一、初步探讨丙型肝炎病毒体外感染的致病机理（论文文献综述）
刘盼娆[1]（2020）在《新城疫病毒感染诱导宿主细胞氨基酸代谢重编程的研究》文中研究表明新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是一种有囊膜的单股负链RNA病毒,属副黏病毒科成员,对鸡和多种禽类具有高度致病性和致死性,造成巨大的经济损失,严重威胁养禽业的发展。病毒作为一种严格胞内寄生物,需要通过操控宿主细胞代谢和代谢资源,为其自身生存和增殖创造有利条件。本研究利用代谢组学和分子生物学等方法以NDV诱导感染细胞发生代谢重编程为切入点,探究NDV感染细胞氨基酸的代谢规律以及调节的重要途径,阐明细胞氨基酸代谢改变对NDV增殖的影响及其调节机制。主要研究内容如下:1.采用UHPLC-QTOF-MS对NDV强毒株Herts/33感染的DF-1细胞和鸡的肺组织进行了代谢组学分析,体外和体内试验结果表明,NDV感染打破了DF-1细胞和肺组织内代谢稳态,促进其代谢重编程,显着地影响宿主细胞的氨基酸代谢和核苷酸代谢。这些代谢物和代谢通路的鉴定将为进一步了解NDV复制需要和发病机制提供重要信息。2.通过UHPLC-MS靶标代谢组学分析,阐明了NDV感染DF-1和A549细胞后的氨基酸代谢变化,其中谷氨酸和天冬氨酸明显增加;对纯化后NDV、细胞DF-1和A549的氨基酸相谱组成分析显示,NDV对谷氨酸和天冬氨酸具有一定偏嗜性。这从氨基酸代谢角度对NDV能够在DF-1和A549细胞上有效快速复制提出了可能解释。3.通过对NDV感染宿主细胞后氨基酸转运体的变化情况进行检测分析,我们发现在NDV感染细胞中氨基酸转运体SLC1A3显着上调表达。通过siRNA、药物处理和构建细胞系的方法下调SLC1A3表达后,NDV的复制水平明显被抑制。这些结果表明NDV可通过上调被感染细胞中SLC1A3的表达以有利于自身复制。4.NDV复制需要谷氨酰胺,且对其浓度有一定的剂量依赖性。通过对谷氨酰胺转运体和谷氨酰胺代谢过程中相关酶进行检测分析,我们发现GOT1和GPT与NDV的复制密切相关。通过13C标记谷氨酰胺示踪试验结果表明,NDV感染后会导致谷氨酰胺代谢改变,能够促进谷氨酰胺分解代谢和谷氨酸的生成。5.通过免疫荧光方法和蛋白免疫印迹分析,我们发现SLC1A3可位于细胞膜、线粒体和溶酶体上,并且NDV感染细胞后可通过激活p53和NF-κB通路上调SLC1A3的表达,从而有助于谷氨酸的转运、生成和维持TCA循环。综上所述,本研究发现NDV感染后可显着影响宿主的氨基酸代谢,并且首次发现NDV可通过上调被感染细胞中SLC1A3的表达有利于自身复制。此外,本研究还发现谷氨酰胺与NDV的复制也密切相关,NDV感染后能够促进谷氨酰胺分解代谢和谷氨酸的转运和生成。这些研究结果将有助于我们了解NDV复制过程中对氨基酸的需求及其对细胞氨基酸代谢的调节作用,为今后的科学研究提供线索和方向。
郭明哲[2]（2019）在《丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究》文中研究表明HCV（Hepatitis C virus,HCV）丙型肝炎病毒是属于黄病毒科、丙型肝炎病毒属的单股正链RNA病毒。HCV在全球总人口的大约百分之一中以慢性感染的形式存在,因此HCV感染一直以来是一个沉重的社会负担。近年来直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral agents,DAA）的出现使得HCV病人的治疗得到极大的改观。但临床资料显示DAA的耐药突变的产生仍是一个严峻的问题。绝大多数HCV病人样品中的HCV病毒无法在体外的肝癌细胞系中建立高效的感染,该现象的分子机制仍未被完全阐明。