,体积大小以及器官大小与人更为接近,因此也作为研究缺血再灌注损伤理想的实验动物,所获得的研究数据更有价值,易于临床转化。而ADSC-CM在大型实验动物的研究较少,特别是肝脏领域尚未见报道,所以本研究旨在通过建立小型猪肝脏缺血再灌注合并部分切除模型,探究ADSC-CM治疗肝脏缺血再灌注合并部分切除损伤的疗效,为比较医学开展肝病治疗,拓宽ADSC-CM移植领域提供研究依据。本研究使用30头小型猪,其中6头用于脂肪组织的获取。采用胶原酶消化法分离培养ADSCs,使用诱导培养基和特定染色鉴定ADSCs成脂、成骨、成肝分化能力,应用细胞流式鉴定ADSCs表面特异性抗原。ADSCs饥饿培养48 h获得ADSC-CM,经3 kda超滤管离心浓缩ADSC-CM用于后续实验。另外24头小型猪随机分为四组:模型组（IRI）,DMEM对照组（DMEM）,脂肪间充质干细胞组（ADSCs）,脂肪间充质干细胞条件培养基组（CM）,每组6头。四组实验动物均通过腹腔镜手术建立肝脏缺血再灌注合并部分肝切除模型,IRI组通过肝实质注射生理盐水,DMEM组注射基础培养基,ADSCs组注射脂肪间充质干细胞,数量为1×106/kg,CM组按照1×106/kg细胞数提取等量干细胞分泌的条件培养液,注射浓缩的ADSC-CM进行干预。分别在术前、术后1 d、3 d、7 d采集血液样本及肝组织样本用于相关指标的检测。通过HE染色观察病理组织学变化,透射电镜观察超微结构的变化,血常规检测外周血的炎性细胞变化,试剂盒检测抗氧化酶以及细胞凋亡酶活性,TUNEL染色检测凋亡细胞的阳性率,ELISA法检测血清中炎症相关因子、再生相关因子以及ADSC-CM成分,q RT-PCR法检测炎症、凋亡以及再生相关基因水平变化,Western Blot法检测肝组织中凋亡以及再生相关蛋白水平的变化,免疫组化染色检测凋亡相关蛋白以及再生相关蛋白水平的变化。本研究结果如下:（1）病理组织学与超微结构变化:术后各组肝小叶结构被破坏,肝索排列紊乱,肝细胞空泡变性明显,炎性细胞浸润,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显减少空泡变性和炎性细胞浸润;术后IRI组和DMEM组肝细胞内质网严重扩张,细胞核膜皱缩,染色质边集化,ADSCs或ADSC-CM干预改善了内质网扩张及肝细胞核膜皱缩的程度。（2）肝脏功能变化:术后各组ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL均升高,TP呈降低趋势,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显降低了ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL的升高程度,缓解了TP的降低程度,促进肝脏功能的恢复。（3）氧化应激指标变化:术后各组肝组织抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD活性显着降低,MPO酶活性和MDA含量显着升高,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着增强了抗氧化酶的活性,降低MPO酶活性,并能减少氧化产物MDA的水平,从而减少术后的氧化应激反应,且两个干预组的上述氧化应激指标均无显着性差异。（4）炎症指标变化:术后外周血中炎性细胞WBC、NE、LY含量迅速升高,ADSCs或ADSC-CM干预减少了外周血中的炎性细胞的数量;IRI组和DMEM组血清中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量呈升高趋势,ADSCs或ADSC-CM干预降低促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平,同时增强抑炎因子IL-10的表达;肝组织中炎症因子基因水平的表达与血清结果一致,ADSCs和ADSC-CM通过抑制促炎因子的过度释放以及增强抑炎因子的表达显着改善了术后的炎症反应,且两个干预组之间没有显着性差异。（5）凋亡指标变化:术后各组P53、Bax、Fas、Fasl基因和蛋白水平均显着升高,Bcl-2表达水平降低,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预抑制了凋亡相关指标P53、Bax,、Fas、Fasl的表达,提高抗凋亡Bcl-2的表达水平;ADSCs组和CM组显着降低TUNEL阳性细胞率及Caspase酶活性,减少术后肝细胞凋亡,且两组之间没有显着性差异。（6）再生指标变化:相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着提高血清中血管生成相关因子VEGF、ANG-1、ANG-2的表达,增强组织中肝脏再生相关基因HGF、Cyclin D1的表达,抑制肝再生终止基因TGF-β的表达,提高Ki67的阳性细胞数及细胞增殖PCNA蛋白的表达,且ADSCs组和CM组之间没有显着性差异。（7）ADSC-CM成分检测:通过ELISA法检测到小型猪ADSC-CM中含有促进血管生成的VEGF、ANG-1、ANG-2、b-FGF,调节炎症反应与肝脏再生的TNF-α、IL-1β、IL-6。综上所述,经肝实质移植ADSCs和ADSC-CM均能够改善肝脏缺血再灌注合并部分肝切除的病理组织学损伤及超微结构变化,减轻过度炎症反应及氧化应激反应,减少细胞凋亡,促进肝脏再生。本试验成功应用ADSCs和ADSC-CM干预肝脏缺血再灌注合并部分切除后的肝损伤,证明ADSCs和ADSC-CM抗氧化、抗炎、抗凋亡和促进肝再生的作用,且二者干预效果无显着差异,推测ADSCs发挥作用的机制很可能是通过分泌细胞因子的旁分泌途径。
梁苏东[6]（2020）在《异槲皮素预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的:肾缺血再灌注损伤（renal ischemia reperfusion injury,RIRI）为临床中常见的问题之一,它存在于临床中的多种病理生理过程。肾缺血再灌注损伤的病理生理学很复杂,炎症反应、氧化应激、细胞凋亡被认为在其中扮演了重要的角色。异槲皮素（isoquercetin,IQ）天然存在于多种植物中,既往研究已经发现IQ能通过抗炎症反应、抗氧化应激、抗凋亡的作用减轻脑部缺血再灌注损伤。但IQ在肾缺血再灌注损伤中的作用未见报道。本研究探究了 IQ对小鼠肾缺血再灌注损伤有无保护作用,并对相关作用机制进行初步的研究。方法:30只雄性野生型C57BL/6小鼠（10周龄,体重22-24g）按随机数字表法随机分为三组,每组10只,分别为:假手术组（Sham组）,肾缺血再灌注损伤组（RIRI组）和肾缺血再灌注损伤（RIRI）+IQ预处理组。肾缺血再灌注损伤组（RIRI组）:小鼠右侧肾脏切除术后阻断左肾蒂血管使左侧肾脏缺血30分钟,后开放左肾蒂血管夹,再灌注24小时。肾缺血再灌注损伤（RIRI）+IQ预处理组:小鼠术前连续3天,每天按20 mg/kg IQ的量以腹腔注射方式给药,后行缺血再灌注。（1）检测IQ预处理对血尿素氮、血肌酐的影响,HE染色观察肾脏组织学的变化;（2）通过对肾组织髓过氧化物酶（MPO）活性、IL-6、TNF-α的检测,评估IQ预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤抗炎症反应方面的作用。Western blot和免疫组化法检测肾脏组织中NF-κB表达水平,探讨可能的炎症反应机制。（3）通过对肾组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）的检测,评估IQ预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤抗氧化应激反应方面的作用。（4）通过检测肾脏组织 caspase-3、caspase-8、caspase-9 的活性以及 Bcl-2、Bax蛋白的表达量,评估IQ预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤抗凋亡方面的作用。结果:（1）与RIRI组相比,IQ预处理能显着降低小鼠肾缺血再灌注损伤后的血尿素氮、血肌酐水平,降低肾脏组织学组织损伤评分,具有一定的肾脏保护功能。（2）炎症方面的影响:与RIRI组相比,IQ预处理能显着降低肾脏组织MPO的活性,降低炎性因子IL-6、TNF-α的水平以及肾脏组织中NF-κB表达水平。（3）氧化应激方面的影响:与RIRI组相比,IQ预处理能显着升高抗氧化物质SOD、GSH、CAT的活性,降低脂质过氧化终产物MDA的水平。（4）凋亡途径的影响:与RIRI组相比,IQ预处理显着降低肾脏组织caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性,升高Bcl-2的表达量,降低Bax的表达量,上调Bcl-2/Bax。结论:（1）IQ对小鼠肾缺血再灌注损伤具有显着保护作用。（2）IQ能通过抗炎症反应的作用减轻小鼠肾缺血再灌注损伤,其可能是通过下调NF-κB通路来介导的。（3）IQ能通过抗氧化的作用对小鼠肾缺血再灌注损伤起到保护作用。（4）IQ能通过抗凋亡的作用减轻小鼠肾缺血再灌注损伤,其可能是通过调节Bcl-2家族和caspase家族成员来实现的。
