一、Carboxyl Terminus Truncated Human Papillomavirus Type 58 L1 Protein Maintains Its Bioactivity and Ability to Form Virus-like Particles（论文文献综述）
王蕾[1]（2021）在《重组HPV16 L1壳蛋白的原核表达与分离纯化》文中研究说明持续感染人乳头瘤病毒可诱发几乎所有的宫颈癌,其中约55%的病例是由HPV16引起的,故HPV16预防性疫苗的研制具有广阔的前景。当前,预防性HPV疫苗的重要研究方向是VLPs疫苗。本研究利用大肠杆菌表达HPV16 L1蛋白,经体外组装形成VLPs,具有良好的免疫原性。在Gen Bank中查找HPV16 L1序列,根据大肠杆菌偏好进行密码子优化并合成该序列,通过基因重组技术得到表达载体p ET30a-16 L1。将其转化至大肠杆菌中进行诱导表达,优化表达条件以提高重组蛋白产量,确定蛋白诱导表达条件为:加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,在25℃的条件下诱导菌体表达。为保证后续实验菌体一致,本研究应用发酵罐高密度培养工程菌,经离心收集到2.56 kg的菌体。采用高压均质破碎菌体,并对高压均质条件进行优化,结果表明,在800（±50）bar,均质4次的条件下菌体完全破碎。为提高蛋白回收率,本实验采用NuviaTM S,UNOsphereTM rapid S,POROSTM 50HS,POROSTM XS四种阳离子交换层析介质对蛋白进行分离纯化,结果显示,POROS?XS纯化目的蛋白的回收率最高,为37%。DOE方法优化POROS?XS层析参数,最终采用5 m L/min的上样流速和p H为8.0的缓冲体系,经层析优化后,蛋白回收率提升到49.1%。为得到纯度更高的蛋白,本实验采用Hexyl-650C,Phenyl-600M,Butyl-600M,POROSTM Ethyl四种疏水层析介质进一步分离纯化蛋白,最终选择POROSTM Ethyl。两步纯化后,蛋白浓度为1.0 mg/m L,纯度为97%,蛋白回收率为46.23%,内毒素含量小于12.5 EU/mg,宿主残余蛋白为6.00 ng/mg,宿主残余DNA为3.30 ng/mg。经透析组装,利用粒径仪及透射电镜对HPV16 VLPs形态大小进行鉴定,结果表明颗粒大小与天然病毒一致,60 nm左右。假病毒中和抗体评价VLPs在小鼠体内所诱导的抗体水平,免疫6周后,血清的中和抗体滴度Log10平均值为4.01,表明该蛋白体外组装的VLPs具有良好的免疫原性。本研究利用大肠杆菌表达系统获得了HPV16 VLPs,并对层析纯化工艺进行优化,为病毒样颗粒疫苗的研发奠定实验基础。
刘真真[2]（2020）在《戊型肝炎病毒ORF2的结构分析及戊型肝炎-口蹄疫联合疫苗的免疫原性研究》文中研究说明戊型肝炎（hepatitis E,HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）引起的肝脏疾病,临床表现为急性肝炎,慢性肝病患者合并HEV感染可引发肝功能衰竭等严重后果,且HEV在孕妇中病死率高达20%。WHO资料表明全球每年约有2010万人被HEV感染,330万急性患者,并有大约70000人死亡。在中国HEV感染普遍存在,散发病例呈缓慢上升趋势,戊肝已成为全球和我国严重的公共卫生问题。HEV是一种单股正链RNA病毒,颗粒为正二十面体,直径约为35nm,基因组含ORF1、ORF2和ORF3三个读码框架。其中基因组ORF2为编码全长660个氨基酸（amino acid,aa）的单一结构蛋白（pORF2）。由于HEV体外培养技术不成熟,灭活疫苗尚未研制成功,因此研究主要集中于基因工程表达。目前有关ORF2蛋白的研究表现为在不同宿主细胞中表达不同长度的截短蛋白,并且这些蛋白可以组装成不同类型的HEV病毒样颗粒,分别为T=1和T=3。然而,到目前为止,ORF2全长1-660氨基酸组装成病毒颗粒的机制仍旧不完全清楚,尤其是C-末端氨基酸在病毒颗粒组装过程中的作用不明确。根据HEV全基因序列的差异,将HEV毒株分为4个基因型,分别是基因1型、2型、3型和4型。其中基因1、2型只感染人,基因3、4型既可感染人又可感染动物,为人畜共患型。HEV最主要的宿主为猪,并且猪是人戊型肝炎的主要传染源,HEV基因3、4型在猪和人之间相互感染,因此我们可以从消除传染源着手进行预防和控制人类HEV感染。由于猪感染HEV后并不发病,且有一定的自愈性,养猪者对接种疫苗很可能并不认可。因此,只有研制一种戊型肝炎和另一种对猪危害严重疾病的联合疫苗才能有效解决这一问题。口蹄疫（Foot-and-mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth Disease virus,FMDV）引起偶蹄类动物的高度传染性疾病。感染通过易感动物种群迅速传播导致大规模的动物死亡,可造成巨大的经济损失和政治影响,世界动物卫生组织（OIE）将FMD列为A类动物疫病之首。FMDV属于微小RNA病毒科口蹄疫病毒属,目前已知该病毒有7个血清型为O型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3型和亚洲Ⅰ型,我国目前流行的毒株主要以O型为主,其次为A型。2011年东南亚O/Mya/98株的侵袭导致东亚国家如中国、日本、蒙古、俄罗斯和韩国的猪大规模口蹄疫爆发,O型口蹄疫病毒的新猪毒-2株也存在中国的一些地区和周边国家。目前猪O型口蹄疫灭活疫苗制苗毒株为O/MYA/98/BY/2010株（Mya-98谱系）和O/GX/09-7株+O/XJ/10-11株。本研究将讨论HEV ORF2结构C末端在形成VLPs过程中的作用,并筛选出最佳的HEV候选疫苗,进而开发一种HEV与FMDV的联合疫苗既可以预防猪口蹄疫,又可避免猪感染HEV,从源头控制人戊型肝炎的感染,达到预防和控制人戊型肝炎的目的。一、HEV ORF2不同截短蛋白的质粒构建与原核表达基因工程疫苗研究所主要研究HEV ORF2相关C端的蛋白结构,p179、p216、p222和p231蛋白为基因工程疫苗研究所保存,蛋白p216、p222和p231在天然状态下呈现的聚体形态和VLPs与蛋白p179有一定差异性,因此根据截短片段的差异又表达了5个不同N端和C端截止的ORF2蛋白片段p188、p196、p189、p199和p209,分析形成多聚体的关键氨基酸。结果如下:1.1原核大肠杆菌成功表达p188、p196、p189、p199和p209蛋白,均为可溶性蛋白,通过His标签纯化技术成功获得高纯度蛋白溶液。1.2非还原SDS-PAGE和Western blot结果显示C末端截止到aa617的p179、p188和p196蛋白均表现为二聚体形态和极少量四聚体,且与单克隆抗体5G5反应;而N端固定到aa439,C端有不同延伸的p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白均形成多聚体,且多聚体都与单克隆抗体5G5反应。表明aa618-627为形成多聚体形态结构的关键氨基酸区域。1.3透射电镜观察蛋白多聚体与VLPs的形成有直接关系。C末端延伸超过aa627的蛋白p189、p199、p209、p216、p222和p231形成颗粒数目多且具有明确的球形结构;而蛋白p179、p188和p196的颗粒结构不太稳定,数目较少。2.ORF2截短蛋白组装VLPs的结构分析为研究多聚体和VLPs形成的原因,进一步分析横跨aa618-627结构域的第二组蛋白,并验证参与形成多聚体和VLPs的氨基酸。原核表达pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626一系列重组蛋白,蛋白p179和p189作为对照进行分析;此外,将p189蛋白中Cys627突变为Ala即p189A,p199蛋白中Cys627和Cys630突变为Ala即p199A,p222蛋白中Cys627、Cys630和Cys638均突变为Ala即p222A,深入验证Cys在蛋白形成多聚体和VLPs中的重要作用。结果如下:2.1蛋白pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626均成功表达,非还原SDS-PAGE和Western blot结果表明p179、pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626为二聚体,而p189为多聚体形态,提示Cys627为关键氨基酸,在蛋白多聚体形成过程中发挥重要作用。2.2突变蛋白p189A、p199A和p222A的形态仅表现为二聚体和少量四聚体,而未突变的三个蛋白呈多聚体形态,突变前后有显着差异;还原剂DTT处理9个蛋白后,非还原SDS-PAGE和Western blot结果表明p179、p188和p196蛋白呈现为二聚体形态不变,而p189、p199、p209、p216、p222和p231由多聚体形态转化为二聚体和少量四聚体,这些结果提示蛋白多聚体组装形成中含有二硫键。2.3透射电镜观察结果显示p179、p188、p196三个蛋白形成的病毒样颗粒数目较少,且颗粒形态不明显;p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白可观察到大量病毒样颗粒,且立体结构明显,与天然病毒形态更加接近;DTT处理后,颗粒形态被破坏,数目减少。提示多聚体可通过一定的组装方式形成病毒样颗粒,并且二硫键具有稳定颗粒形态的作用。2.4还原剂TCEP处理前后,通过动态激光散射实验评估不同VLPs的粒径和粒径分布,蛋白p189和p222粒子的大小明显减小,阴性对照p179 VLPs几乎无变化;散射光强度结果表明p189和p222 VLPs中加入还原剂后其强度明显降低,而p179VLPs则无变化。2.5 HEV单克隆抗体5G5与免疫磁珠结合并分离粪便HEV病毒粒子,在透射电镜下观察正常HEV病毒颗粒直径约为40nm。DTT处理样品后,电镜下则观察不到HEV颗粒,有可能在DTT还原作用下病毒衣壳被解聚。2.6用Phyre2 server在线预测p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白二聚体结构,用Py Mol software展现蛋白3D结构,观察Cys627、Cys630和Cys638在二聚体结构中的位置。从Gen Bank下载162个HEV 1﹑2﹑3﹑4基因型及不同宿主来源的HEV毒株的序列,利用生物信息学软件MEGA 5进行氨基酸序列比对,确定pORF2的C端Cys627、Cys630和Cys638的保守性。3.HEV-FMDV联合疫苗的制备和免疫原性研究通过分析不同HEV ORF2截短蛋白的抗原性、稳定性、形成VLPs以及免疫原性等,选择最佳HEV疫苗候选;将HEV重组疫苗与口蹄疫灭活疫苗进行交叉配比,制备不同配比HEV-FMDV联合疫苗,并对其免疫原性进行初步研究。为了能进一步检测出联合疫苗免疫Balb/C小鼠中产生的FMDV抗体IgG水平,采用基因工程技术,表达FMDV VP1上G-H环中和抗原表位重组蛋白,用于检测FMDV特异性抗体。结果如下:3.1蛋白稳定性结果表明在高温37℃环境下p179和p222两个蛋白稳定性最好;ElliproWeb服务器计算p179和p222蛋白关键抗原表位的突出指数,曲线下面积（AUC）结果表明p222高于p179;单克隆抗体5G5分别与p179和p222两种抗原进行反应,两者均有较高的抗原反应性;相同剂量同一条件下p179和p222免疫小鼠,HEV抗体IgG结果显示p222免疫原性高于p179,具有显着性差异（p=0.007**）。因此,p222重组疫苗作为联合疫苗中HEV最佳候选疫苗。3.2根据FMDV灭活疫苗中所含O/GX/09-7毒株和O/Mya98/XJ/2010毒株,设计可以检测两种毒株的抗原LMYA-GX,将O/GX/09-7毒株VP1上G-H环中和抗原表位aa132-160与O/Mya98/XJ/2010病毒株的VP1上G-H环中和抗原表位aa132-160串联为LMYA-GX（132-160aa-GG-132-160aa）,连接到载体p GEX-4T-2,转化大肠杆菌并成功表达与纯化。3.3 HEV单独组和FMDV单独疫苗组中HEV抗体IgG和FMDV抗体IgG检测:1)间接ELISA法检测FMDV灭活疫苗三种不同浓度（0.5,1,2μg/ml）免疫小鼠的血清FMDV-IgG抗体。所有免疫小鼠在第2周均检测到FMDV-IgG抗体。F0.5疫苗组的抗体滴度在第6周达到最高水平,F1和F2组的抗体滴度在第10周达到最高水平。在整个实验中,F0.5组的抗体滴度均低于其他两组。F1组和F2组在前4周不呈剂量依赖性:F1组在第2周和第4周的FMDV-IgG抗体水平比F2组FMDV-IgG抗体水平高,在第10周两组的水平相似。2)HEV-p222重组疫苗不同剂量（25,50,100μg/ml）免疫小鼠,间接ELISA分析HEV抗体IgG滴度。各组在第2周均未检测到抗HEV抗体,从第4周开始,疫苗组HEV特异性IgG开始增加,第10周E25和E100组达到最高水平,第12周E50组达到最高水平,无剂量依赖性。第4周,E25和E100组抗体滴度比E50组高4倍。在第10周,E25组抗HEV抗体滴度比E50组高5倍,比E100组高2倍。因此,1μg/ml FMDV灭活疫苗和25μg/ml HEV-p222重组疫苗被选择用于制备不同交叉配比的HEV-FMDV联合疫苗。3.4 HEV-FMDV联合疫苗组中HEV抗体IgG和FMDV抗体IgG检测:1)选择1μg/ml FMDV免疫原与三种不同剂量HEV-p222重组疫苗（25,50,100μg/ml）联合制备,即F1+E25,F1+E50,F1+E100,肌内注射小鼠,监测FMDV特异性抗体IgG。结果表明三个联合疫苗组抗FMDV抗体水平均显着高于FMDV灭活疫苗单独组F1。2)选择25μg/ml HEV-p222免疫原与三种不同剂量的FMDV灭活疫苗（0.5,1,2μg/ml）联合制备,即E25+F0.5,E25+F1和E25+F2,肌内注射小鼠。监测HEV-IgG的产生,结果表明HEV-FMDV联合疫苗组诱导体液反应比HEV单独组（E25）更强;在12周的实验中,E25+F0.5组的抗-HEV抗体滴度最高,其次是E25+F2和E25+F1组。综上所述,我们的研究结果表明:1.p179、p188和p196蛋白为二聚体,而p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白为多聚体形态,表明aa618-627为形成多聚体形态结构的关键氨基酸区域。p179、p188、p196蛋白在电镜下观察所形成的VLPs数目较少,形态结构不明显;p189、p199、p209、p216、p222和p231蛋白形成VLPs数目较多,颗粒较为均匀,结构明显。2.通过进一步表达pC618～pC626等一系列重组蛋白,发现Cys627为形成多聚体和VLPs的关键氨基酸。采用非还原SDS-PAGE、Western blot、DLS、透射电镜TEM等技术,加还原剂DTT或TECP以及突变蛋白中Cys为Ala来验证多聚体或VLPs中存在的二硫键,且二硫键主要连接二聚体与二聚体,表明Cys的重要性。天然HEV病毒衣壳中也有可能含有二硫键,以增强衣壳蛋白结构的稳定性。用生物信息学预测二聚体结构并显示C末端三个Cys位于二聚体结构外侧边缘;且162个HEV毒株蛋白序列比对表明Cys627、Cys630和Cys638高度保守,保守率为99.4%、100%和100%。3.首先筛选出最佳HEV重组疫苗,通过蛋白稳定性、中和抗原表位突出AUC、抗原性、形成VLPs、以及免疫原性等多方面评估,HEV-p222蛋白作为HEV-FMDV联合疫苗的候选疫苗。4.将HEV-p222重组疫苗和FMDV灭活疫苗分别设计3个不同剂量,首先研究两者的免疫原性,优选出最佳免疫剂量,进行联合疫苗配比制备;将HEV-p222重组疫苗和FMDV灭活疫苗进行不同的剂量配比,分为F1+E25、F1+E50、F1+E100、F2+E25和F0.5+E25（μg/ml）等5组联合疫苗组进行免疫原性研究,并与HEV单独组和FMDV单独组进行比较,观察评估两种免疫原之间的干扰情况,结果表明两种抗原之间不存在免疫原性的相互影响,并具有免疫原性的协同效应。
