人细胞色素P450 2B6 GST融合蛋白及其抗体的制备

一、人细胞色素P450 2B6的GST融合蛋白及其抗体的制备（论文文献综述）

李楠楠^[1]（2014）在《18O标记量肽段串联体蛋白—多反应监测质谱的目标蛋白质组绝对定量新方法研究》文中进行了进一步梳理近年来，蛋白质组学技术方法已从高效分离结合质谱的规模化发现技术向验证和临床应用的高效液相色谱结合质谱的定量技术过渡。生物体的功能不仅由蛋白质的种类决定，而且还由所含的蛋白质的量决定。由于蛋白质组的动态变化范围很大且极端复杂，如何在规模化程度上实现蛋白组高准确度的定量分析，一直是定量蛋白质组研究中亟需解决的问题。由于定量肽段串联体蛋白质（concatamers of Q peptides, QconCATs）结合多反应监测质谱（MRM MS）技术中采用的QconCATs制备方法可以有效解决规模化制备内标肽段的问题，同时又可以利用MRM MS的高特异性、高灵敏度和高准确度的特性，因此，这种技术方法受到广泛关注。本论文研究是基于QconCATs技术制备内标肽段，然后与MRM MS结合实现目标蛋白质组绝对含量的分析，即通过QconCAT重组蛋白的18O同位素标记和重标氨基酸同位素标记等多重标记手段结合MRM MS，建立一种目标蛋白质组绝对定量新方法，并将该方法用于目标蛋白质组的绝对定量分析中。本论文共分三部分。在第一章前言中，主要介绍了蛋白质组学的发展概况，包括蛋白质组学的研究策略、定量蛋白质组学的研究及其应用以及目标蛋白质组学定量的技术策略最新进展等，最后提出了本论文的研究内容。在第二章中，我们建立了QconCATs结合18O同位素标记-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法。该方法的特点一是18O水比细胞培养氨基酸稳定同位素标记（SILAC）和同位素相对标记与绝对定量（iTRAQ）试剂价格低廉；二是采用QconCATs方法制备内标肽段适合高通量的目标蛋白质组的绝对定量分析；三是MRM MS具有的高特异性、高灵敏度和高重现性的特性适用于复杂样本中蛋白质的含量测定。在该方法的建立过程中，首先对QconCAT重组蛋白进行了纯度表征，即通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行结果表征，QconCAT重组蛋白的纯度为99%以上，分子量约为63.4kDa，与理论设计的QconCAT蛋白的分子量一致；其次，通过对QconCAT重组蛋白酶切后肽段混合物的质谱分析，并经pFind和pLabel软件处理，确证了利用QconCAT重组蛋白表达的目标肽段与选定的内标肽段一致。还考察了QconCAT重组蛋白的酶切效率和18O标记效率，并对QconCAT蛋白结合18O标记-同位素稀释-多反应监测质谱方法进行了评价。实验结果表明：当采用该方法对腾冲嗜热厌氧菌（Thermoanaerobactertengcongensis，TTE）中选定蛋白质的肽段进行绝对含量测定时，定量限为2fmol，相对标准偏差RSD小于20%，误差小于5%，说明该方法可用于复杂生物样本中蛋白质的绝对定量。更重要的是所建方法不仅解决了SILAC重标试剂价格昂贵问题，也为定量蛋白质组学提供了一种新的方法选择。在第三章，我们建立了一种酶促18O同位素-QconCAT多重标记结合MRM质谱的目标蛋白质组绝对定量新方法。该方法的特点是除了利用QconCATs技术可以解决高通的制备内标肽段的问题，还可以对QconCAT重组蛋白进行多重标记，并通过酶解得到含+4Da、+6Da和+14Da三种不同标签和不同浓度的QconCAT内标肽段而建立的内标法工作曲线，实现一次性上样就可以对人肝微粒体中22种药物代谢酶含量进行准确测定。这为药物代谢酶活性以及潜在的酶抑制和诱导作用的研究提供了依据，并对药物-药物相互作用研究和临床个体化给药具有指导意义。另外，通过对22种药物代谢酶定量结果的统计分析，即对采用三种内标肽段分别加入到等量的三个相同样本与将三种内标肽段混合后再加入到同样量的样本后进行质谱分析的结果进行比较，采用前一种方法测定的22种药物代谢酶浓度的RSD值范围为5%-80%，而采用后一种方法测定的22种药物代谢酶浓度的RSD值为1.25%-25%，说明该方法可以解决多次单独分析时带来方法重现性差的问题；此外，该方法的定量限为2fmol；对复杂生物体系的目标蛋白质组定量分析时，低丰度蛋白质的线性范围为2fmol-50fmol，高丰度蛋白质的线性范围为50fmol-800fmol，总体跨越2个数量级，并且在一个数量级内曲线的线性回归系数R2均在0.95以上，方法中最大的RSD＜25%，误差＜10%，表明该方法可以准确地用于复杂的生物体系中目标蛋白质组的绝对定量分析。