郑文亚[7]（2019）在《运输应激对山羊主要器官的应激损伤及热休克蛋白表达的影响》文中指出畜禽运输是畜牧业生产过程中必不可少的一个重要环节,运输过程中的拥挤、颠簸、震动、噪音、温度变化和禁食禁水等复合应激源均可造成动物机体生理紊乱、发病甚至死亡,同时降低肉品质量和动物福利,给畜牧业带来巨大的经济损失。热休克蛋白参与各种生命活动,主要发挥分子伴侣作用,具有组装、折叠和转运等功能,同时参与抗应激和抗凋亡等生理活动,在运输应激中可能发挥一定的作用。本实验选用12只体重相近（13.89±2.96 Kg）且健康的赣西公山羊为实验动物并将其随机分为3组,即对照组（不运输）、2 h运输处理组和6 h运输处理组,运输处理组在温度为28℃32℃、车速为3545 km/h条件下进行公路运输,运用HE染色、透射电镜技术、实时定量PCR、免疫组织化学和Western blot方法,系统分析了不同运输时间山羊心脏、肝脏、肾脏、肺脏、气管、支气管、脾脏、淋巴结和小肠的显微和超微病理变化,并探讨运输前后HSP27、HSP70和HSP90在山羊主要器官的分布和表达情况,为探讨山羊运输应激发病机制及其解决方案的研究提供基础资料。本研究主要取得了以下结果:（1）山羊心脏实验结果表明运输后心肌纤维发生颗粒变性,线粒体肿胀、破裂,间质水肿、充血出血、炎性细胞浸润,6 h运输处理组病变更严重。3种蛋白主要在心肌细胞胞质中表达,HSP27和HSP90在胞核中也表达。与对照组相比,2 h和6 h运输处理组HSP27、HSP70和HSP90的mRNA水平均升高,并且2 h运输处理组HSP27、HSP70和HSP90的蛋白表达量也有所升高,6 h运输处理组仅HSP70和HSP90的蛋白表达量有所升高。（2）山羊肝脏实验结果表明处理组肝脏发生不同程度的损伤,中央静脉扩张充血,窦间隙变小,肝细胞出现明显的颗粒和水泡变性,少量肝细胞核染色质聚集,线粒体肿大变形、嵴断裂消失,胞质中出现空泡和脂滴,6 h运输处理组更为严重。HSP27在中央静脉和门管区附近的肝细胞、血管内皮细胞及胆小管上皮细胞的胞质中都有分布;HSP70与HSP90主要定位于中央静脉和门管区附近的肝细胞胞质中,HSP90在胞核也有表达。与对照组相比,2 h运输处理组仅HSP27和HSP90的mRNA表达量上调,而6 h运输处理组仅HSP70的mRNA表达量上调,同时两个处理组仅HSP27与HSP70的蛋白表达量高于对照组。（3）山羊肾脏实验结果表明部分肾小管和集合小管结构紊乱,管腔界限不清,管腔可见脱落的上皮细胞和黏液,肾小球充血、肿胀,肾小囊腔变窄,线粒体肿胀且嵴断裂并减少,运输6 h后充血、出血更明显,管腔和肾小球细胞损伤更严重。对照组3种蛋白主要在肾小管和集合小管表达,运输后表达更强,处理组肾小体也可见阳性反应。与对照组相比,2 h运输处理组HSP27与HSP90的mRNA和蛋白表达量均有上调,而HSP70的mRNA的表达量下调,其蛋白表达量上调,6 h运输处理组仅HSP27的mRNA表达上调,而3个分子的蛋白表达均上调。（4）山羊肺脏、气管和支气管实验结果表明运输后气管和支气管黏膜水肿、充血,炎性细胞浸润,纤毛倒伏、断裂和脱落,少量黏膜上皮细胞变性、坏死,纤毛和杯状细胞超微病变明显,线粒体肿胀、嵴溶解减少,血管内皮细胞膜起泡、破损。肺泡腔塌陷或融合,肺泡隔增宽、充血,炎性细胞浸润,部分肺泡上皮细胞变性,肺泡腔可见脱落的细胞和碎片,肺泡II型上皮细胞超微病变明显,肺泡I型上皮细胞膜不平整、胞质空泡化,运输6 h后损伤更严重。HSP27和HSP70在气管和支气管上皮、腺上皮和血管内皮表达,处理组阳性表达的炎性细胞数量增多,在肺泡细胞和细支气管上皮普遍表达,HSP90表达强度较弱,仅在气管和支气管上皮、腺上皮及肺泡II型上皮细胞、细支气管上皮表达。气管HSP70蛋白表达量在2 h和6 h运输处理组与对照组相比明显上调,2 h运输处理组肺脏HSP70的mRNA和蛋白表达量与对照组相比均明显上调。（5）山羊淋巴结和脾脏实验结果表明运输后淋巴结和脾脏均出现急性病理变化,淋巴小结和脾小结增生明显,6 h运输处理组淋巴细胞和网状内皮细胞可见核破碎,细胞超微病变明显,发生凋亡或坏死。运输前后3种蛋白在淋巴结和脾脏中的定位存在差异,HSP27主要分布在弥散淋巴组织,HSP70和HSP90主要分布在淋巴小结和脾小结。与对照组相比,2 h运输处理组HSP27、HSP70和HSP90的mRNA水平在淋巴结和脾脏中均上调,而6 h运输处理组仅淋巴结中HSP70的mRNA水平和脾脏中HSP90的mRNA水平有所上调;两个处理组的淋巴结与脾脏HSP90蛋白表达量均有所上调,并且运输2 h后HSP27的蛋白在脾脏、HSP70的蛋白在淋巴结的表达量上调,运输6 h后HSP70在脾脏中的表达量与对照组相比下调。（6）山羊十二指肠、空肠和回肠实验结果表明运输后肠绒毛黏膜上皮和固有层有炎性细胞浸润、充血和出血,少量上皮细胞变性,微绒毛倒伏,核固缩,线粒体肿胀、增生。3种蛋白主要在肠绒毛上皮表达,HSP27和HSP70主要在胞质表达,HSP90在胞质和胞核均有表达。与对照组相比,十二指肠中HSP27和HSP70的mRNA水平在6 h运输处理组中均上调,2 h运输处理组仅HSP27的mRNA水平上调,而在蛋白水平上,仅HSP90的蛋白表达量在运输6 h后上调;空肠HSP27、HSP70和HSP90的mRNA水平在2 h运输处理组均上调,6 h运输处理组中仅HSP70的mRNA水平上调;回肠中仅HSP70的mRNA水平在2 h运输处理组上调,而HSP27的mRNA水平在两个处理组中均下调,HSP27蛋白表达量在两个处理组均明显降低,在运输2 h后HSP70蛋白表达量与对照组和6 h运输处理组相比均有所升高。总之,运输应激对山羊主要实质器官和空腔器官均造成了一定程度的病理性损伤,随着运输时间的延长损伤加重。运输后,HSP27、HSP70和HSP90的定位情况在不同器官中均出现了不同的变化,其mRNA和蛋白的表达量也有一定的变化,提示这些分子与运输应激对山羊脏器的损伤之间存在一定的联系。