第一个高效的HCV体外感染模型在2005年由三个实验室同时创建并都依赖了JFH1（Japanese fulminant hepatitis1）共有序列。但迄今为止,JFH1共有序列是唯一一个不需要任何额外改变就能在肝癌细胞系中建立高效感染的HCV序列。由于共有序列无法反映出体内复制HCV序列的真实状态,因此我们拟通过筛选HCV病人血清中准种序列的方法来提高获得具有复制能力序列的可能性。为此我们建立了一种高效的构建HCV复制子cDNA文库的方法,并在稳定表达Sec14L2的Huh7.5.1细胞系中测试了多种基因型HCV复制子cDNA文库的集落形成能力。通过上述的功能筛选策略,我们成功地获得了基因1b,3a,6a型的HCV复制子克隆细胞,而且我们所获得的亚克隆HCV复制子cDNA都有较强的复制能力。后续的序列分析表明每个复制子细胞克隆中都含有不同数量的来自于准种序列的突变,因此我们的实验结果证明来自于准种序列的多样性可以帮助HCV病毒株在肝癌细胞系中复制。使用DAA疗法的基因3型病人的SVR（Sustained virological response）显着低于其他基因型。这个临床现象中比较重要的一个原因是基因3型HCV拥有天然的NS3 DAA耐药性。我们通过基因3a型复制子PR87A7研究了基因3型NS3168Q所介导的NS3 DAA耐药性。并且通过在基因2型的JFH1复制子中引入NS3 168Q及相关位点研究了NS3 168Q稳定存在的分子机制。我们发现NS3168Q的稳定存在需要NS3蛋白酶中其他残基的帮助,其中包括123T。研究显示索磷布韦耐药位点NS5B S282T可以在基因6型病人的基线序列中以较高的频率出现,因此基因6型HCV病毒株中产生索磷布韦耐药突变的壁垒可能低于其他基因型的HCV毒株。为了证明我们的假设,我们研究了基因6a型复制子PR58C4针对索磷布韦的耐药特性,结果显示PR58C4产生NS5B S282T的分子壁垒显着低于基因1b型的Con1复制子。NS5B S282T的产生导致了PR58C4对索磷布韦处理的敏感型的降低,并且NS5B K535R与NS5B S282T的同时存在可能提高了后者的耐药表型。综上所述,我们的研究建立了一种可以用于多种基因型HCV病人样本的复制子构建方法。基因1b型PR50,基因3a型PR87,基因6a型PR58复制子克隆的成功建立证明了我们上述功能筛选策略的通用性及有效性。在基因3a型PR87的耐药研究中,我们的结果对理解HCV耐药突变的产生与病毒复制能力维持之间的平衡提供了新的思路。在基因6a型PR58的索磷布韦耐药研究中,我们发现其产生NS5B S282T耐药突变的分子壁垒较低,同时发现了一个可以提高S282T耐药能力的突变K535R,这对理解临床中复杂耐药性的产生有重要意义。
高灵茜[3]（2019）在《新现H3N2亚型SIV跨种属感染特征及特殊miRNA-mRNA-蛋白质整合研究》文中进行了进一步梳理研究背景及意义:新甲型 H1N1 大流行流感病毒（2009 pandemic H1N1 virus,pdm/09）于2009年在人群中暴发流行,之后该病毒进入猪群,成为猪流感病毒基因池中的成员之一而备受关注。经该病毒溯源研究得知,pdm/09是由人流感、禽流感和猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）重配形成的病毒,在人群流行后,它的基因片段已进入猪流感病毒中,并开始产生新的变异毒株。这表明pdm/09在人间流行后,返传给猪,获得与SIV重组形成新的重配病毒的能力,可能拥有形成新的重配毒株,并引起流感大流行的潜能。因此,重组有pdm/09片段的新现SIV对人类的潜在威胁,必须得到关注。