周建卫[3]（2020）在《猪圆环病毒的入核机制研究》文中研究指明猪圆环病毒（PCV）是猪圆环病毒病（PCVAD）的主要病原,是目前发现能在哺乳动物体内复制的最小DNA病毒,主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪增生性坏死性肺炎（PNP）。已有的研究分析了 PCV2的吸附、入侵、基因组的复制和转录调控等过程,但其胞内运输和入核机制尚不明确,病毒能否成功将遗传物质（环状DNA）运输至细胞核周并最终入核决定它能否进行有效复制。病毒与宿主间的相互作用是机体致病机理和免疫防御之间的一场旷日持久的拉锯战,其最终结局或是激活宿主的免疫防御系统以消灭病毒,抑或是劫持宿主的免疫防御机制以促进病毒的传播。因此,全面系统地了解宿主和病毒蛋白之间的相互作用以及病毒如何通过与宿主间的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions,PPIs）劫持宿主细胞的生物学过程,可为探究病毒的复制与致病机制和开发新的抗病毒药物提供有效的信息和线索。本研究首先发现PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性,有利于PCV2病毒粒子的核靶向运输过程,且通过与HDAC6蛋白相互作用抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能,并最终促进圆环病毒的复制过程。其次从免疫共沉淀串联质谱方法入手,发现核仁磷蛋白NPM1能与PCV2Cap蛋白相互作用,且证明PCV2病毒以完整衣壳蛋白的形式经微管运输至细胞核周时,Cap蛋白能促使NPM1蛋白发生核穿梭,导致其由核仁易位至核质和胞质处,并通过与Cap蛋白直接结合介导病毒粒子的入核,从而促进猪圆环病毒的复制。最后,NPM1蛋白还能通过与PCV3 Cap蛋白NLS结合促进PCV3 Cap蛋白的核仁定位,NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用。1、PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程本实验室前期结果表明在PCV2病毒感染早期衣壳蛋白能通过募集胞浆动力蛋白的IC1亚基进行核靶向运输过程。为了分析其他宿主蛋白是否能通过影响微管的功能发挥参与调控PCV2的胞内运输过程以及PCV2能否调节微管蛋白的乙酰化修饰从而影响微管稳定性,我们通过PCV2感染和Cap蛋白表达处理PK-15细胞并分析乙酰化α-tubulin的表达水平,结果发现α-tubulin的乙酰化修饰水平大大提高;而通过HDAC6去乙酰化酶特异性抑制剂-Tubacin药物处理PK-15细胞后可以增强α-tubulin的乙酰化修饰水平并能促进PCV2的复制过程,该结果暗示了 PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性的功能。另外,我们还发现PCV2 Cap蛋白能与HDAC6蛋白共定位和直接相互作用,且Cap蛋白的N端区域（42-100aa）介导与HDAC6蛋白全长相互作用。PCV2 Cap蛋白能在体外和细胞内抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性。HDAC6蛋白能通过诱导α-tubulin发生去乙酰化修饰抑制PCV2病毒的复制从而发挥抗病毒作用,反过来PCV2也能通过Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能。综上所述,PCV2 Cap蛋白能通过与HDAC6相互作用抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性,维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并最终促进猪圆环病毒2型的复制过程。2、PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱PCV2 Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白,可以作为研究圆环病毒与宿主蛋白间相互作用的模型,以便更好地了解病毒的复制周期。本研究将免疫共沉淀（Co-IP）与液相质谱（LC-MS）技术相结合,在PCV2感染PK-15细胞中鉴定到222个与Cap蛋白潜在互作的宿主蛋白,并绘制出一张蛋白质-蛋白质相互作用网络图。GO注释和KEGG通路分析结果表明,与PCV2 Cap蛋白互作的宿主蛋白可能参与了蛋白质结合、DNA转录和复制、物质和能量代谢、先天性免疫应答、MAPK信号通路和剪接体信号通路激活等不同的生物学过程。Co-IP和 GST pull-down 实验证明 PCV2Cap 蛋白能与 hnRNPC、NPM1、DDX21、IC1等蛋白直接相互作用。PCV2Cap蛋白互作宿主蛋白可能会形成新的转录/复制复合体（replication-transcriptioncomplex,RTC）,在 PCV2 的复制和致病过程中起着极其重要的调控作用。3、NPM1蛋白调控PCV2病毒入核的机制研究病毒粒子的入核是PCV2复制的必要条件。然而,核仁穿梭蛋白在PCV2入核过程中的作用机制仍不清楚。本研究首次在PCV2Cap蛋白中鉴定到一个先前未知的、新的核仁定位信号（NoLS）,并发现PCV2能利用宿主的NPM1蛋白促进病毒的复制。激光共聚焦显微镜结果显示,在PCV2感染过程中,NPM1蛋白能从核仁易位至核质和胞质处。Co-IP和GST pull-down实验结果表明,PCV2 Cap蛋白能与NPM1蛋白直接相互作用。互作功能域的精细定位结果显示,PCV2 Cap蛋白NLS-A（1MTYPRRRYRRRRHRPRSHLG20）的精氨酸富集区（ARM）与NPM1-OligoD结构域的Ser48是介导二者相互作用的关键性氨基酸位点。病毒拯救结果表明,PCV2 Cap蛋白NLS-A中ARM的9个精氨酸（Arg）都突变为丙氨酸（Ala）将导致病毒的复制能力降低。NPM1蛋白的敲降和Ser48突变为Glu48都能抑制PCV2的复制。此外,激光共聚焦显微镜结果表明PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM是核仁定位信号（NoLS）。综上所述,PCV2Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,能够通过与NPM1蛋白直接结合促进PCV2病毒的入核。4、NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究NPM1蛋白对非组装的PCV3 Cap蛋白入核的作用机制尚不清楚。本研究首次鉴定到PCV3Cap蛋白新的核仁定位信号（NoLS）,它能利用NPM1蛋白促进自身的核仁定位。激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3Cap蛋白能与NPM1共定位于核仁。Co-IP和GST pull-down实验结果显示,PCV3 Cap蛋白能与NPM1蛋白相互作用。互作结构域的精细定位结果表明,来自陆地的、水生的和禽类的（包括猪、金丝雀、犬、水貂、蜻蜓、鸽、鸭、蝙蝠、鹅和鹦鹉）圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用,表明该互作在进化上极为保守;另外,NPM1-OligoD结构域中Ser48是介导与PCV3 Cap蛋白相互作用的关键性氨基酸位点。NPM1蛋白敲降后将抑制PCV3 Cap蛋白的核仁定位。此外,激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3 Cap蛋白的NLS是核仁定位信号（NoLS）,且NPM1蛋白中Ser48的电荷性质决定与PCV3 Cap蛋白的相互作用。综上所述,PCV3 Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,NPM1蛋白中Ser48的电荷性质对其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用至关重要。上述数据旨在阐明猪圆环病毒复制过程中借助HDAC6和NPM1蛋白实现胞内运输和入核的策略以及“核穿梭”机制,有助于进一步解析猪圆环病毒复制的分子机制以及鉴定潜在的抗病毒药物靶点。
李相梅[4]（2020）在《HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立》文中指出人乳头瘤病毒（HPV）是已知最古老的病毒家族之一,能够导致上皮异常增生及宫颈癌和头颈部癌等多种癌症。HPV病毒颗粒具有保守的二十面体结构。研究表明,外源表达的HPV主要衣壳蛋白（L1）能够自发组装成病毒样颗粒（VLP）,其表面存在HPV的主要中和表位,具有高度的免疫原性,目前已上市或在研的HPV预防性疫苗均以HPV L1 VLP为其主要抗原成分。由于疫苗的高成本、高售价是限制其在发展中国家应用的主要因素,所以研发出价格低廉的高价次HPV预防性疫苗具有重要意义。此外,佐剂也是影响疫苗免疫效果的一个关键因素。因此,本论文拟通过对HPV6 L1蛋白原核表达条件进行优化以提高其可溶性表达量,并进行佐剂筛选以提高疫苗的免疫原性,为HPV VLP预防性疫苗的研发提供实验数据。本研究首先构建了原核表达质粒pET30a（+）-6L1,通过对诱导剂的使用量、诱导温度及共表达分子伴侣等三方面进行优化,确定最佳表达条件;之后选择Al（OH）3、AlPO4和Nano Al三种佐剂与HPV6 L1 VLP共同免疫,采用ELISA和中和试验进行免疫原性评价。结果显示:（1）适当降低蛋白合成速度能够增加目的蛋白可溶性表达量,当诱导剂IPTG使用终浓度为0.1mM、诱导温度为25℃时,HPV6 L1蛋白可溶性表达量更高;（2）分子伴侣TF对HPV6 L1蛋白可溶性表达的增强效果更佳;（3）四组疫苗均能提供较好的、较为持久的保护作用,其中Al（OH）3佐剂组中和抗体水平明显高于其他佐剂组。免疫原性评价是HPV疫苗临床研究中的重要内容,但传统的中和抗体检测方法操作繁琐。当前国内外通用的HPV假病毒中和抗体检测方法是使用携带EGFP的假病毒,这就导致在进行九价免疫血清检测时,需通过九次单独试验,操作复杂且耗时长。本研究是在原有的基础上,选择三种激发、发射波长互不干扰的荧光蛋白EGFP、mTagBFP2、mRFP,用不同型别的假病毒包裹不同颜色的荧光蛋白基因,制备三种单色荧光假病毒PsV6G、PsV16B、PsV52R。通过分别使用单色荧光和三色混合荧光假病毒检测HPV九价疫苗免疫小鼠血清的中和抗体水平,以验证三色混合荧光假病毒检测系统的准确性。结果显示:（1）单色荧光、三色混合荧光假病毒检测试验的板内变异系数（CV）小于10%,板间变异系数（CV）小于20%,说明试验重复性较好;（2）单色荧光与三色混合荧光假病毒检测中和抗体滴度值无统计学差异（P>0.05）,说明两种检测方法具有一致性,且三色混合荧光假病毒检测免疫血清不存在干扰现象。本研究的结果表明,三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法能够应用于HPV九价免疫血清中和抗体的检测,这为一种基于荧光信号的高通量HPV假病毒中和抗体检测方法的建立提供了新思路,为高效、快速地检测HPV九价疫苗临床血清奠定了坚实基础。
时培殿[5]（2020）在《E3泛素连接酶TRAIP调控先天性免疫的机制研究》文中进行了进一步梳理泛素化修饰（Ubiquitination,UB）和小泛素样修饰（Small Ubiquitin-like Modifier,SUMO）是高度保守的蛋白翻译后修饰方式,可深度影响病毒在感染细胞内的增殖过程。肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）互作蛋白（TRAIP）是RING型E3泛素连接酶,在天然免疫、DNA损伤与修复等途径中发挥重要功能。本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染细胞为模型,研究了宿主E3泛素连接酶TRAIP与PRRSV病毒蛋白的相互作用、病毒可通过调控宿主蛋白翻译后修饰,抑制先天性免疫信号通路,促进PRRSV增殖的机制。此外,通过生物质谱挖掘发现TRAIP泛素化修饰的底物蛋白DEx D/H-box家族RNA解旋酶39A（DDX39A）,明确了TRAIP对DDX39A泛素化修饰类型,TRAIP在调控DDX39A抑制天然免疫中发挥的作用,揭示了TRAIP在免疫生物学中的新机理。主要结果如下:（1）TRAIP对PRRSV增殖的影响及其互作病毒蛋白的筛选从PRRSV感染的3D4/21细胞转录组数据中筛选出发挥潜在重要作用的E3泛素连接酶TRAIP,进一步明确PRRSV感染上调TRAIP的表达。通过过表达及敲减实验证明TRAIP促进PRRSV增殖,抑制PRRSV诱导的I型干扰素产生。免疫荧光和免疫荧光结果分析表明TRAIP与PRRSV nsp1α亚基相互作用,TRAIP的LZ结构域与nsp1α的PCPα结构域是两者互作的关键结构域,碱基突变及功能分析发现TRAIP的LZ结构域K205是两者互作的关键位点。（2）PRRSV nsp1α影响TRAIP蛋白翻译后修饰和核质分布PRRSV nsp1α抑制TRAIP的K48多聚泛素化修饰和SUMO修饰。nsp1α抑制TRAIP（WT）多聚泛素化修饰,但对TRAIP（K205R）无影响,暗示nsp1α的抑制作用依赖于两者的互作。位点突变互作实验表明,nsp1α对TRAIP SUMO化修饰的抑制作用并不受两者结合位点突变的影响。TRAIP的双重蛋白翻译后修饰调节作用导致TRAIP细胞质富集。