杨济宁[8]（2019）在《白藜芦醇在代谢性心血管疾病防治中的作用和机制研究》文中提出背景我国心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）的患病人数高达2.9亿,死亡率居于首位,已成为重大的公共卫生问题,给国民经济带来沉重的负担。因此,寻找新的治疗靶点和干预措施来防治心血管疾病刻不容缓。生活方式和膳食模式的改变是近年来我国CVD发病率升高的重要原因。其中,由高脂膳食（high-fat diet,HFD）引起的血脂异常、肥胖、代谢紊乱等均是CVD的重要危险因素。当摄入的脂肪超过肝脏的代谢负荷后,可诱发血脂代谢紊乱,从而造成血管内皮细胞氧化应激损伤,并进展为动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）,后者是CVD的病理基础。而AS进一步发展可产生冠状动脉堵塞,从而造成心肌细胞不可逆损伤甚至死亡。因此,通过膳食途径对代谢性疾病进行干预是一种经济且有效的手段。其中,白藜芦醇（resveratrol,RSV）是一种广泛存在于植物性食物中的多酚类植物化学物,可通过抗氧化应激、抗炎等作用有效改善CVD,但其中的机制尚未阐明。肝脏是脂肪代谢的核心器官,有脂肪蓄积引起的非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是CVD的一项独立危险因素。本课题组前期研究提示RSV可通过蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）介导的通路改善HFD引起的多种代谢性疾病,因此,PKA可能成为RSV防治代谢性CVD的重要靶点。多项体外研究表明PKA密切参与到肝脏脂肪代谢调节中,然而,由于PKA的亚基种类较多,难以建立PKA完全敲除的动物模型,因而关于PKA对肝脏脂肪代谢的体内研究尚缺乏直接证据。此外,HFD引起的血管内皮细胞氧化应激是AS发生发展的关键因素,而血管内皮细胞线粒体动力学与细胞氧化还原稳态关系密切。我们前期发现RSV可以调节内皮细胞的氧化还原稳态,但RSV在调节内皮细胞线粒体动力学过程中的作用靶点仍有待研究。防治CVD的另一个重要方面是提高心肌细胞在病理性应激情况的存活能力。既往的研究提示在成年心室肌细胞中,单核心室肌细胞（mononucleated ventricular myocytes,MVMs）比双核心室肌细胞（binucleated ventricular myocytes,BVMs）分化程度更低,且具有一定的增殖潜力,因而受到广泛的关注。但受限于研究方法,MVMs与BVMs在基因层面的特征及对病理刺激因子的反应性一直未能得到全面的揭示。深入研究两种心肌细胞的差异对于理解心肌细胞的生理学特征、提高心肌细胞在病理条件下的存活率具有重要的意义。目的1.建立肝脏特异性PKA活性抑制性小鼠模型,研究PKA在体内对HFD的代谢反应及转录组变化,为PKA在脂肪代谢中的作用提供有效的体内研究模型,并探索PKA作为代谢性CVD防治靶点的潜力。2.阐明RSV在调节内皮细胞线粒体动力学和抗氧化应激中的作用及机制,为代谢性CVD的防治提供膳食营养干预策略。3.揭示MVM和BVM在基础状态下和受压状态下的转录组特征,并从转录组差异提示的结果出发深入研究MVM和BVM的病理生理学基础,及RSV分别对两种细胞在受压条件下的存活情况和抗氧化应激损伤的效应,完善RSV保护心肌细胞的作用和机制。方法1.利用转基因技术构建过表达“loxP-PKA抑制肽-绿色荧光蛋白（PKAi-GFP）-loxP”基因的小鼠,通过与Alb-cre工具鼠交配后得到在肝脏特异性过表达PKAi-GFP小鼠模型（PKAi小鼠）,并用蛋白免疫印记方法验证肝脏组织中PKAi-GFP表达,用RT-qPCR检测多种组织中PKAi-GFP的表达水平,用PKA活性检测试剂盒检测PKAi肝脏组织中PKA活性被抑制程度。分别研究普通饮食（chow diet,CD）和HFD诱导下PKAi小鼠与同窝对照小鼠的体重、肝脏指数、肝脏内甘油三酯的含量,通过H&E染色观察肝脏组织病理学变化,油红O染色观察肝脏组织中脂滴聚集,并通过第二代RNA测序技术揭示转录组变化及生物信息学方法预测PKA在HFD刺激下改变的通路。2.利用棕榈酸（palmitic acid,PA）处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）建立氧化应激模型,通过细胞计数试剂盒8（cell counting kit8,CCK8）检测细胞活力并确定最适建模浓度和时间。利用流式细胞术和酶标仪检测DCFH-DA探针标记的细胞内ROS,用脂质过氧化和超氧化物歧化酶检测试剂盒检测RSV干预后HUVEC内氧化应激变化;用流式细胞术和酶标仪检测JC-1探针标记的线粒体膜电位;共聚焦显微镜和电子镜显微镜观察线粒体形态变化;利用蛋白印迹检测线粒体融合蛋白的表达;利用siRNA分别敲降TyrRS和PARP1后,检测TyrRS-PARP1通路在RSV调节线粒体动力学、氧化应激中的作用。3.通过RNA模板5’末端的转换机制测序技术（switching mechanism at 5’end of RNA template-sequencing,SMART-seq）检测基础状态下和异丙肾上腺素（isoproterenol,ISO）刺激下的MVM与BVM转录组,并利用生物信息学技术分析两者的差异性特征;利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）技术检测MVM和BVM在基础状态和ISO刺激下的凋亡率;分别利用JC-1、DCFH-DA标记线粒体膜电位和细胞内ROS,激光共聚焦显微镜检测并分析MVM和BVM在基础状态和ISO刺激下荧光强度;利用DCFH-DA标记细胞内活性氧、Rhod-2标记线粒体钙,在共聚焦显微镜时间扫描模式下检测ISO刺激后MVM和BVM线粒体钙和ROS的变化。RSV预处理心肌细胞后,用台盼蓝标记死细胞,分别检测MVM和BVM的死亡率,共聚焦显微镜检测DCFH-DA标记的细胞内ROS。结果1.抑制肝脏内PKA活性可促进HFD诱导的肝脏内甘油三酯蓄积。1.1通过loxP/cre系统建立了肝脏内条件性PKA活性抑制小鼠模型（PKAi小鼠）,其肝脏中特异性表达有PKAi-GFP,且抑制了PKA 61%的活性。1.2小鼠肝脏中PKA活性被抑制后,在普通饮食喂养下,体重、肝脏指数、肝脏内甘油三酯的含量与对照小鼠无差异;而在HFD诱导8周后,与对照组比较:PKAi小鼠肝脏指数增加、肝脏内出现更严重的脂肪蓄积。1.3转录组研究显示:在基础饮食下,PKAi和对照小鼠差异表达基因富集分析提示PKA主要参与到了脂肪代谢。而两种小鼠在HFD诱导后:PKAi小鼠主要发生热休克蛋白相关的应激反应相关通路,而对照小鼠则主要体现在免疫系统应答的改变。2.RSV通过激活TyrRS-PARP1通路抗PA诱导的内皮细胞氧化应激。2.1 HUVEC在200μM PA处理24h后,细胞活力下降至对照组的47%,该处理方案用于该研究中建立HUVEC氧化应激模型。在该模型中,细胞活力下降,细胞内ROS升高、脂质过氧化产物增多、超氧化物歧化酶活性下降;而RSV可以抑制以上变化。2.2在HUVEC氧化应激模型中,线粒体膜电位下降,线粒体成碎片化形态,且线粒体融合相关蛋白（OPA1,MFN1和MFN2）表达下降,而RSV处理可减少线粒体碎片化程度,上调融合相关蛋白;但当TyrRS、PARP1被抑制后,RSV对线粒体膜电位、形态学及融合相关蛋白的调节作用消失。3.RSV通过减轻ISO诱导的BVM氧化应激降低心肌细胞死亡率。3.1 MVM和BVM基础状态下的转录组有显着的差异,其中MVM中高表达的基因主要集中在RNA合成、抗凋亡方面,而BVM中高表达的基因则主要集中在蛋白质分解和P53介导的凋亡通路。3.2在添加ISO作为病理刺激的情况下,BVM比MVM更容易发生凋亡,其机制与BVM比MVM在ISO刺激后产生的ROS更多、维持线粒体膜电位能力更弱、发生线粒体钙超载速度更快有关。RSV的干预可以通过抑制BVM中ROS的产生而增加BVM的存活率,但对MVM的ROS及存活率没有显着影响。3.3 ISO诱导后的MVM和BVM转录组变化也存在显着差异。MVM在ISO刺激后倾向于发生自噬、减少细胞内的合成类的代谢活动从而降低细胞功能;而ISO刺激后的BVM则倾向于发生合成代谢来代偿性使细胞的功能活跃。结论1.成功建立并验证了一种全新的基于loxP/cre系统的肝脏特异性PKA活性抑制转基因小鼠模型,该小鼠肝脏的转录组发生显着改变,且在HFD喂养后较快出现肝脏内甘油三酯的蓄积。2.RSV可以通过激活TyrRS-PARP1通路调节内皮细胞线粒体动力学变化,从而改善PA诱导的氧化应激损伤。3.MVM和BVM是在转录组层面和生理功能层面具有显着差异的两种心肌细胞亚群。在病理刺激下,MVM比BVM更易存活,两种细胞应对病理性刺激的反应方式不同,而RSV的干预可以通过减轻BVM氧化应激而提高其存活率。综上,本研究探索了膳食营养干预防治代谢性CVD的作用和新机制。RSV是代谢性心血管疾病的保护性因子,对其作用机理的揭示为防治CVD提供了新思路。