张玲玲^[2]（2010）在《离子载体类抗生素与氟喹诺酮类药物对AA肉鸡细胞色素P4501A和3A的影响及作用机制》文中提出本研究测定离子载体类抗生素对鸡CYP1A和3A的诱导作用及作用机制；氟喹诺酮类药物对CYP1A和3A的抑制作用及作用机制；经典抑制剂对鸡CYP1A和3A亚型的抑制作用,旨在探讨药物对鸡CYP4501A和3A的影响及影响机制,为临床合理用药提供理论依据。具体研究内容分为以下五部分：1.研究三种离子载体类抗生素对鸡CYP1A与3A活性的影响。将120 mg/kg的莫能菌素,60mg/kg的盐霉素和5mg/kg的马杜拉霉素分别添加到28日龄的雄性AA肉鸡饲料中,连续14d,通过体内探针实验和体外微粒体孵育实验观察CYP1A和3A活性的变化。体内探针采用的是咖啡因与氨苯砜,体外孵育实验采用的是0.5-20mM的非那西丁与0.125-5mM的咪达唑仑作为底物。体内探针实验测得三种离子载体类抗生素不影响咖啡因代谢的药动学参数（P>0.05）；使氨苯砜的药时曲线下面积AUC,消除半衰期t1/2有不同程度的降低,清除率Cl有不同程度的增加,体内实验结果表明离子载体类抗生素可诱导CYP3A的活性,盐霉素的诱导能力>莫能菌素>马杜拉霉素。体外微粒体孵育实验测得：三种离子载体抗生素组与对照组相比对乙酰氨基酚生成的最大反应速率Vmax及米氏常数Km均差异不显着（P>0.05）；莫能菌素极显着的加快1-羟基咪达唑仑的生成最大反应速率Vmax（P<0.01）；盐霉素组与马杜拉霉素组差异不显着（P>0.05）；三个处理组的米氏常数Km差异不显着（P>0.05）。体内体外结果表明饲料中连续14d添加莫能菌素、盐霉素、马杜拉霉素对鸡肝CYP3A的活性存在不同程度的诱导作用,其中马杜拉霉素的诱导作用最弱,而对CYP1A活性没有诱导作用。2.研究三种离子载体类抗生素对鸡CYP450与b5含量的影响,及对CYP1A与3A蛋白表达与mRNA表达的影响,以期了解离子载体类抗生素对CYP450活性的诱导机制。采用了分光光度计测定CYP450与b5含量；荧光定量PCR测定鸡CYP1A4,1A5与3A37mRNA的表达；免疫印迹测定CYP1A蛋白与3A蛋白的表达。结果表明CYP450与b5的含量各组间没有显着差异（P>0.05）；荧光定量PCR检测显示各组间CYP1A4,1A5与3A37mRNA表达没有显着差异（P>0.05）；免疫印迹结果显示莫能菌素组与盐霉素组的CYP3A蛋白表达增加,差异显着（P<0.05）,而马杜拉霉素对CYP3A蛋白表达影响差异不显着（P>0.05）；三者对CYP1A蛋白的表达没有影响（P>0.05）。结果提示莫能菌素、盐霉素、马杜拉霉素不同程度地诱导鸡肝CYP3A的活性,而这种诱导作用通过转录后机制来调节。3.研究三种氟喹诺酮类药物对雄性AA肉鸡CYP1A与3A活性的影响.本实验给予恩诺沙星、沙拉沙星与麻保沙星的剂量分别为20,8,5.5 mg/kg BW,连续7d。通过体内探针实验和体外微粒体孵育实验观察对CYP1A和3A活性的抑制作用。体内探针实验测得恩诺沙星与麻保沙星显着增加了咖啡因的消除半衰期t1/2<0.05)；同时麻保沙星显着增加了咖啡因代谢的AUC,降低了Cl（P<0.05）；恩诺沙星显着增加了氨苯砜代谢的AUC和t1/2（P<0.05）,极显着降低了Cl（P<0.01）。