PRRSV nsp1α可以通过抑制TRAIP的SUMO化修饰影响TRAIP细胞核定位。另外,PRRSV nsp1α通过抑制TRAIP K48多聚泛素化修饰,阻滞TRAIP泛素蛋白酶体途径降解,维持TRAIP的丰度及稳定性。（3）PRRSV nsp1α协同TRAIP进一步抑制I型干扰素的产生先前研究表明TRAIP可以促进TBK1 K48多聚泛素化修饰负调控I型干扰素的产生,此外,nsp1α已被鉴定为IFN拮抗剂。本研究通过免疫荧光和免疫共沉淀实验发现nsp1α介导胞质中TRAIP的富集,并与TRAIP及TBK1形成三元复合物,进一步促进了TBK1 K48多聚泛素化和降解,从而拮抗TBK1-IRF3-IFN信号通路。nsp1α和TRAIP共表达较单独表达对IFN-β的抑制效应更为显着。（4）TRAIP-DDX39A负调控RNA病毒诱导的I型干扰素应答通过质谱挖掘TRAIP互作蛋白DDX39A,其是TRAIP K63位泛素化修饰底物蛋白。DDX39A可以与特定先天免疫相关因子（TRAF3、TRAF6、MAVS）的mRNA结合,促进这些抗病毒转录物的核滞留,下调其蛋白质表达,从而负调控I型干扰素的产生。通过仙台病毒（SeV）、水泡口炎病毒（VSV）的细胞感染模型进一步发现,这些RNA病毒感染可以通过上调TRAIP蛋白的表达,促进TRAIP靶向DDX39A的K63多聚泛素化修饰,促进DDX39A与TRAF3、TRAF6、MAVS mRNA结合,抑制其表达,进而抑制I型干扰素的产生。综上,PRRSV nsp1α对TRAIP的双重翻译后修饰调控可促进TRAIP在细胞质中的募集,导致TBK1 K48多聚泛素化上调和降解,从而拮抗TBK1-IRF3-IFN信号通路。我们的研究从病毒蛋白与宿主E3泛素酶TRAIP互作修饰调控角度提出PRRSV逃逸IFN信号通路促进PPRSV增殖的新模型,深化了对PRRSV逃逸宿主先天性免疫机理的认识。研究还发现,入核的TRAIP可介导DDX39A K63多聚泛素化,促进DDX39A与抗病毒转录物TRAF3、TRAF6和MAVS结合,阻滞相关mRNA的核输出和胞质中蛋白的表达,抑制IFN-β的产生。这进一步丰富了RNA病毒感染通过E3泛素连接酶TRAIP的表达调控逃逸宿主先天性免疫,促进病毒增殖的新途径。
朱俐[6]（2019）在《基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究》文中研究说明宫颈癌是全球女性中第四大常见的癌症,已有研究表明持续性感染高危型人乳头瘤状病毒（HPV）病毒是宫颈病变的必要条件。早期感染HPV不会产生任何症状,这是因为HPV L1蛋白是保护性抗原,可激发人自身的免疫系统而清除病毒,又因为HPV L1蛋白是晚期产生的蛋白,主要存在病毒复制期,所以检测HPV L1蛋白能反应患者的免疫状态和HPV DNA是否整合到宿主基因组,从而判断病情发展趋势以及是否能引起恶性病变。不同宫颈癌变的级别与HPV感染型别存在一定差异,人们常常根据患者携带病毒的量来辨别病情,预测宫颈恶性病变的风险,因此当已经确证持续感染HPV后,我们既要根据感染HPV的型别,又要根据患者携带病毒的量,来评判和预测与HPV病毒有关疾病的发展趋势,做到早预防早治疗,降低发病率和死亡率。综上HPV分型检测对早期宫颈癌的筛查起着重要作用,而检测HPV L1蛋白对宫颈疾病发展趋势的预测和HPV感染治疗的预后都具有很大的参考意义,二者结合起来对临床诊断更具实用价值。同时进行HPV分型和HPV L1蛋白检测可弥补彼此的缺点,临床上可极大降低漏诊误诊率,提高恶性病变诊断和预测的准确性,最大程度减少患者的损失。本论文基于纳米材料特性采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI TOF MS）建立高危HPV16、18分型检测方法及HPV16 L1蛋白检测方法,方法具有较高的灵敏度,并且分析速度快,经济高效,应用于临床样本的检测取得良好的结果。1.通过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）偶联反应成功将精胺（SP）修饰到纳米金刚石（NDs）上。通过比较修饰后100 nm和5 nm两种纳米金刚石,发现5 nm的纳米金刚石具有更大的比表面积,修饰效果较好。SP-NDs由于表面覆有大量精胺,精胺在酸性条件显现多胺的特性可带正电,可以通过静电有效地吸引带负电荷的DNA磷酸骨架,研究发现SP-NDs对寡核苷酸具有优异的吸附效果（184 mg/g）,研究还发现SP-NDs不仅可以在稀溶液中提取和富集寡核苷酸,而且可以从复杂基体中,如十二烷基苯磺酸钠和尿素溶液中提取寡核苷酸,是寡核苷酸的优异固体吸附剂。2.聚合酶链式反应（PCR）产物直接用MALDITOF MS检测受限于两个方面,一是寡核苷酸的分子量太大MALDI检测不到,二是PCR缓冲溶液中含有酶和盐,抑制寡核苷酸的电离,需要复杂的除盐纯化过程。针对第一个问题,我们采用巢式PCR扩增嵌入内切酶位点,通过限制性内切酶酶切成短的寡核苷酸片段,每种HPV型别可酶切出六种不同小分子量的DNA片段,这不但能让MALDI检测到而且对检测结果的分析判断增加了可靠性。针对第二个问题,我们采用第一章合成的纳米材料SP-NDs提取酶切的HPV六种小分子量DNA片段,我们研究发现,SP-NDs不仅可以直接从PCR酶切产物中提取寡核苷酸,还可以从聚合酶链式反应-限制性片段质量多态性（PCR-RFMP）的酶消化产物中选择性地提取HPV特异性DNA片段,提取后的基因片段用MALDI TOF MS检测可区别HPV的型别,该方法成功地应用于临床样品分析并取得了良好的结果。SP-NDs作为固相吸附剂,用于MALDI分析前提取纯化寡核苷酸,替代电泳或液相色谱的纯化方法,避免了传统的纯化步骤,简化了分析过程且提高了灵敏度。基于PCR-RFMP方法,用SP-NDs富集、提取和分离寡核苷酸后,MALDI MS还能够分析DNA甲基化、单核苷酸多态性和其他病毒分型。3.基于金纳米颗粒（AuNPs）上的HPV16 L1核酸适配体（APTHPV16 L1）和质量标签（三聚氰胺）之间的非共价竞争吸附,建立了激光解吸电离质谱（LDI MS）检测HPV16 L1蛋白的新方法。在我们的设计中,APTHPV16 L1与三聚氰胺竞争占据AuNPs表面的非共价作用位点,当APTHPV16 L1存在时,会优先占据AuNPs表面的非共价作用位点,检测不到AuNPs表面存在三聚氰胺。随着HPV16 L1蛋白的加入,HPV16 L1蛋白与APTHPV16 L1之间存在特异性更强的相互作用,导致APTHPV16 L1从AuNPs的表面脱落,暴露出的反应位点被三聚氰胺所占据,经离心洗涤后采用LDI-TOF MS直接检测三聚氰胺信号,AuNPs表面三聚氰胺的质谱信号强弱反映了HPV16 L1蛋白含量的多少。采用内标法定量,HPV16 L1蛋白在2～80 ng/mL的范围内成线性关系,相关系数0.998,检出限（LOD=3SD空白/斜率）为58.8 pg/mL,该方法成功用于检测临床和疫苗样本中HPV16 L1蛋白,具有高灵敏度、高通量的优点,有望应用于宫颈癌的早期临床诊断和预后情况的判断。4.在高盐条件下氧化石墨烯（GO）吸附核酸适配体增强了 GO胶体溶液的稳定性,当溶液中加入目标物HPV16 L1蛋白后,核酸适配体与目标物特异性结合并从GO表面脱离,暴露的GO在高盐下聚集,导致230 nm处溶液吸光度发生变化。我们发现,吸光度与HPV16 L1蛋白浓度的对数成线性关系,以此建立了紫外吸光光度法定量检测HPV16 L1蛋白的方法。本方法耗时短,灵敏度高,试剂消耗少,具有较好特异性,方法回收率在87%～102%,检出限可达2 pg/mL,仅用简单的紫外分光光度计即可检测HPV16 L1蛋白浓度,其对临床样本的检测结果与用酶联免疫吸附测定（ELISA）以及第四章所述方法的检测结果完全一致。该研究的创新点是不用荧光标记的核酸适体,从而避免了荧光的漂白。我们根据GO本身的光学性质开发的灵敏、简单、快速、低成本的分析HPV16 L1蛋白方法,具有替代常规检测HPV16 L1蛋白方法的应用前景。
郭晶晶[7]（2019）在《弓形虫病毒样颗粒疫苗的免疫原性研究》文中指出刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种专性细胞内寄生原虫,可感染全世界将近30%的人口。当免疫功能正常的人感染弓形虫后一般没有明显的症状,通常为隐性感染。但它可以由隐性感染状态转变成急性弓形虫病导致免疫功能受损的个体（如艾滋病患者）出现严重症状。另一个弓形虫的致命威胁是对胎儿的垂直传播,这可能导致自然流产、新生儿畸形等严重后果。由于没有合适的药物可以杀死包囊内的缓殖子,而磺胺嘧啶等西药也只能对急性感染后14天的虫体起作用,所以目前还没有办法控制这种疾病的传播。因此,先发制人的疫苗具有比现有的抗虫药物极为明显的优势。迄今为止,传统弓形虫疫苗的开发策略主要集中在亚单位疫苗和DNA疫苗上。但这两者都有一些问题,比如亚单位疫苗稳定性差并且可能引起不必要的免疫反应,而DNA疫苗具有整合到宿主细胞基因组中的理论风险。基于肽的疫苗可以克服这些弱点。他们使用最小的抗原表位来诱导所需的免疫反应,因此不太可能会引发过敏或自身免疫反应。因此,近年来基于肽的疫苗引起了越来越多人的关注。由于刚地弓形虫是一种生活史非常复杂的胞内寄生虫,因此合成含有多个不同表位的多抗原肽疫苗（Multiple antigenic peptide,MAP）可能是开发弓形虫疫苗一个有效的手段。理想的抵抗弓形虫的疫苗首先应该包括可以引发宿主Th1型免疫反应的抗原表位,该免疫反应的特征在于可以产生干扰素IFN-y,并对被感染的宿主细胞产生持久稳定的细胞毒性作用。小鼠CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CD8+cytotoxic T lymphocyte,CTL）介导的对脑内弓形虫包囊的抵抗作用,取决于其主要组织相容性复合体MHC Ⅰ类分子的Ld等位基因。弓形虫的分泌蛋白质如致密颗粒（Dense granules,GRAs）和棒状体蛋白（Rhoptry proteins,ROPs）是被小鼠 CD8+T淋巴细胞所识别的抗原蛋白,同时也是抗虫疫苗重要的候选抗原蛋白。来源于GRA6 的肽（HPGSVNEFDF）（HF10）,和来源于 ROP7 的肽（IPAAAGRFF）,是小鼠的保护性免疫显性Ld限制性表位。抗体在宿主对弓形虫的免疫中也起着重要作用,它们能直接阻断速殖子并损害其与宿主细胞的附着。SAG1是在速殖子的侵袭过程中最早与宿主细胞黏附的表面抗原蛋白,其免疫原性非常强,是B细胞表位最合适的抗原蛋白来源。SAG182-103是一个具有高度免疫原性的构象B细胞表位,但由于之前缺乏合适的载体来维持其原有的空间构象,因此一直以来未被视为疫苗候选分子。SAG1301-320是一个线性B细胞表位,可以保护小鼠免受弓形虫致命的攻击感染,而且能被弓形虫病患者的血清强烈识别出来。此外,CD4+T细胞也是感染弓形虫后机体免疫应答的重要组成部分。研究发现AS15是一个Ab限制性的CD4+T细胞表位,可以激发机体产生针对弓形虫特异性的免疫反应。弓形虫根据其毒力的差异可主要分为三个克隆谱系。Ⅰ型、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅱ型虫株通常与人类疾病有关,Ⅲ型虫株似乎在动物身上更为常见。上述这几个表位中的大多数在Ⅰ型和Ⅱ型虫株之间是高度保守的。弓形虫的生活史非常复杂,因此我们选择了 B细胞表位（SAG1 82-102或SAG1 301-320）,CD8+T 细胞表位（HF10 或 ROP7）和 CD4+T 细胞表位（AS15）作为弓形虫多抗原肽疫苗的候选表位肽。虽然MAP疫苗具有诸多优势,但是也并非没有缺点。例如,肽段本身的免疫原性不是很强,需要递送系统或佐剂的帮助。而且它们跟天然折叠的蛋白质相比,非常容易受到酶促降解的影响,缺乏稳定性。因此,为上述多抗原肽疫苗寻找合适高效的载体变的尤为重要。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是由病毒的结构蛋白形成的多种纳米颗粒（大小为20-100nm直径）,并且可以在体外自我组装。它们类似于病毒,但是由于缺乏病毒的遗传物质,不能在机体内复制,因而没有传染性。VLPs模拟了天然病毒的三维构象,可在其表面递呈高密度重复的外源抗原表位,从而诱导机体产生所需的体液和细胞免疫反应。近年来,VLPs已是生产传染病疫苗载体的绝佳选择,已经有多种VLPs疫苗投入市场使用。然而,目前对弓形虫的VLPs疫苗的研究还非常少,需要更多的努力来填补这一具有广阔发展前景的研究领域的空白。乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原（HBc）作为VLPs平台已被广泛应用多年。它可在许多重组基因表达系统中高度表达,包括原核表达系统,并且易于在体外自我组装。HBc颗粒的表面具有位于“刺突”顶端的主要免疫显性区域（Major immune dominant region,MIR）,作为载体这种结构不仅能保持外源B细胞构象表位正确的空间构象,而且可以通过高度重复、适当间隔的方式呈现外源的构象和线性表位,能够极大地改善其颗粒表面上递呈的外源抗原表位的免疫原性。多种来自细菌、病毒和原生动物的外源抗原已被插入到HBc颗粒中构建了 HBc-抗原融合蛋白,其中的一些已达到临床试验阶段。鉴于此,将弓形虫多抗原肽加载到HBc颗粒上构建的嵌合VLPs疫苗,有望发展成一种经济高效的抗虫疫苗。研究目的1、将构象B细胞表位,Ld限制性CD8+T细胞表位和Ab限制性CD4+T细胞表位加载到HBc病毒样颗粒上,以探索这种新型弓形虫疫苗制剂方案的可行性。2、通过急性和慢性弓形虫小鼠感染模型全方面地评估此嵌合HBc病毒样颗粒疫苗产生的抵抗弓形虫感染的免疫保护力。研究方法1、构建、纯化及鉴定嵌合HBc病毒样颗粒本研究将弓形虫CD8+T细胞表位（HF10或ROP7）和B细胞表位（SAG182-102或SAG1301-320）的基因序列插入到截断HBc颗粒HBcΔ 78和79位氨基酸的基因序列之间,两端加上谷氨酰胺（Q）和天冬氨酸Asp（D）的连接子,再将CD4+T细胞表位（AS15）加在HBcΔ的C端末尾,这些复合基因与原核表达质粒pET-30a（+）连接后,构建了嵌合HBc病毒样颗粒的重组质粒:pET-30a（+）/HBcΔ,HBcAH82,HBcAH301,HBcAR82和HBcΔR301。重组质粒经过扩增和鉴定后,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG诱导表达后,收集嵌合的HBc病毒样颗粒蛋白（HBcΔ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcΔR82和HBcΔR301）。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定目的蛋白,并分析是可溶性蛋白还是包涵体沉淀。