石磊[9]（2019）在《白藜芦醇对动脉粥样硬化模型小鼠脂代谢影响及对巨噬细胞作用机制的研究》文中研究指明目的（1）观察白黎芦醇对动脉粥样硬化模型小鼠肝脏及血清指标的影响。（2）研究不同浓度白藜芦醇干预对动脉粥样硬化小鼠模型巨噬细胞自噬和凋亡的影响及可能机制。方法（1）动脉粥样硬化模型小鼠的建立:将50只小鼠随机分为5个小组,各组分别给予不同的干预,观察不同浓度白藜芦醇干预对动脉粥样硬化模型小鼠肝脏和血脂等指标的影响;（2）分别用0、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM共6个浓度梯度的白藜芦醇干预培养的鼠巨噬细胞24 h后,采用显微镜观察细胞形态变化、MTT染色法分析细胞存活率大小,Western-Blot检测小鼠巨噬细胞自噬（LC3、Beclin1、P62、ATG5、Sirt1、p-P70 s6 k、AMPK、P-AMPK）、凋亡（P53、cle-Caspase3、cle-PARP、Bcl-2/Bax）相关蛋白以及脂代谢相关分子PPARα、CYP7 A1的表达。结果（1）分为基础组、动脉粥样硬化（AS）组、RSVI组、RSVII组、RSVIII组5组小鼠。各组小鼠饮食、精神状态良好,生长发状况育未见明显异常。5组小鼠体重增加量以RSVI组最高,但与其他各组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。（2）5组小鼠在实验期间平均摄食量均随饲养周期延长而增加,6周后小鼠活动量减少,摄食量增幅有所降低。基础组、干预III组小鼠平均摄食量高于其余3组,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。（3）5组小鼠肝脏指数组间比较结果示差异无统计学意义（P>0.05）。（4）小鼠肝脏的病理学变化:基础组、RSVII组和RSVIII组小鼠肝脏颜色鲜红,边沿锐利,质地软;而AS组和RSVI组小鼠肝脏边沿变钝,质地韧,剖面呈油腻感。小鼠肝脏HE染色切片显示:基础组小鼠肝脏细胞形态大致正常,脂肪变性肝细胞极少见;模型组小鼠的肝脏切片中可见部分脂肪变性肝细胞;RSV干预的三组小鼠肝脏切片中可见少数脂肪变性肝细胞。（5）与基础组比较,AS组血清TC、TG、LDL-C水平显着升高（P<0.01）,HDL-C水平无显着性差异;与AS组比较,用白藜芦醇干预的3组中,TC、TG、LDL-C含量均明显减少（P<0.01,P<0.05）,HDL-C含量均明显升高（P<0.01）;RSVI组、RSVII组和RSVIII组组间两两比较发现,TC、TG、LDLC水平逐渐降低,HDL-C水平逐渐增加,差异有统计学意义（P<0.05）。（6）与基础组比较,AS组动脉粥样硬化指数AI1、AI2显着上升（P<0.01）;与AS组比较,白藜芦醇干预的三组中,AI1、AI2均降低（P<0.01,P<0.05）;RSVI组、RSVII组和RSVIII组组间两两比较发现,AI1、AI2水平逐渐降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结果显示,白藜芦醇对动脉粥样硬化指数AI1、AI2有一定的影响。（7）小鼠血清抗氧化水平:与基础组比较,AS组血清T-SOD、CAT、GSH-Px水平降低（P<0.01）,MDA水平升高（P<0.01）;与AS组比较,用白藜芦醇干预的3组中,T-SOD、CAT、GSH-Px含量均显着升高（P<0.01,<0.05）,MDA含量均明显降低（P<0.01）;RSVI组、RSVII组和RSVIII组组间两两比较发现,T-SOD、CAT、GSH-Px水平逐渐升高,MDA含量逐渐下降,差异有统计学意义（P<0.05）。（8）小鼠肝组织抗氧化水平:与基础组比较,AS组肝脏中T-SOD、CAT、GSH-Px水平降低（P<0.01）,MDA水平升高（P<0.01）;与AS组比较,用白藜芦醇干预的3组中,T-SOD、CAT、GSH-Px含量均显着升高（P<0.01,<0.05）,MDA含量均明显降低（P<0.01）;RSVI组、RSVII组和RSVIII组组间两两比较发现,T-SOD、CAT、GSH-Px水平逐渐升高,MDA水平逐渐降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结果显示,白藜芦醇对于肝脏中抗氧化酶T-SOD、CAT、GSH-Px及MDA水平的影响呈现出一定的剂量依赖性。（9）随着处理浓度增加,细胞间距变大、细胞折光性变差、死细胞数量增多,活细胞状态也变差,细胞活力都呈剂量依赖性的负相关。MTT法检测显示,不同浓度梯度的RSV干预可一定程度抑制小鼠巨噬细胞的增殖,随着RSV浓度升高,巨噬细胞生存活力下降。（10）Western-Blot检测结果显示,经RSV干预后,AS模型小鼠巨噬细胞中自噬相关分子LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1、p62、AMPK、P-AMPK和Sirt1表达均上调,p-P70 s6k、LC3-1的表达下调。（11）Western-Blot检测结果提示,经RSV干预后,AS模型小鼠巨噬细胞中凋亡相关因子P53、cle-Caspase3、cle-PARP、Bax表达上调,凋亡因子Bcl-2的表达下降。（12）Western-Blot检测结果显示,经RSV干预后,脂代谢相关分子PPARα和CYP7A1在AS模型小鼠巨噬细胞中表达增强。结论（1）白藜芦醇可以减轻小鼠肝脏的脂肪变性、降低小鼠外周血的血脂水平,降低小鼠的动脉粥样硬化指数,还可以使其肝组织和血清中抗氧化分子的水平升高,从而影响小鼠的动脉粥样硬化进展。（2）白藜芦醇可以通过影响小鼠巨噬细胞的自噬和凋亡,调节其脂代谢相关因子,达到抗动脉粥样硬化的作用。
闫珍珍[10]（2019）在《Tollip在肝脏缺血再灌注损伤中的功能和机制研究》文中指出肝脏缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury,IRI）是出血热休克、肝脏切除和肝脏移植手术的主要并发症,临床上缺乏有效的治疗方法。肝脏IRI呈现动态的过程,包括局部缺血损伤和炎症介导的再灌注损伤两个阶段。在肝脏缺血阶段,缺氧导致肝细胞内线粒体氧化磷酸化功能低下、三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）迅速耗尽、酸性物质大量积累、Ca2+超载等,引发肝实质细胞的初步损伤;在再灌注时期,血液的重新输入,导致大量的活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）产生、Kupffer细胞活化、炎症相关因子增多、细胞黏附因子的表达增加,进而促进中性粒细胞活化和向损伤肝细胞的浸润,释放有毒物质,导致肝细胞的凋亡和坏死。大量研究表明,再灌注期的炎症反应和细胞死亡是肝脏IR导致的组织破坏的主要原因。因此,寻找对肝脏IRI的过程高度敏感并密切调控这些病理特征的因子是开发治疗肝脏IRI方法的迫切需要。Tollip（Toll-interacting protein）是和白介素1受体相关蛋白（Interleukin-1receptor accessory protein,IL-1RAcP）胞质部分相互作用的一个蛋白,在炎症通路中发挥复杂的调控功能。在Toll-like信号通路中,Tollip扮演负调控因子的角色,抑制Toll信号通路的发生。然而在肝脏组织中,Tollip的缺失能够通过阻断ROS的生成来减弱炎症因子的表达。另一方面,Tollip通过调控PI3K-Akt和核转录因子kappa B（Nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路在心肌梗死和脑中风疾病模型中发挥其促进细胞炎症和凋亡的功能。由此可知,Tollip在调控细胞炎症和凋亡方面具有重要的作用,但是关于Tollip在肝脏IRI发生中的功能还未见报道。本研究应用了多种组学方法系统地分析了肝脏IRI发生的主要诱发因素和潜在的治疗靶点。通过蛋白质组学分析,我们发现Tollip蛋白的表达与肝脏IRI过程密切相关。利用Tollip敲除（Tollip knockout,Tollip-KO）小鼠和Tollip下调的肝细胞,我们证实肝细胞Tollip在IRI病理过程中发挥重要的调控作用。