流感病毒跨种属感染具有特殊性,非编码微小RNA（microRNA,简称miRNA）是其中一个非常重要的影响因素,细胞miRNA对流感病毒的影响,体现在病毒与宿主细胞相互作用过程中（简称相互作用）,细胞miRNA可以直接促进病毒的复制,或者通过阻止宿主被激活的抗病毒机制而协助感染的发生,或者通过调节细胞miRNA自身表达来促进宿主细胞对病毒感染的抵抗或者限制病毒的增殖过程。重组有pdm/09片段的新现SIV对传代人肺腺癌A549细胞的跨种属感染,是否存在某些特殊细胞miRNA,以及相关的miRNA-mRNA-蛋白质的交联网络又是如何,至今还缺乏相关研究。高通量测序和生物信息学分析是目前研究miRNA相对成熟的方法,先前也有一些研究借助这两种方法,对未知或者已知的miRNA的功能进行深度挖掘,但在病毒感染过程中,感染宿主参与的基因与研究所使用的宿主细胞种类、病毒毒株（型、亚型）的不同以及检测的方法有关,从而导致所得到的结果归纳性不佳,这尚需更多的研究进行多方面探索,以丰富miRNA与流感病毒的相互作用关系。综上,本文关注miRNA在流感病毒感染过程中发挥的作用,主要侧重在具有跨种属感染潜力的新现SIV感染A549细胞过程中是否存在特殊miRNA这一问题上,我们利用高通量深度测序和生物信息学大量数据分析,绘制新现SIV感染过程中miRNA-mRNA-蛋白质相互作用图谱,寻找特异性差异表达的miRNA,探讨其对病毒复制的影响,进一步研究微小RNA在开发抗病毒药物、研制疫苗和筛选新的生物标记物的潜力。目的:1.探讨新现SIV-SW2 783（简称SW2783）与参考流感病毒毒株是否具有不同的复制能力和跨种属感染潜能。2.探讨新现SW2783感染A549细胞后是否存在特殊差异表达的miRNA及具有靶向关系的mRNA。3.探讨新现SW2783感染A549细胞后是否存在特殊差异表达的蛋白质.以及与筛选出的miRNA的相互作用关系。4.初步探讨筛选的miRNA对新现SW2783的复制的影响。方法:1.建立新现SW2783及两株参考毒株（经典SIV-SW3861-简称SW3861和pdm/09的疫苗株CA09-简称CA09）体内和体外感染实验模型,对比三株流感病毒感染性的差异,通过血凝素实验（HA）、半数组织细胞感染实验（TCID50）、蚀斑实验、免疫组化和免疫荧光等实验,绘制病毒复制动力曲线,了解其不同的致病性特征。2.利用miRNA芯片技术和转录组高通量测序技术,检测SW2783、SW3861和CA09三株流感病毒（后两种病毒作为对照病毒）感染人肺腺癌A549细胞24小时后（急性感染期）的差异表达miRNA和mRNA,并对它们进行联合分析,最终得到SW2783感染A549细胞中特殊差异表达的miRNA-mRNA靶向关系对。3.通过蛋白质测序iTRAQ技术,进一步研究SW2783感染A549细胞后特异性差异表达的蛋白质,结合miRNA筛选结果,对miRNA和蛋白质进行交联分析,绘制miRNA-蛋白质关系图谱,在蛋白质水平上再次验证和探讨与跨种属感染人A549细胞过程相关的特殊miRNA。4.筛选得到的miRNA通过在A549细胞中的miRNA敲除和过表达技术,确定其对潜在靶基因的影响,并通过病毒拯救实验验证该miRNA对三株流感病毒复制的影响,进一步研究miRNA是否对SW2783的感染具有特殊的调控作用。结果:1.成功建立三株流感病毒的体外感染组织和细胞模型,显示不同病毒对组织细胞不同的感染能力。新现SW2783能够在体外感染A549细胞和人肺组织,并显示出较好的复制增殖能力,提示其具有跨种属感染人的潜力;经典猪流感病毒SW3861则体现出相对较弱的感染能力,提示其跨种属感染人的可能性较低;09年大流行甲型流感病毒CA09则能有效感染人细胞和组织;通过小鼠感染体内实验分析病毒致病特征发现,三株流感病毒均能感染小鼠,引起相应病理反应,并能够在小鼠肺部进行有效增殖,但SW2783的感染能力稍强其他两株流感病毒。