诱导嵌合HBc病毒样颗粒大量表达后,对以可溶性状态存在的HBcΔ蛋白直接通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化,透析浓缩后收集目的蛋白;而对以包涵体沉淀状态存在的嵌合蛋白HBcΔH82,HBcAH301,HBcAR82和HBcΔR301,则先要通过含有尿素的裂解液溶解包涵体沉淀,通过镍柱纯化后,再进行梯度透析复性,从而得到正确折叠组装的嵌合HBc病毒样颗粒。嵌合HBc病毒样颗粒都含有His-Tag标签蛋白,可以与His单克隆抗体结合,并通过蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）鉴定出来。最后通过透射电镜观察分析嵌合HBc病毒样颗粒是否形成二十面体的病毒结构。2、评估嵌合HBc病毒样颗粒疫苗的免疫原性使用凝胶法鲎试剂检测嵌合蛋白中内毒素的含量。合成含有CD8+T细胞表位（HF10 或 ROP7）,B 细胞表位（SAG182-102 或 SAG1301-320）和 CD4+T 细胞表位（AS15）的四个复合抗原表位肽,即H82,H301,R82和R301。将BALB/c实验小鼠随机分成10组,每组23只小鼠,分别在小鼠皮下多点注射50μg重组蛋白（HBcΔ,H82,HBcΔH82,H301,HBcΔH301,R82,HBcΔR82,R301,HBcΔR301）或者50μl的PBS缓冲液。疫苗接种每隔两周加强一次,一共进行3次接种。在首次免疫后0,2,4和6周分别采集免疫小鼠的血清,通过ELISA检测其血清中IgG抗体水平,利用第一次免疫后6周收集的血清测定小鼠IgG1和IgG2a水平。同时每组取3只小鼠制备脾细胞悬液,通过流式细胞术检测其脾细胞中CD4+和CD8+T淋巴细胞分别占的比例,另外将脾细胞经过重组蛋白或ConA刺激后,收集细胞的培养上清液,用ELISA试剂盒检测其细胞因子IL-2和IL-4（培养24h）,IL-10（培养 72h）,IFN-γ（培养 96h）的浓度。在末次免疫后2周,将每组10只小鼠腹腔注射200个弓形虫RH株速殖子攻击感染,每日密切观察实验小鼠的状态,准确记录各组小鼠的死亡日期,并绘制相应的生存曲线。每组另外的10只小鼠以灌胃的方式口饲感染30个PRU株包囊,每天观察小鼠的状态,45日后,取出它们的脑组织制备脑匀浆,光学显微镜下观察并估算出每只小鼠脑内的包囊数。结果1、嵌合HBc病毒样颗粒构建成功通过重组质粒（pET-30a（+）/HBcΔ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcΔR82 和 HBcΔR301）的双酶切和琼脂糖凝胶电泳实验的鉴定,发现复合的嵌合HBc病毒样颗粒的基因片段已经正确地插入到原核表达质粒pET-30a（+）中,表明重组质粒构建成功。无论是可溶性蛋白HBcΔ,还是包涵体蛋白HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82和HBcΔR301,都通过Ni-NTA琼脂糖凝胶获得了较高纯度的嵌合HBc病毒样颗粒蛋白。通过Western Blot和透射电镜分析,表明携带His标签的弓形虫嵌合HBc VLPs在原核表达系统中表达成功,并且可以在体外组装成完好的病毒样颗粒,嵌合的HBc病毒样颗粒蛋白（HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82和HBcΔR301）形成了类似于原始非嵌合HBc病毒样颗粒（HBcΔ）的二十面体形态,保证了弓形虫的B细胞表位维持了其正确的空间构象,并且密集均匀地在颗粒表面呈现了虫体来源的所有抗原表位,这为接下来其诱导小鼠产生弓形虫特异性的体液和细胞免疫应答打牢物质基础。2、嵌合HBc病毒样颗粒疫苗具有很强的免疫保护性早在第二次免疫接种后,用HBcΔH82和HBcΔR82蛋白免疫的小鼠就可以检测到明显升高的IgG抗体水平（p<0.01）;在第三次接种后,这两种蛋白质更是诱导了最高的IgG抗体水平（p<0.001）。与对照组相比,只有用HBcΔH82蛋白免疫的小鼠同时具有较高的IgG1和IgG2a抗体滴度（p<0.05）。此外几乎所有的免疫组小鼠的血清中IgG1/IgG2a的比值都小于1,以上结果说明嵌合HBc病毒样颗粒疫苗在实验小鼠体内诱导了以Th1型为主的特异性免疫应答。用含有弓形虫CD4+T细胞表位（AS15）的重组蛋白（H82,HBcΔH82,H301,HBcAH301,R82,HBcΔR82,R301和HBcAR301）免疫的小鼠脾细胞中CD4+T细胞的数量较对照组都有明显的增高（P<0.05）,尤其是当其加载到HBc病毒样颗粒上之后（p<0.01）。除了接种PBS和HBcΔ的小鼠,其它重组蛋白免疫的小鼠体内CD8+T细胞的含量都有不同程度的增加,特别是对于用含有HF10表位的嵌合HBc病毒样颗粒（HBcAH82和HBcΔH301）免疫的小鼠（p<0.001）。用重组蛋白 HBcΔH82 和 HBcAH301（p<0.001）,HBcΔR82 HBcΔR301（p<0.01）以及复合抗原表位肽（H82,H301,R82和R301）（p<0.05）免疫的小鼠脾细胞培养上清液中IFN-y的水平均明显高于对照组。用HBcΔH82（p<0.001）和HBcΔH301（p<0.01）疫苗接种的小鼠具有更高的IL-2水平。而对于IL-4和IL-10,仅在用HBcΔH82蛋白免疫的小鼠中观察到了轻微升高的细胞因子浓度。用嵌合 HBc 病毒样颗粒 HBcΔH82（15.6±3.8 天）（χ2=20.13,p<0.001）,HBcΔH301（8.1±1.5 天）（χ2=14.09,p<0.01）,HBcΔR82（8.8±1.3 天）（χ2=17.83,p<0.001）和HBcΔR301（6.6±1.2天）（χ2=4.32,p<0.05）接种的小鼠的生存时间较对照组小鼠均有一定程度的延长,尤其是HBcAH82蛋白,甚至观察到最长20天的存活时间。用 HBcAH82（1454±239;p<0.01）和 HBcAH301（173 0±230;p<0.05）蛋白接种的小鼠具有比对照组小鼠（2091±263）显着减少的脑内包囊数量,包囊的减少率分别为30.5%和17.3%。结论1、嵌合 HBc 病毒样颗粒（HBcδ,HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82 和 HBcδR301）可以在大肠杆菌中成功表达出与非嵌合得HBc病毒样颗粒（HBcΔ）相似的二十面体的病毒结构,正确且密集地在病毒颗粒表面呈现弓形虫的构象B细胞表位和线性T细胞表位。2、嵌合 HBc 病毒样颗粒（HBcδ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcδR82 和 HBcΔR301）疫苗具有很强的免疫原性。特别是用HBcΔH82蛋白免疫接种的小鼠体内产生了强烈的虫体特异性的体液和细胞免疫应答,起到了抵抗急性和慢性弓形虫病的作用,是一种全新有效的抵抗弓形虫感染的疫苗制剂方案。创新性和意义创新性:本研究首次构建了含有弓形虫SAG1构象B细胞表位的疫苗,并且首次将含有构象B表位,Ld限制性CD8+T细胞表位和Ab限制性CD4+T细胞表位的多抗原肽疫苗加载到乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒上,证明了弓形虫的这种新型疫苗制剂是可以构建成功的。意义:本研究提供了一种全新有效的对抗弓形虫感染的疫苗制剂方案,可以对研发安全、有效、经济、保护力强的弓形虫疫苗提供重要参考,为弓形虫病的防治奠定理论和实验基础。
郭晶[8]（2019）在《人乳头瘤病毒52型病毒样颗粒研究》文中进行了进一步梳理人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）是一种嗜上皮性病毒,主要引起尖锐湿疣和宫颈癌。其中HPV52是引起尖锐湿疣的主要型别,HPV52预防性疫苗的研制具有广阔的前景、一定的社会和经济效益。研究表明,HPV类病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）可以通过HPV L1蛋白在体外自组装形成,保留了天然构象,且具有免疫原性,是理想的HPV预防性疫苗形式,目前所上市的HPV预防性疫苗均为这种形式。本研究利用大肠杆菌可溶性表达HPV52 L1蛋白,体外解组装,重组装成VLPs,具有良好免疫原性。首先从GenBank中获得HPV52 L1全基因序列,根据大肠杆菌偏好性进行密码子优化,合成全基因序列,构建表达载体pET-30a-HPV52 L1和pCold-HPV52 L1,双酶切鉴定成功后转入四种感受态细胞ER2566、Tuner、BL21（DE3）、BL21 StarTM（DE3）,经SDS-PAGE鉴定筛选最佳表达菌株为BL21 StarTM（DE3）,最佳表达条件,温度为16℃,20℃,25℃,IPTG浓度为0.025 mmol/L,0.05 mmol/L,0.1 mmol/L,表达时间为16 h,经SDS-PAGE鉴定结果最终确定表达条件为25℃,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为16 h。通过POROS 50HS阳离子交换层析柱纯化HPV52 L1重组蛋白,以含1.25 mol/L NaCl洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,获得了高纯度的L1重组蛋白。通过用odyssey近红外激光成像系统扫描并测得,洗脱液中获得的重组蛋白纯度高达90%以上。通过体外解组装,重组装获得均一、稳定VLPs。VLPs免疫68周龄雌性BALB/c小鼠,通过动物实验表明,该VLPs疫苗具有良好免疫原性,能诱导产生高滴度的HPV52中和抗体。本研究利用大肠杆菌可溶性表达了高纯度HPV52 L1蛋白,获得了廉价、有效的HPV52 L1 VLPs,本研究建立了实验室水平的VLPs制备,为HPV52预防性疫苗研究奠定了基础。
宁婷婷[9]（2019）在《人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1抗原定量及免疫原性研究》文中指出世界范围内,宫颈癌为女性第四位高发恶性肿瘤。高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌的主要致病因素。HPV结构基因编码主要衣壳蛋白（L1）和次要衣壳蛋白（L2）,两者共同形成病毒的二十面体衣壳。外源表达的L1蛋白可以在体外自组装成病毒样颗粒（VLPs）,其超微结构和免疫原性与天然病毒类似,目前已上市或在研的HPV预防性疫苗均以上述HPVL1 VLPs为基础。HPV预防性疫苗至少含有两个型别的L1抗原,甚至更多型别的L1抗原,所有HPV疫苗均含有HPV 16 L1抗原。本课题对多价疫苗中HPV16 L1抗原的定量及免疫原性特点进行了深入研究,并得到以下结果。1.HPV16 L1抗原ELISA定量方法的建立与应用目前已有三种HPV预防性疫苗在我国上市,国内还有9家企业15个品种的HPV预防性疫苗处于不同的研究阶段。现阶段各生产企业利用各自的HPV16型特异性单抗建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）以检测各自的HPV16 L1抗原,使抗原检测结果差异大。因此急需筛选一株具有代表性的HPV16型特异性单抗以建立统一的ELISA抗原检测方法。比较分析13株具有中和活性的HPV16单抗,HPV16.001的中和活性最强,IC50为0.6ng/mL。从中和活性最强（IC50<10ng/mL）的6株单抗中选择4个代表株进行结合特性分析,HPV16.001结合亲和力最高（EC50:2.6ng/mL）且结合最稳定,不受抗原表达系统的影响。竞争抑制实验表明HPV16.001识别HPV16 VLPs上主要的中和表位而且能够代表免疫后血清中大部分中和抗体。以中和活性高、结合特性好而且具有表位优势的HPV16.001为基础,建立了统一的ELISA抗原检测方法。通过对线性、特异性和精密度等方法学参数进行验证,表明本研究建立的双抗体夹心ELISA方法适用于HPV16 L1抗原的定量检测,可用于HPV16 L1抗原鉴别和相对效价测定。2.HPV多价联合疫苗中16型和18型L1抗原质谱定量方法的建立与应用目前HPV预防性疫苗均是以HPV VLPs为基础的多价联合疫苗,从2价联合到14价联合。传统的蛋白定量方法,例如BCA法,无法区分定量每一型别HPVL1抗原。双抗体夹心ELISA法虽然可以区分定量各型别L1抗原,但筛选出针对10余种型别中每一型别L1抗原的特异性单抗耗时耗力,且ELISA法的定量易受疫苗中佐剂的影响。因此急需建立质谱检测方法,解决HPV多价联合疫苗中各型别L1抗原同时定量的问题。本研究基于稳定同位素标记的质谱定量的分析思路,在肽段基本筛选指标基础上,增加肽段特异性和质谱特性指标,确定HPV16L1和HPV18L1蛋白的定量特征肽段分别是AGAVGENVPDDLYIK和FSLDLDQYPLGR。使用稳定同位素标记的定量特征肽段作内标,建立了 HPV多价联合疫苗中HPV16 L1和HPV18 L1蛋白的质谱检测方法。HPV单价样品和多价联合疫苗经0.1%RSF变性和胰蛋白酶酶解后,进行质谱测定,采用稳定同位素内标法定量。结果表明,HPV16 L1和HPV18L1蛋白在20-500nM范围内线性关系良好,相关系数R2分别是0.998和0.995。方法的最低检测限分别为1.0nM和0.5nM,最低定量限分别为2.8nM和1.7nM,日内回收率分别为83.96%～113.57%和81.40%～100.43%,日间回收率分别为86.00%～100.20%和87.10%～103.49%,日内精密度分别为1.12%～4.65%和0.79%～5.91%,日间精密度分别为5.09%～10.59%和4.17%～11.05%。该质谱法测定的Gardasi1中HPV16 L1和HPV18 L1蛋白的含量分别是46.9±0.8g和17.2±0.28g,Gardasil9中分别是51.2±2.0μg和33.2±0.6μg,均与标示量相近。本研究建立的质谱定量方法简单、快速、准确、灵敏,可同时定量HPV多价联合疫苗中的HPV16L1和HPV18L1蛋白。3.HPV16 L1抗原的免疫保护活性涵盖L1突变株的研究随着HPV16病毒的进化,HPV16型内变异株越来越多。对截止至2016年底的所有1204个HPV16型内变异株L1蛋白的序列进行分析,发现505个氨基酸中,270个位点发生变异,变异率为0.08%～20.18%。为分析HPV16预防性疫苗株对这些自然点突变株的保护效果,利用定点突变技术构建39个点突变株,包括自然状态下的高频突变位点和表位相关突变位点。利用真核蛋白表达系统,成功包装31株高滴度HPV16突变假病毒。利用假病毒为基础的中和实验（PBNA）分析31株突变假病毒对单抗和免疫血清的中和敏感性变化。结果表明,21株突变假病毒对某些单抗的中和敏感性发生变化,其中20株突变假病毒对某些单抗的中和敏感性下降,8株突变假病毒对某些单抗的中和敏感性上升,6株突变假病毒对某些单抗彻底失去了反应性。免疫血清虽然可中和上述31株单点突变假病毒,但C428W和K430Q两株突变假病毒对免疫血清的中和敏感性分别下降9倍和11倍。本部分结果表明,截至目前,HPV16预防性疫苗株尚能够诱导高效广谱的保护性免疫,但HPV16L1的抗原性正在发生变化,需要密切监测。