进一步通过表型评价结合RNA-seq数据分析,我们发现肝细胞Tollip缺失能够抑制细胞死亡和炎症反应,显着减轻IR诱导的肝损伤。分子机制研究表明,Tollip能够和细胞凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1）相互作用,促进肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6）招募到ASK1上,从而增强ASK1的N端二聚化并激活ASK1下游的c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）/p38信号通路。Tollip的MF基序和TRAF6的自身泛素链的形成则是Tollip调控ASK1-丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路所必需的。我们的研究证实Tollip在肝脏IRI发生中发挥重要功能,Tollip的缺失通过抑制ASK1-JNK/p38信号通路激活减轻肝脏IRI。抑制Tollip或其与ASK1的相互作用可能成为治疗肝IR损伤的有效方法。
二、犬小肠缺血再灌注后一氧化氮和超氧化物歧化酶的改变及肝脏中凋亡基因的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、犬小肠缺血再灌注后一氧化氮和超氧化物歧化酶的改变及肝脏中凋亡基因的表达（论文提纲范文）
（1）杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中药杜仲对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）参附注射液调节NOS/NO信号通路保护LPS损伤的脐静脉血管内皮细胞的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要的实验试剂 |
| 2.1.2 主要的实验设备 |
| 2.1.3 主要的试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代HUVEC的培养及鉴定 |
| 2.2.2 MTT法检测筛选LPS诱导HUVEC细胞损伤的合适剂量 |
| 2.2.3 不同浓度SFI对 LPS损伤HUVEC生长的影响 |
| 2.2.4 Griess法检测HUVEC上清液中NO含量检测 |
| 2.2.5 Q-PCR检测SFI对 LPS诱导的 HUVEC中 e NOS、iNOS的 mRNA表达的影响 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测HUVEC凋亡 |
| 2.2.7 罗丹明123(RH-123)染色法测定HUVEC的线粒体膜电位 |
| 2.2.8 二氢乙锭(DHE)染色检测HUVEC细胞活性氧水平 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 原代培养HUVEC细胞形态学情况 |
| 3.2 LPS对脐静脉内皮细胞生存率的影响 |
| 3.3 SFI对 LPS诱导的脐静脉内皮细胞生存率的影响 |
| 3.4 SFI对 LPS诱导的HUVEC上清液中NO含量的影响 |
| 3.5 SFI对 LPS诱导的 HUVECs中 eNOS的 m RNA表达的影响 |
| 3.6 SFI对 LPS诱导的 HUVECs中 iNOS的 m RNA表达的影响 |
| 3.7 流式细胞仪检测SFI对 LPS诱导的HUVEC细胞凋亡的影响 |
| 3.8 RH-123 染色法检测SFI对 LPS诱导损伤的HUVEC线粒体膜电位的影响 |
| 3.9 DHE染色评价SFI对 LPS诱导损伤的HUVEC细胞活性氧水平的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 中药对血栓闭塞性脉管炎相关因子的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 一氧化氮信号通路与动脉粥样硬化 |
| 参考文献 |
（3）CCN1敲低通过ERK通路对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 综述 肝缺血再灌注损伤的机制及预防和治疗策略 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肝缺血再灌注损伤的机制 |
| 1.2.1 无氧代谢、酸中毒与细胞程序性死亡 |
| 1.2.2 细胞内Ca~(2+)超载与细胞程序性死亡 |
| 1.2.3 线粒体通路在HIRI细胞程序性死亡中的作用机制 |
| 1.2.4 氧化应激在HIRI细胞程序性死亡中的作用机制 |
| 1.2.5 炎症反应与细胞程序性死亡 |
| 1.2.6 其他炎症介质 |
| 1.3 肝缺血再灌注损伤与细胞程序性死亡 |
| 1.4 HIRI中细胞程序性细胞死亡的类型 |
| 1.4.1 细胞凋亡(apoptosis) |
| 1.4.2 坏死性凋亡(necroptosis) |
| 1.4.3 细胞焦亡(pyroptosis) |
| 1.4.4 自噬(autophagy) |
| 1.5 HIRI的预防和治疗 |
| 1.5.1 药物预防与治疗 |
| 1.5.2 抗凋亡治疗 |
| 1.6 器官移植过程中的肝保护 |
| 1.6.1 缺血预处理(IPC)和缺血后处理(IPost C) |
| 1.6.2 离体肝脏机械灌注 |
| 1.6.3 低温机械灌注(Hypothermic machine perfusion,HMP) |
| 1.6.4 亚低温机械灌注(subnormothermic machine perfusion,SNMP) |
| 1.6.5 常温机械灌注(normothermic machine perfusion,NMP) |
| 1.7 总结与展望 |
| 第2章 CCN1敲低通过抑制ERK通路对肝缺血/再灌注损伤产生保护作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设备及材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要实验设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物模型的建立 |
| 2.3.2 病理检测 |
| 2.3.3 TUNEL检测 |
| 2.3.4 Western blot |
| 2.3.5 总RNA提取 |
| 2.3.6 试剂盒检测TNF-α、IL-6、MPO、AST与ALT |
| 2.3.7 细胞培养 |
| 2.3.8 病理TUNEL检测见在体实验部分 |
| 2.3.9 Weston blot见在体实验部分 |
| 2.3.10 总RNA提取见在体实验部分 |
| 2.3.11 Elisa检测TNF-α与 IL-6见在体实验部分 |
| 2.3.12 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足之处 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）大鼠HIRI模型中Hcy代谢与肝龙胶囊预处理的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 大鼠HIRI中氧化应激介导损伤的变化与作用 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器与器械 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与HIRI模型建立 |
| 2.2 样品采取与处理 |
| 2.3 10%肝组织匀浆制备与总蛋白浓度测定 |
| 2.4 肝组织病理变化 |
| 2.5 肝组织中XOD活力的测定 |
| 2.6 肝组织中GSH含量和GSH-Px、CAT活力的测定 |