体外微粒体孵育实验表明,三种氟喹诺酮类药物组使对乙酰氨基酚生成的最大反应速率Vmax显着降低（P<0.05）；恩诺沙星组使1-羟基咪达唑仑的最大生成速率Vmax极显着的降低（P<0.01）;三个药物处理组的米氏常数Km均有所下降,恩诺沙星组差异极显着（P<0.01）。体内体外结果表明高剂量恩诺沙星、沙拉沙星与麻保沙星均对鸡的CYP1A活性存在着不同程度的抑制作用,麻保沙星的抑制能力>恩诺沙星>沙拉沙星,同时高剂量的恩诺沙星抑制着CYP3A的活性,此剂量的麻保沙星与沙拉沙星尚未表现出对CYP3A的抑制作用。4.研究三种氟喹诺酮类药物对鸡CYP450与b5含量的影响,及对鸡CYP1A与3A蛋白表达与mRNA表达的影响。恩诺沙星、沙拉沙星、麻保沙星高剂量给药,连续7d,采用了分光光度计测定对CYP450与b5含量的影响；荧光定量PCR测定对鸡CYP1A4,1A5与3A37mRNA表达的影响；免疫印迹测定对CYP1A蛋白与3A蛋白表达的影响。结果表明,恩诺沙星与麻保沙星使CYP450的含量显着降低（P<0.05）,沙拉沙星对其没有影响；各组间b5的含量没有显着差异；荧光定量PCR检测显示各组间CYP1A4,1A5与3A37mRNA表达没有显着差异；免疫印迹结果显示恩诺沙星使CYP1A和3A蛋白表达减少,差异显着（P<0.05）,而麻保沙星对CYP1A蛋白表达呈现抑制的作用,差异显着（P<0.05）,沙拉沙星对CYP1A与3A蛋白的表达没有影响。结果提示高剂量的恩诺沙星抑制雄性肉鸡CYP1A和3A的活性和蛋白表达,麻保沙星抑制CYP1A的活性和蛋白表达。5.比较鸡与大鼠肝微粒体代谢非那西丁与咪达唑仑的活性,研究经典抑制剂α萘黄酮和酮康唑及三种氟喹诺酮类药物恩诺沙星、沙拉沙星、麻保沙星对鸡非那西丁O-脱乙基化与咪达唑仑1-羟基化活性的抑制程度及抑制机制。取肝微粒体混合样,建立体外孵育体系,以对乙酰氨基酚和1-羟基咪达唑仑的生成速率反映CYP1A与3A的活性。鸡与大鼠代谢非那西丁与咪达唑仑的过程均符合米曼氏动力学特征,代谢非那西丁的Vmax分别为0.089±0.053和0.671±0.288nmol/mg/min, Km分别为78.45±48.10和107.1±45.5μM,代谢咪达唑仑的Vmax分别为0.081±0.022和0.781±0.275nmol/mg/min, Km分别为5.33±2.56和1.85±0.67μM；α萘黄酮对鸡非那西丁的代谢呈现非竞争性抑制作用,IC50=0.1304μM,ki=0.580μM,而麻保沙星的ICso值为93.79μM, Ki=77.12μM,为竞争性与非竞争性混合型抑制作用,未检测到恩诺沙星与沙拉沙星对非那西丁代谢的抑制作用。酮康唑对咪达唑仑1-羟基化活性的可逆抑制机理与恩诺沙星、沙拉沙星和麻保沙星相同,均为非竞争性与反竞争性混合型抑制,IC50值分别为30.6,63.93、145.4和42.52μM, Ki值分别为93.01,70.76、150.84与64.24μM；体外检测到恩诺沙星、沙拉沙星和麻保沙星均对非那西丁和咪达唑仑的代谢呈现时间依赖性的抑制作用。结果表明与大鼠相比,鸡的CYP1A和3A的活性均很低；a萘黄酮对鸡CYP1A的抑制作用很强；CYP3A的经典抑制剂酮康唑对鸡咪达唑仑1-羟基化活性的抑制作用并不强,,而与恩诺沙星、沙拉沙星与麻保沙星相当；时间依赖性的不可逆抑制作用可能是导致CYP450活性降低和蛋白表达减少的原因,最终会导致体内药物的相互作用。