张鹏飞[10]（2019）在《基于生物表面展示策略的功能化纳米载体的构建和应用》文中进行了进一步梳理在过去几十年,各种配体修饰的纳米载体已经被开发出来。众所周知,纳米材料的表面修饰可以极大地拓展纳米材料的功能和生物相容性,纳米载体的功能化一般需要将功能配体修饰在纳米颗粒的表面,从而赋予材料独特的靶向性、长循环稳定性、酶催化能力、生物治疗、免疫逃逸和生物传感等功能。用于纳米载体表面功能化的配体分子通常包括酶、多肽、适配体、多糖、抗体以及其他生物活性小分子等。其中,抗体等蛋白配体因其高亲和力和独特的生物活性,作为一类较为重要的配体,被研究人员偶联在不同类型的纳米粒子上,以实现功能化纳米粒子的肿瘤靶向运输及诊断。传统的配体修饰方法包括物理吸附和化学共价偶联等方法。然而,蛋白配体在与纳米粒子之间发生化学共价偶联反应的过程中可能会引发敏感性蛋白配体（如抗体、酶）的生物活性的损失并且难以控制配体的空间朝向,因此容易造成纳米材料功能化的效率低下等问题。理想的、针对蛋白配体的纳米偶联方法应该能够保证被连接配体的最优空间朝向、可接近性、体内循环稳定性以及良好的生物活性。开发出针对于蛋白配体的、纳米偶联的新方法,并且保证被偶联蛋白的正确朝向和生物活性,对于促进纳米医药以及纳米功能化的发展有着重大的意义。在另一方面,生物表面展示技术也在不断蓬勃发展。该技术主要是通过运用基因工程的手段在类病毒颗粒、病毒、酵母、细菌、噬菌体、铁蛋白或蛋白笼等生物载体的表面上展示各种多肽、重组蛋白、多糖等生物活性元件。目前,生物表面展示策略已经广泛地应用于微生物学、疫苗学、分子生物技术等领域,并产生了巨大的临床应用价值。此外,仿生策略被广泛地应用于纳米材料的开发,以赋予纳米材料更优越的独特功能,如生物相容性、免疫逃逸、细胞特异性的靶向能力、长循环稳定性或细胞独有的其他生物学功能。这一策略也通常涉及到生物来源的活性蛋白（病毒表面蛋白或多肽）或细胞组分（如细胞膜或细胞器）对纳米载体表面的修饰及功能化。综上所述,为了克服非特异性共价偶联方法的缺点并且开发出理想的、针对于蛋白配体的、纳米表面功能化的方法,在本研究中,本人通过结合生物表面展示技术以及细胞仿生策略,开发出了一种纳米载体功能化的新方法,并且制备了三种功能化的纳米载体（如:展示蛋白的病毒拟态纳米囊泡、外泌体拟态纳米囊泡与细胞膜包裹的纳米粒子）,这些载体在关于疫苗抗原投递、肿瘤靶向的药物运输和肿瘤免疫治疗的三个实验评估中都取得了良好的疾病治疗效果,充分证明了该新型生物功能化的纳米系统的优越性能以及该纳米偶联方法的普适性。本研究的主要工作以及创新包含以下四个方面:1、开发出了一种新型的基于纳米囊泡载体的蛋白展示技术（即纳米囊泡表面展示技术）,该技术可以在源自细胞膜的、纳米囊泡的表面,定向表达各种靶向抗体、病毒抗原蛋白、酶复合体等生物活性蛋白,从而赋予纳米囊泡与外泌体相似的功能。2、基于纳米囊泡表面展示技术以及病毒仿生策略,流感病毒包膜蛋白（血凝素蛋白HA）首先被基因工程改造后定向表达在哺乳动物细胞膜的表面,通过加入表面活化剂,诱导细胞膜出芽,从而分泌出了可以展示流感病毒HA膜蛋白的纳米囊泡。本实验证明了该流感病毒拟态纳米囊泡具有与天然流感病毒相似的大小、形貌、免疫原性和凝血活性,并且可以在小鼠体内诱导出高滴度的中和抗体,以抵御致死性流感病毒的感染,进而证明了这一病毒拟态纳米囊泡可以作为一种直接、有效和通用的疫苗研发平台,有利于开发出针对各种包膜病毒的疫苗。3、基于纳米囊泡表面展示技术,我们将肿瘤靶向的表皮生长因子或纳米抗体affibody分别定向表达在囊泡的表面,并在囊泡的内部装载治疗性的药物分子,因此赋予了纳米囊泡特异性识别肿瘤的功能,使得药物分子高浓度地聚集在肿瘤部位,从而达到了良好的肿瘤治疗效果。4、通过将囊泡表面展示技术和膜包裹纳米颗粒的方法有机地结合,PD-L1抗体先被定向表达在细胞膜囊泡的外表面,在细胞膜囊泡与氧化锰纳米颗粒经过微孔滤膜的共挤压后,本人成功制备出了一种可以展示PD-L1抗体的、细胞膜包裹的氧化锰纳米颗粒,该氧化锰纳米颗粒能够被细胞膜以及其上的PD-L1抗体有效的修饰及功能化,同时该系统可以将负载的免疫刺激分子靶向递送到肿瘤微环境,实现对肿瘤的放疗与免疫联合治疗。此外,我们发现该新型膜包裹纳米系统能够有效地在小鼠肿瘤模型中诱导全身的抗肿瘤免疫反应（远端效应）,成功地抑制了未辐照肿瘤的生长。
二、Carboxyl Terminus Truncated Human Papillomavirus Type 58 L1 Protein Maintains Its Bioactivity and Ability to Form Virus-like Particles（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Carboxyl Terminus Truncated Human Papillomavirus Type 58 L1 Protein Maintains Its Bioactivity and Ability to Form Virus-like Particles（论文提纲范文）
（1）重组HPV16 L1壳蛋白的原核表达与分离纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 HPV概述 |
| 1.1.1 HPV病毒的基因结构及功能 |
| 1.1.2 HPV分型 |
| 1.1.3 HPV的感染及致病机理 |
| 1.1.4 预防性HPV疫苗的研究现状 |
| 1.2 重组HPV L1表达系统 |
| 1.2.1 真核表达系统 |
| 1.2.2 原核表达系统 |
| 1.3 蛋白纯化方法 |
| 1.3.1 沉淀法 |
| 1.3.2 层析法 |
| 1.3.3 密度梯度离心法 |
| 1.4 本研究思路及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、载体、菌株、细胞株 |
| 2.1.2 层析柱料 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 主要溶液及配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组表达载体构建及鉴定 |
| 2.3.2 HPV16 L1可溶性表达及鉴定 |
| 2.3.3 发酵培养工程菌 |
| 2.3.4 高压均质菌体 |
| 2.3.5 蛋白的层析纯化 |
| 2.3.6 VLPs的组装及形态学检测 |
| 2.3.7 蛋白质量检测 |
| 2.3.8 动物免疫 |
| 2.3.9 假病毒的制备及中和实验 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 重组质粒pET30a-16L1构建、鉴定 |
| 3.2 重组质粒pET30a-16L1的表达 |
| 3.2.1 诱导温度对蛋白表达的影响 |
| 3.2.2 诱导剂浓度对蛋白表达的影响 |
| 3.3 重组质粒pET30a-16L1的高密度发酵表达 |
| 3.4 高压均质条件优化 |
| 3.5 HPV16 L1蛋白纯化 |
| 3.5.1 阳离子层析柱料的筛选 |
| 3.5.2 阳离子层析工艺参数的优化 |
| 3.5.3 疏水层析柱料的筛选 |
| 3.6 质量检测 |
| 3.7 HPV16 VLPs的形态学表征 |
| 3.7.1 动态光散射 |
| 3.7.2 透射电镜 |
| 3.8 免疫原性检测 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（2）戊型肝炎病毒ORF2的结构分析及戊型肝炎-口蹄疫联合疫苗的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表 |
| 绪论 |
| 第1章 戊型肝炎病毒与口蹄疫病毒的研究现状(综述) |
| 1.戊型肝炎病毒研究现状 |
| 1.1 HEV基因型 |
| 1.2 HEV流行病学 |
| 1.3 HEV宿主 |
| 1.4 HEV的体外培养 |
| 1.5 HEV的结构蛋白与病毒样颗粒 |
| 1.6 HEV疫苗与联合疫苗的发展 |
| 2.口蹄疫病毒的研究现状 |
| 2.1 口蹄疫病毒的血清型及流行性 |
| 2.2 口蹄疫病毒的结构 |
| 2.3 口蹄疫疫苗 |
| 3.展望 |
| 第2章 HEV ORF2 不同截短蛋白的质粒构建与原核表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要材料﹑试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 p188、p189、p196、p199和p209的目的基因扩增 |
| 2.3.2 p188、p189、p196、p199和p209重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3.3 p188、p189、p196、p199和p209重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 |
| 2.3.4 p188、p189、p196、p199和p209重组蛋白的纯化 |
| 2.3.5 HEV ORF2不同截短蛋白的非还原SDS-PAGE电泳及Western blot |
| 2.3.6 HEV ORF2不同截短蛋白的VLPs形成的透射电镜分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 HEV ORF2截短蛋白组装VLPs的结构分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要材料﹑试剂和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626的目的基因扩增 |
| 3.3.2 pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.3 pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 |
| 3.3.4 pC618、pC619、pC620、pC621、pC622、pC623、pC624、pC625和pC626重组蛋白的纯化 |
| 3.3.5 突变蛋白p189A、p199A和 p222A的蛋白表达与纯化 |
| 3.3.6 ORF2截短蛋白结构的体外分析 |
| 3.3.7 DTT对天然HEV病毒衣壳蛋白的结构影响 |
| 3.3.8 ORF2截短蛋白同源二聚体结构及C末端Cys残基预测分析 |
| 3.3.9 HEV ORF2蛋白C末端Cys残基的保守性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 戊型肝炎-口蹄疫联合疫苗的免疫原性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要材料﹑试剂和仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 HEV ORF2不同截短蛋白的稳定性分析 |
| 4.3.2 HEV中和抗原表位突出情况 |
| 4.3.3 HEV p179和p222抗原反应性 |
| 4.3.4 HEV p179和p222疫苗的免疫原性 |
| 4.3.5 免疫佐剂的选择结果 |
| 4.3.6 FMDV中VP1中和抗原表位G–H loop表达与纯化 |
| 4.3.7 HEV和 FMDV单独疫苗组中HEV抗体IgG和FMDV抗体IgG检测 |
| 4.3.8 HEV-FMDV联合疫苗组中HEV抗体IgG和FMDV抗体IgG检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）猪圆环病毒的入核机制研究（论文提纲范文）
| 本研究获得以下项目资助 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文创新点 |
| 研究意义 |
| 技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒的研究进展 |
| 1 猪圆环病毒的发现与分类学地位 |
| 2 猪圆环病毒的流行 |
| 3 猪圆环病毒的基因组结构 |
| 4 猪圆环病毒基因组的编码蛋白及其功能 |
| 4.1 Rep蛋白和Rep'蛋白 |
| 4.2 Cap蛋白 |
| 4.3 ORF3蛋白 |
| 4.4 ORF4蛋白 |
| 5 猪圆环病毒的起源 |
| 6 猪圆环病毒的跨种传播 |
| 7 猪圆环病毒的培养增殖和感染性克隆研究进展 |
| 第二章 HDAC6蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 HDAC6:它与其他HDACs有什么不同? |
| 2 HDAC6蛋白的结构特征 |
| 3 HDAC6蛋白的功能特异性 |
| 3.1 去乙酰化酶依赖性功能 |
| 3.2 泛素依赖性功能 |
| 4 HDAC6蛋白抑制病毒的感染(抗病毒) |
| 4.1 调节微管稳定性以抑制病毒感染 |
| 4.2 融合和入侵 |
| 4.3 核靶向运输 |
| 4.4 复制 |
| 4.5 组装和释放 |
| 4.6 调控抗病毒免疫应答 |
| 5 HDAC6蛋白促进病毒的感染(促病毒) |
| 5.1 HDAC6介导的聚集体途径有利于病毒的脱衣壳 |
| 5.2 促进病毒的致病过程 |
| 6 展望 |
| 第三章 病毒入核机制的研究进展 |
| 1 细胞的核转运过程概述 |
| 2 病毒入核与核膜 |
| 3 病毒破坏核膜或核纤层入核 |
| 4 囊膜病毒的入核 |
| 5 无囊膜病毒的入核 |
| 第四章 NPM1蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 核仁磷蛋白NPM1的结构特征和主要功能 |
| 2 在病毒感染过程中NPM1蛋白与不同病毒蛋白的相互作用 |
| 2.1 腺病毒(AdV) |
| 2.2 人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) |
| 2.3 单纯疱疹病毒1型(HSV-1) |
| 2.4 丙型肝炎病毒(HCV) |
| 2.5 乙型肝炎病毒(HBV) |
| 2.6 丁型肝炎病毒(HDV) |
| 2.7 其他病毒 |
| 3 NPM1蛋白抑制剂作为抗病毒治疗药物 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 HDAC6酶活性测定 |
| 2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.13 原核表达 |