| 2.7 肝组织中NO含量和NOS活力的测定 |
| 2.8 肝组织中SOD活力和MDA含量的测定 |
| 2.9 大鼠肝脏损伤观察指标检测 |
| 2.10 实时荧光定量PCR测定肝组织α-SMA和 OPN mRNA表达水平 |
| 2.11 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大鼠HIRI模型建立情况 |
| 3.2 大鼠肝脏脏器系数 |
| 3.3 大鼠肝组织病理变化 |
| 3.4 肝组织中XOD活力的变化 |
| 3.5 肝组织中GSH含量和GSH-Px、CAT活力的变化 |
| 3.6 肝组织中NO含量和NOS活力的变化 |
| 3.7 肝组织中SOD活力和MDA含量的变化 |
| 3.8 大鼠肝脏损伤情况 |
| 3.9 大鼠肝组织中OPN和α-SMA的 mRNA表达水平 |
| 4 讨论 |
| 第二章 Hcy及相关代谢酶在大鼠HIRI模型中的作用研究 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器与器械 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 肝组织中Hcy含量的测定 |
| 2.2 RT-qPCR测定肝组织MS、CβS、MTHFR、BHMT及 ER-α的表达水平 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肝组织中Hcy含量的测定 |
| 3.2 扩增曲线结果 |
| 3.3 溶解曲线结果 |
| 3.4 大鼠肝组织MS、CβS、MTHFR及 BHMT mRNA表达水平的变化 |
| 3.5 大鼠肝组织ER-αmRNA表达水平的变化 |
| 4 讨论 |
| 第三章 肝龙胶囊对大鼠HIRI的防治研究 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器与器械 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物分组、给药及造模 |
| 2.2 样品采取与处理 |
| 2.3 10%肝组织匀浆制备与蛋白浓度测定 |
| 2.4 肝组织病理观察 |
| 2.5 大鼠血浆AST与 ALT活力的测定 |
| 2.6 大鼠肝肝组织HA与LN含量的测定 |
| 2.7 大鼠肝组织SOD、XOD活力和MDA、Hcy含量的测定 |
| 2.8 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大鼠状态与生存情况观察 |
| 3.2 大鼠肝组织病理变化 |
| 3.3 大鼠血浆中AST和 ALT的活力变化 |
| 3.4 大鼠肝组织中HA、LN含量的变化 |
| 3.5 大鼠肝组织SOD活力和MDA含量的改变 |
| 3.6 大鼠肝组织XOD活力与Hcy含量的变化 |
| 4 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 高同型半胱氨酸的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（5）ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 腹腔镜微创技术简介 |
| 1.1.1 腹腔镜微创技术的发展简介 |
| 1.1.2 腹腔镜肝切除术的发展应用 |
| 1.1.3 腹腔镜微创技术的客观评价 |
| 1.1.4 腹腔镜微创技术的发展方向 |
| 1.2 肝脏缺血再灌注损伤 |
| 1.2.1 肝脏缺血再灌注损伤的发生机制 |
| 1.2.2 肝脏缺血再灌注损伤的预防治疗 |
| 1.2.3 探究肝脏缺血再灌注损伤的实验动物模型 |
| 1.3 间充质干细胞概述 |
| 1.3.1 干细胞的生物学特性与分类 |
| 1.3.2 间充质干细胞的由来与定义 |
| 1.3.3 间充质干细胞生物学功能 |
| 1.3.4 间充质干细胞作用机制 |
| 1.3.5 干细胞临床应用的安全性 |
| 1.4 间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.1 间充质干细胞的旁分泌作用 |
| 1.4.2 间充质干细胞条件培养基的治疗作用 |
| 1.4.3 脂肪间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.4 脂肪间充质干细胞条件培养基的临床应用 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验器材 |
| 2.1.3 试验药品及试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养 |
| 2.2.2 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 2.2.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 2.2.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 2.2.5 小型猪腹腔镜下肝缺血再灌注合并部分切除模型的建立 |
| 2.2.6 腹腔镜建立肝缺血再灌注合并部分切除模型的安全性监测 |
| 2.2.7 小型猪ADSC-CM对血液常规指标的影响 |
| 2.2.8 小型猪ADSC-CM对肝组织形态学观察 |
| 2.2.9 小型猪ADSC-CM对肝脏酶谱的影响 |
| 2.2.10 小型猪ADSC-CM对肝脏氧化应激的影响 |
| 2.2.11 小型猪ADSC-CM对炎症反应的影响 |
| 2.2.12 小型猪ADSC-CM对肝细胞凋亡的影响 |
| 2.2.13 小型猪ADSC-CM对肝再生的影响 |
| 2.2.14 小型猪ADSC-CM成分检测 |
| 2.2.15 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养和形态比较 |
| 3.2 小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 3.2.1 表面抗原的鉴定 |
| 3.2.2 成骨分化能力的鉴定 |
| 3.2.3 成脂分化能力的鉴定 |
| 3.2.4 成肝分化能力的鉴定 |
| 3.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 3.3.1 增殖能力的比较 |
| 3.3.2 迁移能力的比较 |
| 3.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 3.4.1 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取 |
| 3.4.2 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的浓缩 |
| 3.5 腹腔镜建立肝损伤模型安全性监测结果 |
| 3.6 血液常规指标检测结果 |
| 3.6.1 白细胞(WBC) |
| 3.6.2 中性粒细胞(NE) |
| 3.6.3 淋巴细胞(LY) |
| 3.7 肝组织形态学观察结果 |
| 3.7.1 肝脏病理结构观察结果 |
| 3.7.2 肝脏超微结构观察结果 |
| 3.8 术后肝脏酶谱检测结果 |
| 3.8.1 谷丙转氨酶(ALT) |
| 3.8.2 谷草转氨酶(AST) |
| 3.8.3 碱性磷酸酶(ALP) |
| 3.8.4 乳酸脱氢酶(LDH) |
| 3.8.5 总胆红素(TBIL) |
| 3.8.6 总蛋白(TP) |
| 3.9 肝组织氧化应激检测结果 |
| 3.9.1 丙二醛(MDA) |
| 3.9.2 超氧化物歧化酶(SOD) |
| 3.9.3 过氧化氢酶(CAT) |
| 3.9.4 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) |
| 3.9.5 髓内过氧化物酶(MPO) |