蒋春梅^[3]（2007）在《丙型肝炎病毒F蛋白基因的克隆表达及初步应用研究》文中认为丙型肝炎病毒（HCV）感染所引起的丙型肝炎呈全球分布。据WHO估计，目前全世界约有1.8亿HCV感染者，且呈增长趋势。HCV是单股正链RNA病毒，HCV感染所致的丙型肝炎慢性化率高达75％～85％，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对人类的健康和生命构成了严重威胁。丙型肝炎病毒属黄病毒属，全长约9.6kb，为一单股正链RNA，分为5’非翻译区（UTR）、一个开放读码框（ORF）和3’非翻译区，编码一个由3000多个氨基酸组成的复合蛋白前体，在宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的作用下裂解产生至少10种基因产物：四种结构蛋白（core，E1，E2，p7）和六种非结构蛋白（NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B）。而在HCV编码的十几种蛋白中，核心蛋白（core）是HCV多聚蛋白前体经细胞信号肽酶剪切而产生的非糖基化蛋白，由191个氨基酸组成。该蛋白的氨基酸序列十分保守，具有调控多种细胞基因，影响细胞生长、增生及凋亡的能力。近年来外国学者在感染HCV的患者血清中发现了HCV-F蛋白，是由HCV核心基因编码的另一个产物，它是由核心基因密码子核苷酸移位后产生的。其在HCV不同基因型的高度保守性和在患者体内抗体的存在，显示F蛋白在HCV生命周期中起重要作用。为了研究此种蛋白抗体在我国丙肝人群是否同样存在及其分布情况，探讨F抗体与HCV感染之间的关系。我们进行了如下研究：第一部分：丙型肝炎病毒F蛋白重组基因片段的克隆及其在细菌中的表达根据GENBANK提供的HCV1b序列设计引物，扩增F蛋白基因片段。PCR产物经过纯化后，与用BamH I和EcoRⅠ双酶切，电泳回收后与用上述双酶切割并电泳回收的pGEX-4T-2质粒连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞。PCR鉴定可扩增出与目的片段大小一致的DNA片段。同时提取重组质粒进行DNA序列测定与比对分析，结果证实DNA插入序列正确。对构建的重组工程菌用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE电泳分析显示HCV-F／GST（Glutathione S-transferase）特异性表达产物的分子量约为43KD，表达量占菌体蛋白的15％左右。本研究成功构建了表达丙型肝炎F蛋白重组基因片段的工程菌，为获得抗原性强、特异性好的F蛋白抗原奠定了基础。第二部分：丙型肝炎病毒重组F表达蛋白的纯化与初步鉴定将HCV-F／GST重组工程菌大量培养后加IPTG诱导表达，离心收菌并超声破碎后进行SDS-PAGE电泳检测，证实表达蛋白为可溶性蛋白。将超声裂解上清置入Glutathione sepharose 4B亲和层析柱中，用洗脱液（还原型谷胱甘肽）洗脱。收集洗脱下来的蛋白溶液，进行SDS-PAGE鉴定，并用紫外分光光度计测定蛋白浓度，于-30℃保存备用。同时转化空质粒pGEX-4T-2入大肠杆菌，诱导表达GST蛋白，并进行Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化。将纯化获得的HCV-F／GST融合表达蛋白作抗原，稀释后包被酶联反应板，ELISA间接法检测已知的4份抗HCV阳性血清、4份正常人血清。结果显示此表达蛋白能与3份抗HCV阳性血清反应，而与1份抗HCV阳性血清和正常人血清不发生反应。同时Western blot分析也证实此蛋白抗原能与阳性血清抗体发生特异性结合。以上结果初步说明该融合表达蛋白制备、纯化较容易，并与丙肝病人血清出现特异性反应。本研究建立了表达蛋白的纯化方法，并纯化获得了具有良好抗原性的HCV-F／GST蛋白抗原。第三部分：用HCV-F／GST蛋白做为抗原检测丙肝病人血清抗体将纯化后的重组表达蛋白HCV-F／GST作为抗原包被酶联反应板，以待测血清标本为一抗，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体为二抗，以GST蛋白孔作为本底对照，ELISA间接法分别检测120份抗HCV阳性血清、10份正常人血清。结果重组蛋白与82份的抗HCV阳性血清均可发生特异性反应（抗体阳性率68％），而与10份正常人血清不起反应。病例组与对照组有统计学差异（p＜0.01）。发现50岁以上年龄组抗HCV-F抗体的阳性率高于20～50岁年龄组，有统计学差异（p＜0.01）；中重度和肝硬化患者阳性率最高（p＜0.05）；抗HCV-F抗体在男性和女性患者中的检出无统计学差异；且与患者血清中HCVRNA的检出无统计学差异（P=0.099），而在HCV RNA各型别之间的检出亦无统计学差异（P=0.926）。以上结果表明该融合表达蛋白具有较好的抗原性和特异性。本研究建立了以ELISA间接法为基础的HCV-F／GST抗体检测方法，并对检测试剂、反应条件进行了优化。第四部分：HCV-F／GST多克隆抗体的制备将纯化后的重组表达蛋白HCV-F／GST作为抗原免疫BALB／c小鼠，取鼠尾血用间接ELISA法检测抗HCV-F抗体效价≥1∶10 000。加强免疫后摘眼球取血，分离血清。Western blot分析证实此免疫后血清可与HCV-F／GST蛋白发生特异性结合，正常小鼠血清不与此蛋白发生反应。结果表明该免疫血清与HCV-F／GST有良好的免疫反应性，为进一步研究HCV-F蛋白在HCV感染和病程中的作用提供了实验基础。