| 2.14 GST pull-down |
| 2.15 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.16 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.17 病毒滴度测定 |
| 2.18 细胞活力检测实验 |
| 2.19 HDAC6蛋白过表达细胞系的构建 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 Cap蛋白能促进PK-15细胞中α-tubulin的乙酰化修饰水平 |
| 3.2 微管蛋白乙酰化水平调节对PCV2感染增殖的影响 |
| 3.3 PCV2感染的PK-15细胞或质粒转染的293T细胞中Cap蛋白和HDAC6的亚细胞定位分析 |
| 3.4 PCV2 Cap蛋白与HDAC6的互作关系分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白的42-100位氨基酸介导与HDAC6蛋白的相互作用 |
| 3.6 HDAC6蛋白的HD1、HD2和ZnF结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性 |
| 3.8 HDAC6蛋白抑制PCV2病毒的复制 |
| 4 讨论 |
| 第二章 PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 抗体和试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染 |
| 2.8 病毒接种 |
| 2.9 蛋白样品制备 |
| 2.10 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.11 原核表达 |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 银染 |
| 2.15 蛋白质相互作用网络的构建与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫共沉淀串联质谱方法鉴定PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白 |
| 3.2 蛋白质相互作用网络图谱的绘制与分析 |
| 3.3 GO注释与分析 |
| 3.4 KEGG通路富集分析 |
| 3.5 验证PCV2 Cap蛋白与宿主蛋白的相互作用 |
| 4 讨论 |
| 第三章 核仁磷蛋白NPM1调控PCV2病毒入核的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.15 病毒滴度测定 |
| 2.16 细胞活力检测实验 |
| 2.17 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.18 wt-和mA-PCV2突变体病毒拯救 |
| 2.19 胞浆/胞核组分抽提 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2感染PK-15细胞中NPM1蛋白水平的变化 |
| 3.2 NPM1的RNAi细胞系的建立 |
| 3.3 NPM1蛋白促进PCV2病毒的复制 |
| 3.4 PCV2感染或质粒转染的PK-15细胞中病毒蛋白Cap、Rep、ORF3、ORF4和NPM1蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白与NPM1的互作关系分析 |
| 3.6 PCV2 Cap蛋白的核定位信号(NLS)介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白NLS-A的精氨酸富集区(ARM)是与NPM1蛋白互作的关键氨基酸位点 |
| 3.8 PCV2 Cap蛋白的ARM是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1-OligoD结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.10 NPM1蛋白的Ser48介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.11 NPM1蛋白Ser48的保守性和PCV2 Cap蛋白NLS-A与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.12 NPM1蛋白敲降细胞系中回补mNPM1不同突变体对PCV2复制的影响 |
| 3.13 NPM1蛋白促进PCV2病毒的入核 |
| 3.14 在PCV2感染晚期,NPM1蛋白从核仁易位至胞质 |
| 3.15 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的拯救 |
| 3.16 PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM对于PCV2的复制具有重要作用 |
| 3.17 wt-PCV2和mA-PCV2的Cap蛋白与NPM1在病毒感染细胞中的互作关系分析 |
| 3.18 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的入核能力分析 |
| 3.19 NPM1蛋白与PCV2病毒衣壳蛋白结合促进PCV2病毒入核的分子模型 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.8 蛋白样品制备 |
| 2.9 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.10 GST pull-down |
| 2.11 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.12 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.13 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NPM1蛋白对于PCV3 Cap蛋白的核仁定位是必需的 |
| 3.2 PCV3 Cap蛋白与NPM1蛋白在转染细胞中的共定位分析 |
| 3.3 PCV3 Cap蛋白与NPM1在质粒转染细胞中的互作关系分析 |
| 3.4 质粒共转外源性表达蛋白的互作关系分析 |
| 3.5 体外表达纯化蛋白的互作关系分析 |
| 3.6 PCV3 Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 不同种属的圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的互作 |
| 3.8 PCV3 Cap蛋白的NLS同时也是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1蛋白与PCV3 Cap蛋白互作关键氨基酸位点的鉴定 |
| 3.10 PCV3 Cap蛋白NLS(1-34aa)与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.11 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定NPM1/PCV3 Cap的相互作用 |
| 3.12 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质影响NPM1蛋白的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 本文所用引物列表 |
| 附录B 不同种属的圆环病毒Cap蛋白的NLS序列 |
| 附录C 全文缩略词 |
| 附录D 常用缓冲液及培养基配方 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（4）HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章:前言 |
| 1.1 人乳头瘤病毒简介 |
| 1.1.1 人乳头瘤病毒的结构 |
| 1.1.2 人乳头瘤病毒的分类与型别 |
| 1.1.3 人乳头瘤病毒流行病学 |
| 1.1.4 人乳头瘤病毒预防性疫苗研究进展及接种情况 |
| 1.2 分子伴侣 |
| 1.3 佐剂 |
| 1.4 人乳头瘤病毒血清学检测方法研究 |
| 1.4.1 酶联免疫吸附试验 |
| 1.4.2 竞争性Luminex免疫试验 |
| 1.4.3 基于HPV假病毒的体外中和试验 |
| 1.5 本课题的研究意义及实验设计 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 实验思路与设计 |
| 第二章:HPV6 L1 蛋白可溶性表达条件优化及佐剂筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建原核表达质粒p ET30a(+)-6L1 |
| 2.2.2 HPV6 L1 蛋白可溶性表达条件的优化、纯化及结构表征 |
| 2.2.3 HPV6 L1 蛋白与不同铝佐剂吸附率的测定 |
| 2.2.4 免疫方案 |
| 2.2.5 免疫原性评价 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 原核表达质粒p ET30a(+)-6L1 的构建、鉴定 |
| 2.3.2 HPV6 L1 蛋白可溶性表达条件的优化 |
| 2.3.3 HPV6 L1 蛋白结构表征 |
| 2.3.4 HPV6 L1 蛋白与不同铝佐剂吸附率的测定 |
| 2.3.5 免疫原性评价 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章:三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法的初步建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 相关引物设计 |
| 3.1.2 质粒、菌株、细胞、蛋白 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要溶液的配制 |
| 3.1.6 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 免疫血清制备 |
| 3.2.2 报告质粒的构建、鉴定及扩增 |
| 3.2.3 假病毒的制备、滴度测定 |
| 3.2.4 中和抗体检测方法的初步建立 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 报告质粒的构建、鉴定 |
| 3.3.2 假病毒的滴度测定 |
| 3.3.3 靶细胞的选择 |
| 3.3.4 单色荧光、三色混合荧光假病毒接种量的选择及重复性测定 |
| 3.3.5 三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法的评价 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）E3泛素连接酶TRAIP调控先天性免疫的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 蛋白翻译后修饰(PTMs) |
| 1.1.1 PTMs的类型和功能 |
| 1.1.2 泛素化修饰(UB) |
| 1.1.3 E3 泛素连接酶(E3s) |
| 1.1.4 小泛素样修饰(SUMO) |
| 1.1.5 SUMO化过程与功能 |
| 1.2 病毒与泛素化和SUMO化系统 |
| 1.2.1 泛素—蛋白酶体系统(UPS) |
| 1.2.2 病毒与泛素蛋白酶体系统相互作用 |
| 1.2.3 病毒与宿主SUMO化系统相互作用 |
| 1.3 先天性免疫系统 |
| 1.3.1 Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 1.3.2 泛素化修饰在Ⅰ型干扰素中的作用 |
| 1.3.3 SUMO化修饰在干扰素信号通路中的作用 |
| 1.4 PRRSV概述 |
| 1.4.1 PRRSV分子学特征 |
| 1.4.2 PRRSV对蛋白翻译后修饰系统的调控 |
| 1.4.3 PRRSV在Ⅰ型 IFN信号通路中的研究进展 |
| 1.5 E3 泛素连接酶TRAIP |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第2章 猪TRAIP基因克隆表达与多克隆抗体制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验细胞、动物、载体、菌株、抗体与毒株 |
| 2.2.2 细胞分离与培养相关试剂 |
| 2.2.3 总RNA提取、反转录与分子克隆相关试剂 |
| 2.2.4 蛋白表达、纯化以及Western-blot相关试剂 |
| 2.2.5 ELISA检测相关试剂 |
| 2.2.6 荧光定量PCR相关试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏与传代 |
| 2.3.2 细胞接毒 |
| 2.3.3 转录组测序和分析 |
| 2.3.4 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.3.5 猪外周血细胞(PBMC)的分离 |
| 2.3.6 总RNA提取及cDNA合成 |
| 2.3.7 猪TRAIP基因克隆 |
| 2.3.8 猪TRAIP蛋白原核表达载体构建及抗体制备 |
| 2.3.9 真核表达载体构建 |
| 2.3.10 Western-blot |
| 2.3.11 流式细胞术分析 |
| 2.3.12 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PRRSV感染3D4/21 细胞中TRAIP基因mRNA表达水平 |
| 2.4.2 猪TRAIP基因的克隆与序列分析 |
| 2.4.3 猪TRAIP基因表达载体的构建 |
| 2.4.4 猪TRAIP蛋白纯化及抗体制备 |
| 2.4.5 PRRSV感染对猪TRAIP蛋白表达水平的检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 猪TRAIP基因克隆与载体构建 |
| 2.5.2 TRAIP多克隆抗体的特异性评价 |