| 3.10 炎症反应水平检测结果 |
| 3.10.1 血清炎症相关指标检测结果 |
| 3.10.2 肝脏组织炎症相关基因水平检测结果 |
| 3.11 肝细胞凋亡水平检测结果 |
| 3.11.1 肝脏组织凋亡相关酶活性检测结果 |
| 3.11.2 肝脏组织凋亡相关基因水平检测结果 |
| 3.11.3 肝脏组织凋亡相关蛋白水平检测结果 |
| 3.11.4 肝脏组织Fas和Fasl免疫组织化学染色结果 |
| 3.11.5 肝脏组织TUNEL染色结果 |
| 3.12 肝脏再生水平检测结果 |
| 3.12.1 血清再生相关指标检测结果 |
| 3.12.2 组织再生相关基因检测结果 |
| 3.12.3 组织再生相关蛋白检测结果 |
| 3.12.4 肝脏组织Ki67免疫组织化学染色结果 |
| 3.13 小型猪ADSC-CM成分分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ADSCs培养方法的改良 |
| 4.2 ADSC-CM对肝脏缺血再灌注损伤的研究基础 |
| 4.3 ADSC-CM对小型猪肝脏功能的影响 |
| 4.4 ADSC-CM对小型猪氧化应激的影响 |
| 4.5 ADSC-CM对小型猪炎症反应的影响 |
| 4.6 ADSC-CM对小型猪细胞凋亡的影响 |
| 4.7 ADSC-CM对小型猪肝脏再生的影响 |
| 4.8 小型猪ADSC-CM成分分析的探讨 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）异槲皮素预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠肾缺血再灌注损伤模型的建立及IQ预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤的肾功能及其相应肾脏组织学的保护作用 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 第一部分小结 |
| 第二部分 IQ预处理在肾缺血再灌注损伤中抗炎症反应的作用及其机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 IQ预处理在肾缺血再灌注损伤中抗氧化应激的作用及其机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四部分 IQ预处理在肾缺血再灌注损伤中抗凋亡的作用及其机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肾缺血再灌注损伤的病理生理过程及治疗的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 英文缩略词及其中英文对照表 |
| 致谢 |
（7）运输应激对山羊主要器官的应激损伤及热休克蛋白表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 综述 |
| 1 应激对动物机体的影响 |
| 1.1 应激与心脏 |
| 1.2 应激与肝脏 |
| 1.3 应激与肾脏 |
| 1.4 应激与呼吸系统 |
| 1.5 应激与免疫器官 |
| 1.6 应激与肠道 |
| 1.7 运输应激对动物生理、内分泌指标及肉质的影响 |
| 2 热休克蛋白与动物器官保护 |
| 2.1 热休克蛋白与心脏 |
| 2.2 热休克蛋白与肝脏 |
| 2.3 热休克蛋白与肾脏 |
| 2.4 热休克蛋白与肺脏 |
| 2.5 热休克蛋白与免疫器官 |
| 2.6 热休克蛋白与肠道 |
| 第二章 运输应激对山羊心脏的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要化学试剂 |
| 1.3 实验方案与设计 |
| 1.4 石蜡包埋及HE染色 |
| 1.5 透射电镜技术 |
| 1.6 实时定量PCR |
| 1.7 免疫组织化学 |
| 1.8 Western blot |
| 1.9 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊心脏的显微病理学观察 |
| 2.2 山羊心脏的超微病理学观察 |
| 2.3 山羊心脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.4 山羊心脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第三章 运输应激对山羊肝脏的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊肝脏的显微病理学观察 |
| 2.2 山羊肝脏的超微病理学观察 |
| 2.3 山羊肝脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.4 山羊肝脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第四章 运输应激对山羊肾脏的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊肾脏的病理学观察 |
| 2.2 山羊肾脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.3 山羊肾脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第五章 运输应激对山羊肺脏、气管和支气管的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊气管的病理学观察 |
| 2.2 山羊支气管的病理学观察 |
| 2.3 山羊肺脏的病理学观察 |
| 2.4 山羊气管和支气管三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.5 山羊肺脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.6 山羊气管、支气管和肺脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第六章 运输应激对山羊免疫器官的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊淋巴结和脾脏的病理学观察 |
| 2.2 山羊淋巴结和脾脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.3 山羊淋巴结和脾脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第七章 运输应激对山羊小肠的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊小肠的显微病理学观察 |
| 2.2 山羊小肠的超微病理学观察 |
| 2.3 山羊小肠三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.4 山羊小肠三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（8）白藜芦醇在代谢性心血管疾病防治中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 肝脏内PKA活性抑制对脂肪代谢的影响及转录组研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 白藜芦醇对血管内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 成年小鼠心室肌细胞的生理特征和转录组研究及白藜芦醇对其保护效应的干预性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 ROS介导的信号转导在心血管疾病发生发展中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章与科研成果 |