陈雪梅^[4]（2003）在《大鼠Mint2 PTB结构域的原核表达与多克隆抗体的制备》文中研究说明背景和目的 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的病因之一是脑内淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）的产生和分泌，β来自脑内淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP）。Mints（Munc18 interaction proteins）家族是一个接头分子家族，其家族成员中的Mint1和Mint2特异性表达于神经元中。许多研究表明Mints是调节APP代谢和Aβ产生的重要物质，被认为在阿尔茨海默病的病因、病理过程中发挥着极为重要的作用。 Mint2基因最初是在研究Mint1与APP的相互作用中被发现的。Mint2与APP结合可以调节APP的代谢和Aβ的产生。Mint2的PTB结构域与APP的C端YENPTY基序结合，抑制Aβ40的分泌，却不影响Aβ42的产生。当Mint2-APP复合体以Mint2的N端与XB51结合时，XB51-Mint2便从细胞膜转位到细胞浆中，XB51阻碍了Mint2-APP的结合，消除Mint2对Aβ40分泌的抑制作用。当Mint2的PDZ2结构域与单体NF-KB／P65 PHD域的161-FQV-163基序结合时，导致了Aβ42分泌水平的降低。因此，Mint2对Aβ分泌的抑制作用使其成为一个治疗AD的药物目标。 为在分子水平上深入探索Mint2 PTB结构域在APP代谢过程以及信号转导中的作用，本研究利用重组DNA技术构建大鼠Mint2 PTB结构域的融合蛋白表达质粒，在大肠杆菌中进行了PTB结构域蛋白的原核表达，同时制备了抗大鼠Mint2 PTB结构域小鼠多克隆抗体。获得的蛋白和抗体便于今后用于转染细胞或原代神经元的免疫印迹以及免疫共沉淀的实验，为进一步的功能研究提供了可靠的实验工具。郑州大学2003年研究生毕业论文大鼠M功tZ PTB结构域的原核表达与多克隆抗体的制备方法1.聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，P以）技术扩增大鼠肠ntZ pTB结构域片段:引物设计参照Genbank中大鼠MintZ PTB结构域的创ONA序列，利用DNAstar软件作为辅助工具，反应条件参照分子克隆略加改进。2.序列鉴定:使用双脱氧链终止法在上海基康公司进行DNA序列测序。3 .pGEX4T3一PTB重组质粒的获取:将PCR扩增片段和pGEX4T3载体分别用BamFa和Xhof双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，获得pGEx4T3一TB重组质粒。4.pGEX4T3一TB重组质粒的扩增和鉴定:将pGEX4T3一，n3转化大肠杆菌TGI扩增后，进行质粒抽提，酶切鉴定。5.蛋白质表达和纯化:用pGEx碑T3一TB重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），正TG诱导表达后经15%SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS.PAGE）检测GST一珊（Glutathiones一transformase，GST）融合蛋白，利用电泳凝胶成像分析系统对GST一扭融合蛋白进行分析，目的蛋白采用谷光甘肤一sePharose4B亲和层析柱进行纯化。6.P阳结构域抗体的制备与检测:用纯化的GST一珊融合蛋白直接免疫BA工B/C小鼠获得抗血清，用结合有GST的亲和层析珠去除抗GST的抗体，用交联有GST一TB的SePharose一4B珠纯化抗PTB抗体;采用酶联免疫吸附试验（E几刁me linkedimmuno一sorbent ass即，ELIsA）和蛋白质印迹（westem blot）法检测抗体的效价和特异性。结果1 .PcR扩增片段电泳结果:PcR扩增片段有一条亮带，在与Marker soobP对应处。2.DNA测序结果:所得片段长度为sl3bp，测序图第79位至591位碱基对应大鼠珑ntZ PTB的cDNA第1 320位至1 832位碱基。3 .pGEx4T3一TB重组质粒鉴定:双酶切产物经1%琼脂糖电泳后，有二条亮带，一条位于Marker soobp对应处，另一条大于Z000bp。4.融合蛋白的表达和纯化结果:融合蛋白经聚丙烯酸胺凝胶电泳在约43 000处有目的条带，灰度扫描显示约20%的目的蛋白存在于上清液中，纯化后蛋白纯度高于95%。5.PTB结构域抗体效价及特异性检测结果:ELISA检测结果抗体效价可达l:26 730，研触stem blot检测在GST抗原处无免疫反应条带。郑州大学2003年研究生毕业论文大鼠Mixz份P功结构域的原核表达与多克隆抗体的制备结论 本研究成功构建了pGEx4T3一TB重组质粒，在大肠杆菌BL21内完成了GST一TB融合蛋白的可溶性表达，并利用GST一TB融合蛋白免疫BALB/C小鼠获得了最高效价为1:26 730的特异性抗大鼠MintZ PTB结构域的多克隆抗体，为免疫印迹和免疫共沉淀等实验提供了可靠的工具。