| 2.5.3 PRRSV调控TRAIP基因的表达 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 TRAIP对 PRRSV增殖的调节及其互作病毒蛋白的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞、抗体、病毒 |
| 3.2.2 细胞转染相关试剂 |
| 3.2.3 干扰RNA(siTRAIP) |
| 3.2.4 免疫荧光 |
| 3.2.5 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)相关试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞转染 |
| 3.3.2 siTRAIP干扰实验 |
| 3.3.3 TCID_(50)测定病毒滴度 |
| 3.3.4 免疫荧光 |
| 3.3.5 真核表达载体构建 |
| 3.3.6 Co-IP检测 |
| 3.3.7 截短体构建 |
| 3.3.8 共聚焦免疫荧光 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 过表达TRAIP对 PRRSV病毒的影响 |
| 3.4.2 siTRAIP抑制PRRSV增殖 |
| 3.4.3 TRAIP抑制PRRSV诱导的I型干扰素信号通路 |
| 3.4.4 TRAIP与 nsp1α相互作用 |
| 3.4.5 TRAIP的 LZ结构域与nsp1α的 PCPα结构域相互作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 TRAIP对 PRRSV增殖的影响 |
| 3.5.2 TRAIP负调控先天性免疫IFN途径 |
| 3.5.3 TRAIP与 nsp1α相互作用 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 TRAIP在 PRRSV诱导IFN-β产生中的作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 抗体、质粒 |
| 4.2.2 核质分离试剂盒 |
| 4.2.3 荧光素酶报告系统试剂 |
| 4.2.4 SUMO化和泛素化评价相关试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 SUMO或泛素化评价 |
| 4.3.2 突变体构建 |
| 4.3.3 细胞核和细胞质提取物的制备 |
| 4.3.4 荧光素酶活性报告基因系统 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Nsp1α抑制TRAIP的 SUMO化修饰 |
| 4.4.2 nsp1α对 TRAIP SUMO化调控不依赖于两者结合位点 |
| 4.4.3 PRRSV nsp1α抑制TRAIP K48 多聚泛素化 |
| 4.4.4 Nsp1α促进TRAIP的核输出 |
| 4.4.5 Nsp1α募集TRAIP促进靶向TBK1的K48 多聚泛素化 |
| 4.4.6 Nsp1α促进TRAIP介导先天免疫的抑制作用 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 PRRSV nsp1α调控TRAIP翻译后修饰 |
| 4.5.2 翻译后修饰调节TRAIP的核质分布 |
| 4.5.3 nsp1α协同TRAIP进一步抑制I型 IFN的产生 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 TRAIP-DDX39A在Ⅰ型干扰素应答中的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞与病毒 |
| 5.2.2 试剂与抗体 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 载体构建和转染 |
| 5.3.2 病毒滴度测定 |
| 5.3.3 siRNA |
| 5.3.4 ELISA和 qRT-PCR |
| 5.3.5 RNA免疫沉淀(RIP) |
| 5.3.6 制备细胞核和细胞质蛋白提取物 |
| 5.3.7 细胞核和细胞质RNA的分离和RT-PCR |
| 5.3.8 共聚焦免疫荧光 |
| 5.3.9 萤光素酶测定 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 质谱鉴定TRAIP互作蛋白 |
| 5.4.2 鉴定TRAIP为 DDX39A的 E3 泛素连接酶 |
| 5.4.3 DDX39A与先天性免疫相关的mRNA结合 |
| 5.4.4 DDX39A负调控I型干扰素产生 |
| 5.4.5 DDX39A促进RNA病毒增殖 |
| 5.4.6 DDX39A增加抗病毒转录物的核滞留并降低蛋白质表达 |
| 5.4.7 病毒感染增强DDX39A蛋白的泛素化修饰 |
| 5.4.8 DDX39A蛋白的泛素化修饰调控其与mRNA结合的能力 |
| 5.4.9 TRAIP促进DDX39A结合抗病毒转录物的能力 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 DDX39A是干扰素拮抗剂 |
| 5.5.2 TRAIP促进DDX39A与抗病毒转录物结合 |
| 5.6 小结 |
| 结论与展望 |
| 本文创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人乳头瘤状病毒(HPV)概述 |
| 1.1.1 人乳头瘤状病毒（HPV)结构 |
| 1.1.2 人乳头瘤状病毒（HPV)基因组与功能 |
| 1.1.3 HPV病毒分型 |
| 1.1.4 HPV与肿瘤的关系 |
| 1.1.5 HPV的致病机理 |
| 1.1.6 HPV病毒载量与宫颈癌的关系 |
| 1.1.7 HPV分型检测的意义 |
| 1.1.8 HPV L1蛋白检测的意义 |
| 1.1.9 HPV分型联合HPV L1蛋白检测的意义 |
| 1.1.10 HPV检测方法 |
| 1.1.10.1 细胞学检查 |
| 1.1.10.2 杂交捕获二代分析（HC2) |
| 1.1.10.3 基于聚合酶链式反应(PCR)的检测方法 |
| 1.1.10.4 基因芯片技术 |
| 1.2 基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI TOF MS) |
| 1.2.1 MALDI TOF MS基本原理 |
| 1.2.2 MALDI电离机理 |
| 1.2.3 MALDI TOF MS的应用 |
| 1.2.3.1 多肽与蛋白质分析 |
| 1.2.3.2 多磷酸化肽分析检测 |
| 1.2.3.3 寡核苷酸分析检测 |
| 1.2.3.4 MALDI定量分析 |
| 1.2.3.5 MALDI TOF MS对HPV检测 |
| 1.3 本论文研究的目的、意义和主要内容 |
| 1.3.1 本论文研究目的和意义 |
| 1.3.2 本论文研究内容 |
| 第二章 高效富集寡核苷酸纳米材料的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 精胺修饰纳米金刚石的制备 |
| 2.2.3 红外光谱和红外成像的表征 |
| 2.2.4 SP-NDs对寡核苷酸的吸附效果 |
| 2.2.5 SP-NDs富集稀溶液及复杂基质中的寡核苷酸 |
| 2.2.6 MADLI TOF MS分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 SP-NDs的表征 |
| 2.3.2 SP-NDs对寡核苷酸的吸附 |
| 2.3.3 MALDI TOF MS分析稀溶液寡核苷酸 |
| 2.3.4 MALDI TOF MS分析复杂基体中的寡核苷酸 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于纳米材料高效富集质谱法对HPV病毒分型研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 HPV通用引物PCR扩增 |
| 3.2.3 巢式PCR-RFLP方法 |
| 3.2.4 临床样品DNA提取 |
| 3.2.5 MALDI TOF MS检测酶切产物 |
| 3.2.6 试剂盒检测临床样本 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 HPV限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFMP) |
| 3.3.2 MALDI TOF MS对HPV分型检测 |
| 3.3.3 临床样品验证结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于纳米金非共价键竞争吸附质谱法定量检测HPV16 L1蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 纳米金的合成 |
| 4.2.3 纳米金表征 |
| 4.2.4 纳米金聚集盐的浓度 |
| 4.2.5 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合 |
| 4.2.5.1 溶液配制 |
| 4.2.5.2 pH值的影响 |
| 4.2.5.3 盐的影响 |
| 4.2.5.4 吸附时间 |
| 4.2.5.5 AuNPs与核酸适配体比例 |
| 4.2.5.6 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物稳定性 |
| 4.2.5.7 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征 |
| 4.2.7 Mass Tag的筛选 |
| 4.2.7.1 确定Mass tag与AuNPs的亲和力 |
| 4.2.7.2 Mass Tag和HPV16 L1核酸适配体竞争吸附 |
| 4.2.8 HPV16 L1蛋白的检测 |
| 4.2.9 HPV16 L1蛋白的检测特异性 |
| 4.2.10 样本检测 |
| 4.2.10.1 标准曲线的建立 |
| 4.2.10.2 样本前处理和检测 |
| 4.2.11 方法学验证 |
| 4.2.11.1 方法重现性 |
| 4.2.11.2 方法回收率 |
| 4.2.12 酶联免疫(ELISA)试剂盒检测样本 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 纳米金的表征 |
| 4.3.2 纳米金聚集盐的浓度 |
| 4.3.3 AuNPs吸附Aptamer条件 |
| 4.3.3.1 pH的影响 |
| 4.3.3.2 盐的影响 |
| 4.3.3.3 吸附时间的影响 |
| 4.3.3.4 AuNPs与核酸适配体比例 |
| 4.3.3.5 AuNPs-APT_(HPV16 L1)稳定性研究 |
| 4.3.4 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征 |
| 4.3.5 质量标签(Tag)的筛选 |
| 4.3.6 MALDI TOF MS条件 |
| 4.3.6.1 检测模式 |
| 4.3.6.2 基质的选择 |
| 4.3.7 HPV16 L1蛋白的检测 |
| 4.3.8 方法分析表现 |
| 4.3.9 实际样品的定量分析 |
| 4.3.10 ELISA实验验证 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 基于氧化石墨烯和核酸适配体竞争吸附检测HPV 16 L1蛋白 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 离心时间 |
| 5.2.3 氯化钠浓度 |
| 5.2.4 HPV16 L1核酸适配体浓度 |
| 5.2.5 HPV16 L1蛋白检测 |
| 5.2.6 临床样本检测 |
| 5.2.7 特异性实验 |
| 5.2.8 基于核酸适配体与GO检测体系Zeta电势和颗粒尺寸分布研究 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 离心时间的影响 |
| 5.3.2 氯化钠浓度的影响 |
| 5.3.3 HPV16 L1核酸适配体的浓度 |
| 5.3.4 HPV 16 L1蛋白检测 |
| 5.3.5 实际临床样本检测 |
| 5.3.6 回收率 |
| 5.3.7 特异性实验 |
| 5.3.8 GO/HPV 16 L1核酸适配体检测体系颗粒尺寸的分布研究 |
| 5.3.9 HPV 16 L1核酸适配体和GO检测体系Zeta电势分布 |
| 5.3.10 与第四章所建立的方法比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（7）弓形虫病毒样颗粒疫苗的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 弓形虫疫苗的研究现状 |
| 1.1.1 研究弓形虫疫苗的必要性 |
| 1.1.2 弓形虫疫苗的研究现状 |
| 1.2 多抗原肽疫苗 |
| 1.2.1 疫苗的原理 |
| 1.2.2 基于肽的疫苗 |
| 1.2.3 多抗原肽疫苗的表位设计 |
| 1.3 挑选弓形虫抗原表位 |
| 1.3.1 弓形虫的生活史 |
| 1.3.2 弓形虫的形态特点 |
| 1.3.3 弓形虫的致病机制 |
| 1.3.4 弓形虫的基因型 |
| 1.3.5 宿主对弓形虫的免疫应答 |
| 1.3.6 本研究确定的弓形虫表位 |
| 1.4 HBc病毒样颗粒 |
| 1.4.1 病毒样颗粒 |
| 1.4.2 HBc病毒样颗粒 |
| 1.5 选题意义及研究内容 |
| 第二章 嵌合HBc病毒样颗粒的构建、纯化与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料与仪器 |
| 2.2.2 嵌合HBc病毒样颗粒表达质粒的构建 |
| 2.2.3 嵌合HBc病毒样颗粒的表达 |
| 2.2.4 嵌合HBc病毒样颗粒的纯化 |
| 2.2.5 嵌合HBc病毒样颗粒的Western Blot鉴定 |
| 2.2.6 嵌合HBc病毒样颗粒的透射电镜分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 嵌合HBc病毒样颗粒表达质粒的构建 |
| 2.3.2 嵌合HBc病毒样颗粒的表达 |
| 2.3.3 嵌合HBc病毒样颗粒的纯化 |
| 2.3.4 嵌合HBc病毒样颗粒的Western Blot鉴定 |
| 2.3.5 嵌合HBc病毒样颗粒的透射电镜分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 嵌合HBc病毒样颗粒的免疫保护性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 嵌合HBc病毒样颗粒蛋白接种小鼠 |