| 致谢 |
（9）白藜芦醇对动脉粥样硬化模型小鼠脂代谢影响及对巨噬细胞作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 白藜芦醇对动脉粥样硬化模型小鼠脂代谢影响的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试验药品 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 标本处理与收集 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型建立及筛选 |
| 2.2 检测指标及方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 小鼠一般情况 |
| 4.2 各组小鼠肝指数比较 |
| 4.3 小鼠肝脏病理学变化 |
| 4.4 血脂水平 |
| 4.5 动脉粥样硬化指数 |
| 4.6 小鼠血清抗氧化水平 |
| 4.7 小鼠肝组织抗氧化水平 |
| 5 讨论 |
| 5.1 白藜芦醇干预对小鼠生长发育指标的影响 |
| 5.2 白黎芦醇干预对小鼠肝组织大体改变及病理改变的影响 |
| 5.3 白黎芦醇干预对小鼠血脂水平的影响 |
| 5.4 白黎芦醇干预对小鼠血清及肝脏抗氧化指标的影响 |
| 6 结论 |
| 第二部分 白藜芦醇对动脉粥样硬化模型小鼠巨噬细胞自噬和凋亡的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要抗体 |
| 1.4 主要仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠巨噬细胞提取 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 MTT法检测细胞增殖活性 |
| 2.4 Western Blotting检测目的蛋白表达 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MTT检测RSV对小鼠巨噬细胞的抑制作用 |
| 3.2 RSV对小鼠巨噬细胞凋亡与自噬的影响及机制 |
| 3.3 RSV对小鼠鼠巨噬细胞凋亡和自噬的相关性的研究 |
| 3.4 RSV对小鼠巨噬细胞脂代谢分子的作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 白藜芦醇对小鼠巨噬细胞的自噬的影响 |
| 4.2 白藜芦醇对小鼠巨噬细胞的增殖和凋亡的影响 |
| 4.3 自噬和凋亡之间的关系 |
| 4.4 PPAR-α、CYP7A1 在小鼠巨噬细胞脂代谢中的作用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（10）Tollip在肝脏缺血再灌注损伤中的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.肝脏缺血再灌注损伤 |
| 1.1.肝脏缺血再灌注损伤概述 |
| 1.2.肝脏IRI的发病机制 |
| 1.2.1.代谢性酸中毒 |
| 1.2.2.钙离子超载 |
| 1.2.3.线粒体 |
| 1.2.4.NO和ET的失衡 |
| 1.2.5.氧化应激 |
| 1.2.6.KCs的活化和炎症因子的释放 |
| 1.2.7.PMNs的激活和浸润 |
| 1.3.肝脏IRI的治疗策略 |
| 1.3.1.缺血预处理 |
| 1.3.2.药理学处理 |
| 1.3.3.基因治疗 |
| 2.Tollip蛋白 |
| 2.1.Tollip蛋白简介 |
| 2.2.Tollip蛋白和炎症、凋亡 |
| 3.MAPKs信号通路 |
| 3.1.MAPKs信号通路概述 |
| 3.2.MAPKs信号通路的主要途径 |
| 3.2.1.细胞外信号调节激酶1/2信号通路 |
| 3.2.2.c-jun氨基末端激酶信号通路 |
| 3.2.3.p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路 |
| 3.2.4.细胞外信号调节激酶5信号通路 |
| 3.3.MAPKs与肝脏IRI |
| 3.4.ASK1的活化 |
| 4.研究思路及意义 |
| 第二章 实验材料、试剂与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1.表达载体克隆材料 |
| 1.2.动物实验材料 |
| 1.3.生物信息学材料 |
| 1.4.病理实验材料 |
| 1.5.细胞实验材料 |
| 1.6.免疫共沉淀及免疫印迹实验材料 |
| 1.7.荧光定量PCR实验相关材料 |
| 2.实验试剂 |
| 3.实验方法 |
| 3.1.表达载体克隆实验方法 |
| 3.2.动物实验方法 |
| 3.3.病理实验方法 |
| 3.4.生物信息学方法 |
| 3.5.细胞实验方法 |
| 3.6.分子实验方法 |
| 3.7.统计学方法 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 1.肝脏中Tollip的蛋白表达和肝脏IRI密切相关 |
| 2.Tollip的缺失能够改善IR/HR造成的肝脏/肝细胞损伤 |
| 2.1.Tollip的缺失减弱IR诱导的肝脏损伤 |
| 2.2.TOLLIP下调/缺失降低了HR造成的肝细胞的损伤 |
| 3.Tollip依赖于ASK1-JNK/P38通路来调控肝脏IRI |
| 3.1.Tollip影响由IR激活的MAPK信号通路 |
| 3.2.Tollip的缺失/下调减弱了IR/HR激活的ASK1-JNK/p38信号通路 |
| 4.TOLLIP依赖于其MF基序和TRAF6的泛素链促进ASK1 N端二聚化 |
| 4.1.TOLLIP能够促进ASK1的N端二聚化 |
| 4.2.TOLLIP的MF基序和TRAF6的泛素链对TOLLIP促进ASK1 N端二聚化是必需的 |
| 第四章 研究总结及展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
四、犬小肠缺血再灌注后一氧化氮和超氧化物歧化酶的改变及肝脏中凋亡基因的表达（论文参考文献）
- [1]杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 张世龙. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]参附注射液调节NOS/NO信号通路保护LPS损伤的脐静脉血管内皮细胞的作用及机制[D]. 万函. 南昌大学, 2021(01)
- [3]CCN1敲低通过ERK通路对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究[D]. 刘环秋. 吉林大学, 2021(01)
- [4]大鼠HIRI模型中Hcy代谢与肝龙胶囊预处理的作用[D]. 卢建升. 大理大学, 2020(05)
- [5]ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究[D]. 焦智慧. 东北农业大学, 2020(04)
- [6]异槲皮素预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D]. 梁苏东. 苏州大学, 2020(06)
- [7]运输应激对山羊主要器官的应激损伤及热休克蛋白表达的影响[D]. 郑文亚. 甘肃农业大学, 2019
- [8]白藜芦醇在代谢性心血管疾病防治中的作用和机制研究[D]. 杨济宁. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [9]白藜芦醇对动脉粥样硬化模型小鼠脂代谢影响及对巨噬细胞作用机制的研究[D]. 石磊. 青岛大学, 2019(07)
- [10]Tollip在肝脏缺血再灌注损伤中的功能和机制研究[D]. 闫珍珍. 武汉大学, 2019(06)