林筱洁,罗建红,余应年^[5]（2000）在《人细胞色素P450 2B6的GST融合蛋白及其抗体的制备》文中指出目的 :获得纯化抗原用于制备CYP2B6多克隆抗体。方法 :PCR扩增目的基因片段 ,亚克隆入融合蛋白表达载体pGEX - 3b ,构建了重组质粒pGEX/ 2B6。然后将该重组质粒转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE分离 ,获纯化融合蛋白GST - 2B6。用GST - 2B6免疫BALB/C小鼠 ,自腹水中获取CYP2B6多克隆抗体 （2B6pAb）。结果 :融合蛋白GST - 2B6 （CYP2B6 2 0 2～ 35 2aa） ,并获其特异的多克隆抗体。结论 :通过构建融合蛋白重组表达质粒pGEX/ 2B6 ,用获得的初步纯化融合蛋白GST - 2B6制备了特异的2B6pAb

二、人细胞色素P450 2B6的GST融合蛋白及其抗体的制备（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、人细胞色素P450 2B6的GST融合蛋白及其抗体的制备（论文提纲范文）

（1）18O标记量肽段串联体蛋白—多反应监测质谱的目标蛋白质组绝对定量新方法研究（论文提纲范文）

（2）离子载体类抗生素与氟喹诺酮类药物对AA肉鸡细胞色素P4501A和3A的影响及作用机制（论文提纲范文）

（3）丙型肝炎病毒F蛋白基因的克隆表达及初步应用研究（论文提纲范文）

（4）大鼠Mint2 PTB结构域的原核表达与多克隆抗体的制备（论文提纲范文）

四、人细胞色素P450 2B6的GST融合蛋白及其抗体的制备（论文参考文献）

• [1]18O标记量肽段串联体蛋白—多反应监测质谱的目标蛋白质组绝对定量新方法研究[D]. 李楠楠. 广西医科大学, 2014(10)
• [2]离子载体类抗生素与氟喹诺酮类药物对AA肉鸡细胞色素P4501A和3A的影响及作用机制[D]. 张玲玲. 南京农业大学, 2010(06)
• [3]丙型肝炎病毒F蛋白基因的克隆表达及初步应用研究[D]. 蒋春梅. 南京医科大学, 2007(04)
• [4]大鼠Mint2 PTB结构域的原核表达与多克隆抗体的制备[D]. 陈雪梅. 郑州大学, 2003(01)
• [5]人细胞色素P450 2B6的GST融合蛋白及其抗体的制备[J]. 林筱洁,罗建红,余应年. 中国病理生理杂志, 2000(01)

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