2.通过对三株流感病毒感染A549细胞后24h的总RNA进行miRNA芯片检测和转录组mRNA高通量测序,得到与未感染对照组（NC组）比较差异表达的细胞miRNA和mRNA,经韦恩图分析,共筛选出52个特异性差异表达的细胞miRNA和2543个与之相关的mRNA,它们可能与跨种属感染A549细胞有关,利用GO和KEGG分析其功能,绘制出miRNA-mRNA相互作用图谱。用荧光定量PCR检测miRNA和mRNA表达量和相对倍数,发现三个 miRNA（hsa-miR-140-5p,hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-582-5p）和五个相关的mRNA所对应的基因（RCC1,ERVFRD-1,RANBP1,SCARB2和RPS29）可能与SW2783跨种属感染A549细胞有密切关系。3.用iTRAQ蛋白质测序技术,对三株流感病毒A549细胞感染24h后表达的蛋白质进行差异表达分析,共得到128个差异表达的蛋白质,推测可能与跨种属感染有关,其中70个差异表达蛋白质与52个候选miRNA存在靶向关系。通过与 hsa-miR-140-5p,hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-582-5p 建立相互作用网络,进行功能分析和筛选,6个候选蛋白质符合要求。用Western blot进行验证和通过表达量变化相对倍数分析后发现,RPS29,HMGA2,IFIT2和PPIA蛋白在SW2783感染A549细胞过程中呈特异性上调,我们推测这是新现SIV跨种属感染A549细胞时显着表达的功能性蛋白。4.综合对所有miRNA、mRNA及蛋白质的功能和与病毒之间的关系进行分析,我们发现非编码miRNA:hsa-miR-140-5p与3个潜在的靶蛋白（ERVFRD-1,PPIA和IFIT2）有关,值得进一步探讨它们之间的关系。通过敲除和过表达实验,确定了 hsa-miR-140-5p对ERVFRD-1,PPIA和IFIT2具有靶向调节作用。通过病毒拯救实验,我们尚发现hsa-miR-140-5p能够特异性影响SW2783病毒的感染,但对SW3861和CA09病毒的感染能力影响不大。因此,我们认为非编码miRNA—hsa-miR-140-5p可能作为潜在跨种属感染的流感病毒筛选的生物标记物或者新的药物靶点。结论:本研究用具有跨种属感染潜力的新现重配H3N2亚型SIV作为研究对象,围绕其跨种属感染过程中特异性差异表达的miRNA及相关miRNA-mRNA-蛋白质相互作用网络开展研究,获得如下发现:1.新现SW2783在体内外实验中均提示其具有跨种属感染的特征。2.通过miRNA-mRNA整合网络分析,筛选出3个非编码miRNA:hsa-miR-140-5p,hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-582-5p,它们在 SW2783 感染过程中呈现特异性的差异表达,推测可能与跨种属感染有密切关系。3.通过miRNA-mRNA-蛋白质整合网络分析,筛选出非编码miRNA:hsa-miR-140-5p与3个潜在的靶蛋白（ERVFRD-1,PPIA和IFIT2）可能存在调控关系,并有可能对有跨种属感染的毒株在A549细胞中的感染能力有影响。4.通过功能实验证实hsa-miR-140-5p能够对SW2783感染A549细胞有特殊调控作用,表现在其能影响病毒的复制,并影响其靶向的ERVFRD-1,PPIA和IFIT2的表达。综上,在SW2783感染A549细胞过程中,非编码miRNA—hsa-miR-140-5p发挥了特殊的调控病毒复制作用,可能作为筛选跨种属感染的新型流感病毒的潜在生物标志物,或者治疗的新型药物靶点。