| 3.2.3 免疫小鼠的血清抗体分析 |
| 3.2.4 免疫小鼠的淋巴细胞分型分析 |
| 3.2.5 免疫小鼠的细胞因子水平分析 |
| 3.2.6 弓形虫强弱毒株攻击感染实验 |
| 3.2.7 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平 |
| 3.3.2 免疫小鼠的CD4~+CD8~+T淋巴细胞分型情况 |
| 3.3.3 免疫小鼠的细胞因子水平 |
| 3.3.4 弓形虫强弱毒株攻击感染后小鼠的生存率和脑包囊数 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及所获奖励 |
| 英文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）人乳头瘤病毒52型病毒样颗粒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 HPV概述 |
| 1.1.1 HPV简介 |
| 1.1.2 HPV分类与型别 |
| 1.1.3 HPV感染机制 |
| 1.1.4 HPV相关疾病 |
| 1.2 VLPs简介 |
| 1.3 HPV疫苗研究进展 |
| 1.3.1 HPV治疗性疫苗 |
| 1.3.2 HPV预防性疫苗 |
| 1.4 重组HPV L1表达系统 |
| 1.4.1 真核表达系统 |
| 1.4.2 原核表达系统 |
| 1.5 本实验研究意义 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、载体、菌株及细胞株 |
| 2.1.2 抗体及培养基 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 主要溶液及配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组表达质粒构建及鉴定 |
| 2.3.2 目的蛋白的表达 |
| 2.3.3 目的蛋白阳离子交换层析 |
| 2.3.4 SDS-PAGE检测方法 |
| 2.3.5 Western-blot检测方法 |
| 2.3.6 VLPs的解组装和重组装 |
| 2.3.7 VLPs形态鉴定 |
| 2.3.8 蛋白浓度的测定 |
| 2.3.9 动物免疫实验 |
| 2.3.10 假病毒的制备及滴度的确定 |
| 2.3.11 体外中和实验 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 重组质粒pET-30a-HPV52 L1和pCold-HPV52 L1的构建及鉴定 |
| 3.2 重组质粒pET-30a-HPV52 L1表达条件优化 |
| 3.2.1 不同表达载体对目的蛋白表达影响 |
| 3.2.2 不同表达菌株对目的蛋白表达影响 |
| 3.2.3 不同表达温度对目的蛋白表达影响 |
| 3.2.4 不同诱导剂浓度对蛋白表达的影响 |
| 3.3 重组L1蛋白SDS-PAGE和Western-blot鉴定 |
| 3.4 组装条件优化的动态光散射 |
| 3.4.1 类病毒样颗粒体外解组装 |
| 3.4.2 盐浓度对组装的影响 |
| 3.4.3 pH值对组装的影响 |
| 3.4.4 Tween-80对组装的影响 |
| 3.5 HPV52 L1VLPs透射电镜检测 |
| 3.6 免疫活性检测 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（9）人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1抗原定量及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 引言 |
| 1 人乳头瘤病毒(HPV) |
| 2 HPV预防性疫苗 |
| 3 基于稳定同位素标记的靶向蛋白定量 |
| 3.1 定量特征肽段的筛选 |
| 3.2 稳定同位素标记策略 |
| 3.3 目标离子检测技术 |
| 4 研究目的与意义 |
| 4.1 ELISA定量研究 |
| 4.2 质谱定量研究 |
| 4.3 免疫原性研究 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验仪器 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 质粒 |
| 2.3 HPV预防性疫苗 |
| 2.4 HPV16抗体 |
| 2.5 HPV16 L1抗原检测试剂 |
| 2.6 其它材料 |
| 2.7 实验动物 |
| 2.8 常用试剂 |
| 2.9 常用溶液 |
| 2.10 统计学方法 |
| 2.11 主要生物软件和分析工具 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 BCA蛋白测定实验 |
| 3.2 HPV16 L1L2假病毒的制备和滴定 |
| 3.3 动物免疫与血清采集 |
| 3.4 假病毒为基础的中和实验 |
| 3.5 间接ELISA实验 |
| 3.6 双抗体夹心ELISA实验 |
| 3.7 竞争抑制ELISA实验 |
| 3.8 样品酶解 |
| 3.9 液质联用分析 |
| 3.10 标准溶液及质控样的制备 |
| 3.11 酶解方法的优化 |
| 3.12 p16LLw基因定点突变 |
| 3.13 透射电子显微镜观察 |
| 3.14 蛋白质免疫印迹法(Western Blotting) |
| 第三章 结果与讨论 |
| 第一部分 HPV16 L1抗原ELISA定量方法的建立与应用 |
| 一 实验结果 |
| 二 讨论 |
| 三 小结 |
| 四 研究的创新点与局限性 |
| 第二部分 HPV多价联合疫苗中16型和18型L1抗原质谱定量方法的建立与应用 |
| 一 实验结果 |
| 二 讨论 |
| 三 小结 |
| 四 研究的创新点与局限性 |
| 第三部分 HPV16 L1抗原的免疫保护活性涵盖L1突变株的研究 |
| 一 实验结果 |
| 二 讨论 |
| 三 小结 |
| 四 研究的创新点与局限性 |
| 第四章 全文总结与展望 |
| 第一部分 HPV16 L1抗原ELISA定量方法的建立与应用 |
| 第二部分 HPV多价联合疫苗中16型和18型L1抗原质谱定量方法的建立与应用 |
| 第三部分 HPV16 L1抗原的免疫保护活性涵盖L1突变株的研究 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: 缩略语 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）基于生物表面展示策略的功能化纳米载体的构建和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 序言 |
| 1.1 纳米材料概述 |
| 1.2 功能化纳米粒子简介 |
| 1.2.1 功能化纳米粒子的用途 |
| 1.2.2 功能化纳米粒子上偶联配体的种类 |
| 1.3 纳米材料功能化及其表面修方法概述 |
| 1.3.1 表面包被法 |
| 1.3.2 物理吸附法 |
| 1.3.3 化学偶联法 |
| 1.3.4 针对蛋白配体的纳米偶联方法 |
| 1.4 纳米仿生材料综述 |
| 1.4.1 病毒拟态纳米材料 |
| 1.4.2 细胞拟态纳米材料 |
| 1.4.3 细菌拟态纳米材料 |
| 1.4.4 其他生物拟态纳米材料 |
| 1.5 生物表面展示技术的概述 |
| 1.5.1 微生物表面展示系统 |
| 1.5.2 细胞表面展示系统 |
| 1.5.3 蛋白纳米笼表面展示系统 |
| 1.6 选题的意义、目的和思路 |
| 第二章 病毒拟态纳米囊泡作为通用的疫苗抗原展示平台 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验仪器和试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验质粒、细胞、菌株及小鼠 |
| 2.2.4 常用实验试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 常用的分子克隆实验方法 |
| 2.3.2 HA抗原基因的细胞转染 |
| 2.3.3 流感病毒血凝素蛋白HA在细胞膜上定位的鉴定 |
| 2.3.4 流感病毒拟态纳米囊泡的制备和纯化 |
| 2.3.5 流感病毒拟态纳米囊泡的材料学相关表征 |
| 2.3.6 流感病毒拟态纳米囊泡的凝血酶活性检测 |
| 2.3.7 小鼠的免疫及免疫效果的评价 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 激光共聚焦显微镜鉴定HA抗原的细胞定位 |
| 2.4.2 病毒拟态纳米囊泡的冷冻电镜成像 |
| 2.4.3 病毒拟态纳米囊泡的免疫共沉淀检测 |
| 2.4.4 凝血酶活性检测 |
| 2.4.5 小鼠免疫血清的总抗体滴度测定 |
| 2.4.6 中和抗体滴度检测 |
| 2.4.7 血凝抑制效果的测试 |
| 2.4.8 小鼠的攻毒实验 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 外泌体拟态纳米囊泡作为肿瘤靶向的药物递送平台 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器和试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验质粒、细胞、菌株及小鼠 |
| 3.2.4 常用实验试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 质粒构建及基因转染 |
| 3.3.2 靶向蛋白配体的细胞定位 |
| 3.3.3 外泌体拟态纳米囊泡的制备 |
| 3.3.4 外泌体拟态纳米囊泡的材料学表征 |
| 3.3.5 体外细胞靶向结合实验以及光热治疗 |
| 3.3.6 体外细胞毒性检测 |
| 3.3.7 小鼠肿瘤模型的建立 |
| 3.3.8 多模态分子成像及成像指导下的光热治疗 |
| 3.3.9 阿霉素药物的生物分布 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 质粒构建 |
| 3.4.2 改造后的hEGF的细胞定位 |
| 3.4.3 表面活化剂诱导细胞出芽产生微囊泡 |
| 3.4.4 不同表面活化剂对囊泡粒径的影响 |
| 3.4.5 外泌体拟态纳米囊泡的其他表征 |
| 3.4.6 外泌体拟态纳米囊泡的细胞靶性以及生物活性的检测 |
| 3.4.7 细胞的靶向光热治疗 |
| 3.4.8 肿瘤的多模态成像 |
| 3.4.9 成像指导下的活体光热治疗 |
| 3.4.10 HER2靶向的药物运输 |
| 3.4.11 HER2靶向的小鼠肿瘤治疗 |
| 3.4.12 小鼠各脏器的H&E染色 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 展示PD-L1抗体的、细胞膜包裹的氧化锰纳米粒子用作肿瘤的放疗与免疫联合治疗,以诱导远端效应 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验仪器和试剂 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂及材料 |
| 4.2.3 实验质粒、细胞、菌株及小鼠 |
| 4.2.4 常用实验试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MnO_2纳米粒子的合成 |
| 4.3.2 骨髓间充质干细胞的培养与基因工程修饰 |
| 4.3.3 骨髓间充质干细胞(MSC)来源的膜囊泡的提取 |
| 4.3.4 细胞膜包裹的氧化锰纳米粒子的制备 |
| 4.3.5 膜包裹氧化锰纳米粒子的表征 |
| 4.3.6 体外细胞实验 |
| 4.3.7 活体成像 |
| 4.3.8 肿瘤放疗与免疫治疗 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 PLV-aPD-L1质粒的构建 |
| 4.4.2 PD-L1 ScFv在细胞中的定位 |
| 4.4.3 透射电镜图 |
| 4.4.4 膜包裹氧化锰纳米颗粒的其他表征 |
| 4.4.5 体外细胞靶向性以及免疫激活 |
| 4.4.6 体外放疗增敏检测 |
| 4.4.7 放疗后的细胞杀伤效果 |
| 4.4.8 活体MR成像 |
| 4.4.9 活体荧光成像 |
| 4.4.10 远端效应的检测 |
| 4.4.11 放疗后细胞因子的检测 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 第五章 总结和展望 |
| 附件 |
| 参考文献 |
| 缩写词 |
| 致谢 |
四、Carboxyl Terminus Truncated Human Papillomavirus Type 58 L1 Protein Maintains Its Bioactivity and Ability to Form Virus-like Particles（论文参考文献）
- [1]重组HPV16 L1壳蛋白的原核表达与分离纯化[D]. 王蕾. 长春工业大学, 2021(08)
- [2]戊型肝炎病毒ORF2的结构分析及戊型肝炎-口蹄疫联合疫苗的免疫原性研究[D]. 刘真真. 东南大学, 2020(02)
- [3]猪圆环病毒的入核机制研究[D]. 周建卫. 浙江大学, 2020
- [4]HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立[D]. 李相梅. 吉林大学, 2020(08)
- [5]E3泛素连接酶TRAIP调控先天性免疫的机制研究[D]. 时培殿. 天津大学, 2020(01)
- [6]基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究[D]. 朱俐. 北京化工大学, 2019(01)
- [7]弓形虫病毒样颗粒疫苗的免疫原性研究[D]. 郭晶晶. 山东大学, 2019(02)
- [8]人乳头瘤病毒52型病毒样颗粒研究[D]. 郭晶. 长春工业大学, 2019(03)
- [9]人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1抗原定量及免疫原性研究[D]. 宁婷婷. 北京协和医学院, 2019(02)
- [10]基于生物表面展示策略的功能化纳米载体的构建和应用[D]. 张鹏飞. 厦门大学, 2019(08)