张莉[4]（2019）在《寨卡病毒在云南的发生风险及树鼩动物模型的建立》文中进行了进一步梳理寨卡病毒（Zika Virus）是一种虫媒传播的病毒,现已在全球80多个国家和地区传播与流行。鉴于寨卡病毒传播媒介的广泛分布及感染导致小头症等严重神经系统疾病的发生,世界卫生组织宣布寨卡疫情为“国际关注的突发公共卫生事件”。云南省作为国家“一带一路”发展战略的重要枢纽地区,与缅甸、越南、老挝三国接壤,有众多的边境口岸及边民互市点,人员跨境交流频繁。同时,云南省也是多种传染性疾病传播、流行的高危地区,多种传染病呈现跨境传入、境内高发和病原多样性的典型特征。因此,云南省面临着ZIKV境外输入、本地流行的巨大风险,但目前尚无云南省ZIKV流行及传播影响因素的调查。与云南毗邻的南亚、东南亚地区一直是寨卡主要疫区,而在2016年1月我国在广州发现首例寨卡输入性病例之前,云南是否存在ZIKV病毒的输入性病例尚不清楚。本研究对2014年8月-2016年2月云南省各口岸不明原因发热的608份样本进行了ZIKV流行病学的回顾性分析。通过针对ZIKV核酸的定性定量检测发现了1例ZIKV输入性病例,在该病例是2014年从孟加拉国由昆明机场入境,并且患者发热明显。通过对该病患血液病毒核酸提取及PCR扩增获得了毒株的全基因组序列并命名为ZK-YN001。对此毒株的起源进化分析发现,ZK-YN001属亚洲株,起源时间约为2006年,进化速率为6.819（5.929-7.709）×10-4substitutions/site/year。与亚洲主要流行毒株的序列比对发现,ZK-YN001处于亚洲寨卡低流行阶段和高流行阶段的中间过渡态。ZK-YN001的发现修正了中国寨卡的流行病史。提示云南省面临着邻国输入ZIKV传染源的潜在风险。ZIKV的传播媒介-伊蚊在云南省分布广泛,而云南省全年平均温度18.8℃,平均相对湿度79.2%,月累计平均降水量104.3毫米,气候条件特别适宜伊蚊孳生繁殖,另结合蚊媒的分布密度及活跃程度,云南省每年的6-9月份是寨卡疫情的高危月份,应提前做好应对及防控措施。人感染ZIKV临床症状比较复杂,其发病机制尚不清楚,也无有效的疫苗和治疗药物。动物模型是研究病毒感染与发病机制,进行药物、疫苗研发的必要技术平台。自寨卡疫情爆发以来,世界各国研究人员应用小鼠、猴子等动物建立了各种寨卡热疾病实验模型,为阐明寨卡病毒致小头症/神经损伤的发病机制及候选疫苗药物临床前评价奠定了重要基础。然而,感染小鼠虽然出现神经疾病甚至死亡等症状,但与人感染症状差异过大;非人灵长类感染后未能重现人类感染后的主要临床症状,且研究成本高、周期长。因此,急需寻找一种可以模拟人类自然感染及感染后相关临床症状的理想动物模型。树鼩主要分布在以云南省为主的我国西南部地区,是一种易繁殖、易饲养的小型灵长类的哺乳动物。近年来,研究人员在人类疾病发生发展及人类病毒性感染的研究中广泛使用树鼩作为模型动物,并取得了一系列令人瞩目的研究成果,但目前尚无寨卡病毒感染树鼩的研究报道。为建立ZIKV感染树鼩动物模型,本研究模拟蚊虫叮咬进行皮下注射感染子一代成年树鼩,出现了与人感染类似临床症状:有典型的皮肤疾病皮疹发生,ZIKV的感染可造成皮肤的病理损伤及炎症细胞浸润,皮下有病毒颗粒存在及出血现象;出现病毒血症及唾液有规律的排毒;可建立涉及多个组织脏器的全身性感染,其中睾丸组织敏感最高且出现明显的病理损伤。进而,用ZIKV体外感染来源于树鼩不同组织的各种原代细胞,以确定病毒对不同原代细胞的嗜性及感染特征。经病毒核酸与抗原检测发现,血管及皮肤原代细胞对ZIKV最为敏感,病毒核酸及蛋白高效复制和表达,释放大量有感染活性的子代病毒;病毒感染造成细胞死亡等严重的细胞病变,从体外细胞水平支持了树鼩可以作为ZIKV的感染动物模型。最后,为探讨ZIKV感染树鼩后引发的免疫反应,对感染后树鼩的PBMC转录组测序发现,ZIKV的感染可刺激机体的多种抗病毒相关及炎症因子基因表达,呈不同程度的升高,其中表征皮肤疾病严重程度的S100A12基因在感染期间上调明显;ZIKV感染还激发了树鼩较强的体液免疫反应,感染后20dpi树鼩体内中和抗体滴度可达534.8,中和抗体对乳鼠具有保护作用并有效防止继发性感染。综上所述,本研究通过对云南省ZIKV的流行病学与环境因素分析,揭示云南面临着ZIKV输入及流行的潜在风险,为ZIKV的科学防控提供了研究依据。ZIKV体内感染树鼩疾病模型的建立及体外对原代细胞感染性与不同嗜性的确定,弥补了现有动物模型的不足。ZIKV感染树鼩刺激机体发生强烈的免疫反应,产生的中和抗体具有较强的保护作用,为研究ZIKV的抗原靶点及药物治疗提供新思路。
朱方冰[5]（2016）在《基于Huh7.5细胞模型研究中草药成分A对丙型肝炎病毒（HCV）的抗病毒活性》文中进行了进一步梳理丙型肝炎是一种持续性感染的世界性医学问题,丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）是其致病病毒。临床方面,目前丙型肝炎尚未有有效疫苗面市,进行免疫预防,目前治疗的基础方案是联合应用聚乙二醇化干扰素α与利巴韦林,但基因型的多样性导致了标准治疗效果并不显着。中药、天然药物在传染性疾病的治疗方面拥有渊源的历史,部分天然活性药物在慢性丙型肝炎的治疗方面发挥了重要的作用。本课题以此为出发点构思,通过建立一种体外抗HCV病毒的细胞筛选模型用于评价潜在抗HCV病毒化合物的生物活性。以此为基础采用高通量筛选的方法从天然中草药化合物库中获到一种可显着抑制HCV病毒活性的化合物A,通过量效关系的考察确定化合物A的IC50为6.34μM,同时通过观察报告基因EGFP的荧光强度,证实了随着化合物A浓度的升高,病毒感染的阳性率有明显下降;通过实验验证在效应浓度范围内化合物A对细胞的无毒性作用,初步证实了该化合物的安全性。在此基础上,通过对HCV非结构蛋白NS3蛋白的抑制率的检测,初步验证了化合物A可能是通过抑制NS3蛋白的丝氨酸蛋白酶及解旋酶活性,抑制其参与病毒蛋白翻译后加工的机制,从而阻碍了丙型肝炎病毒的复制,在细胞水平上初步阐明了化合物A抑制HCV活性的作用机理。综上所述,本研究建立了一种高效的抗HCV化合物筛选平台,并筛选获得一种安全有效的抗病毒药物化合物A,在细胞水平上初步阐明了其对HCV病毒的抑制作用及作用机理,在探寻控制HCV病毒传播及在丙肝慢性疾病的预防和治疗方法的研究方面有着重要意义。
尹丹[6]（2015）在《田七总皂苷对猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）感染免疫细胞诱发氧化应激的影响》文中研究表明田七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）是田七的主要有效成分,已证实具有免疫调节和清除自由基等药理活性。猪圆环病毒2型（PCV2）感染损伤免疫细胞,诱发动物机体免疫抑制,给畜牧业造成严重的经济损失。免疫细胞作为机体免疫体系的重要防线,其氧化还原状态及组蛋白乙酰化状态直接影响机体对免疫反应的调控。本研究通过探讨田七总皂苷对PCV2感染诱发体外、体内免疫细胞氧化应激及组蛋白乙酰化修饰的调节作用,旨在为田七总皂苷的开发利用及PCV2感染相关性疾病的防控提供理论依据。方法:（1）采用70%乙醇回流提取,并经D-101大孔吸附树脂纯化田七总皂苷,紫外分光光度法测定总皂苷纯度;（2）用PCV2病毒体外感染RAW264.7细胞、3D4/2细胞、猪脾淋巴细胞,采用PCR方法检测上述细胞内的PCV2核酸,建立PCV2感染细胞模型;（3）将100、10-1、10-2、10-3、10-4 的 PCV2 细胞毒（104TCID50/0.1 mL）体外孵育感染 RAW264.7 细胞、3D4/2细胞、猪脾淋巴细胞,感染后4h、8h、12h、24h、48h时,通过MTT法检测细胞活性、Griess法检测NO水平、DCFH-DA荧光法检测ROS水平、OPT荧光法检测GSH和GSSG水平,化学发光法检测XOD、MPO、iNOS酶活性,探讨PCV2病毒浓度、感染时间对三种免疫细胞活性氧水平及相关酶活性的影响,建立免疫细胞氧化胁迫体外模型;（4）将浓度为50 μg/mL、100μg/mL、200 μg/mL的田七总皂苷（PNS）分别作用于10-1 PCV2细胞毒感染的RAW264.7细胞、3D4/2细胞、猪脾淋巴细胞,同时设抗氧化剂维生素C对照药物组,测定细胞活性,NO、ROS、GSH/GSSG水平,XOD、MPO、iNOS酶活性,探讨田七总皂苷对PCV2感染免疫细胞诱发氧化应激的干预作用;（5）将浓度为200 μg/mL田七总皂苷作用于10-1 PCV2细胞毒感染的RAW264.7细胞、3D4/2细胞、猪脾淋巴细胞中培养12h,检测免疫细胞内组蛋白H3、H4乙酰化水平,组蛋白乙酰化酶（HAT）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）水平,及细胞内H202含量、抗O2·-活性和抑制·OH能力,探讨PCV2对免疫细胞组蛋白乙酰化修饰的影响及田七总皂苷的干预作用;（6）用不同的病毒浓度和感染时间给予昆明系小鼠感染PCV2病毒悬液,采用PCR方法检测感染小鼠组织器官中的病毒核酸,筛选最佳病毒感染剂量以及感染时间,建立PCV2实验性感染昆明小鼠模型;（7）以昆明系小鼠为研究对象,采用腹腔注射、滴鼻和口服三种途径联合方式于第1d、2d、3d给予小鼠感染100 PCV2病毒悬液,分别于感染后7 d、14 d、21 d分离小鼠脾淋巴细胞,测定ROS水平、T-GSH、GSH、GSSG水平及XOD、MPO、iNOS活性,探讨PCV2感染时间与活性氧水平变化的关系,建立PCV2感染诱发免疫细胞氧化胁迫体内模型;（8）小鼠接种PCV2病毒后,分别于接种后第4 d、5 d、6 d给予感染小鼠腹腔注射剂量为200 mg/kg.BW、100 mg/kg.BW和50 mg/kg.BW的PNS,同时设100 mg/kg.BW的抗氧化剂维生素C的对照药物组。第7d剖杀小鼠,测定免疫器官指数、小鼠脾淋巴细胞 ROS 水平、脾脏 T-GSH、GSH、GSSG 含量及 XOD、MPO、iNOS 活性;并检测免疫细胞内组蛋白H3、H4乙酰化水平,组蛋白乙酰化酶（HAT）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）水平,结合小鼠脾脏H2O2含量、抗O2·-活性和抑制·OH能力,探讨PCV2病毒感染小鼠对体内免疫细胞氧化应激及组蛋白乙酰化修饰的影响及田七总皂苷的干预作用。结果:（1）经70%乙醇回流提取和D-101大孔吸附树脂纯化田七总皂苷得率为7.5%,纯度为64.42%;（2）10-1PCV2体外感染RAW264.7细胞、3D4/2细胞和猪脾淋巴细胞可显着升高感染细胞iNOS活性以催化增加NO水平,显着升高感染细胞XOD、MPO活性和ROS水平,降低GSH含量、升高GSSG含量进而降低GSH/GSSG 比值,结果表明已建立PCV2体外感染免疫细胞的氧化胁迫模型,且10-1 PCV2体外感染12 h为氧化胁迫最佳条件,建立了 PCV2体外感染免疫细胞氧化胁迫模型;（3）感染PCV2的RAW264.7细胞、3D4/2细胞和猪脾淋巴细胞中加入不同浓度田七总皂苷处理后,细胞内的ROS、GSSG、NO水平和细胞XOD、MPO、iNOS活性显着降低,GSH水平和GSH/GSSG比值显着升高;田七并显着上调细胞抑制·OH能力和抗O2·-能力,表明田七总皂苷增强了免疫细胞抗氧化能力,进而提高了 PCV2体外感染的免疫细胞活性,且200 μg/mL的田七总皂苷处理12h时能更有效地干预PCV2体外感染诱发三种免疫细胞的氧化应激;（4）PCV2体外感染RAW264.7细胞通过显着升高HAT水平、降低HDAC水平,进而上调组蛋白H3乙酰化水平;田七总皂苷通过显着升高感染细胞HDAC水平,下调了 RAW264.7细胞组蛋白H3乙酰化水平。PCV2体外感染3D4/2细胞通过升高HAT水平、降低HDAC水平,进而增加了细胞组蛋白H4乙酰化水平;田七总皂苷通过升高感染细胞HDAC水平,下调了 3D4/2细胞组蛋白H4乙酰化水平。PCV2体外感染猪脾淋巴细胞显着升高细胞HAT水平,进而上调细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平;田七总皂苷通过降低感染细胞HAT水平、升高感染细胞HDAC水平,显着下调了猪脾淋巴细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平;（5）PCV2感染小鼠后能显着升高小鼠脾淋巴细胞ROS水平、上调XOD、MPO、iNOS活性,降低GSH和T-GSH水平,以改变感染小鼠脾脏氧化还原状态。且用100 PCV2感染7 d是建立小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的最佳条件;（6）田七总皂苷作用于PCV2感染的小鼠,能显着降低感染小鼠脾淋巴细胞ROS水平、降低GSSG含量和XOD、MPO、iNOS活性,升高感染小鼠脾脏GSH水平和T-GSH水平,提高脾脏抑制·OH能力和抗O2·-能力,从而改善小鼠脾淋巴细胞氧化还原状态,提高脾脏抗氧化能力,提示田七总皂苷能有效调节PCV2感染小鼠诱发体内免疫细胞氧化应激,且浓度为200 mg/kg.BW的田七总皂苷效果最佳。（7）PCV2病毒感染小鼠后,小鼠脾脏HAT水平显着升高,HDAC水平显着降低,进而上调感染小鼠脾脏H3乙酰化水平;腹腔注射田七总皂苷后通过降低感染小鼠脾脏HAT水平、升高感染细胞HDAC水平,下调了感染小鼠脾脏组蛋白H3乙酰化水平。结论:（1）PCV2体外感染RAW264.7细胞、3D4/2细胞和猪脾淋巴细胞能诱发三种免疫细胞产生氧化应激,诱导处于氧化胁迫状态的免疫细胞组蛋白乙酰化水平升高;田七总皂苷能有效干预PCV2体外感染诱发免疫细胞的氧化应激,并下调处于氧化胁迫状态的免疫细胞组蛋白乙酰化水平。（2）PCV2感染昆明系小鼠能诱发小鼠体内脾淋巴细胞产生氧化应激,诱导处于氧化胁迫状态的脾淋巴细胞组蛋白乙酰化水平升高;田七总皂苷能有效干预PCV2感染小鼠诱发脾淋巴细胞的氧化应激,并下调处于氧化胁迫状态的脾淋巴细胞组蛋白乙酰化水平。表明PCV2感染免疫细胞诱发的氧化应激与细胞组蛋白乙酰化修饰之间有着紧密的联系,田七总皂苷能有效干预PCV2感染免疫细胞诱发的氧化应激及组蛋白乙酰化修饰的改变。
殷安国[7]（2014）在《HCV对幼龄树鼩感染实验研究》文中认为丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）是一种在世界范围内引起慢性肝炎的病毒。HCV属于黄病毒科肝炎病毒属。它是长约9.6kb的单股正链RNA病毒,直径40-50nm,主要在肝细胞内复制。人类是HCV的天然宿主,黑猩猩是HCV的敏感动物。可以引起慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化甚至肝癌。树鼩（Tupaiabelangeri）,是一种只生活在亚洲东南地区的非灵长类哺乳动物。它可以感染许多人源性的病毒,例如乙型肝炎病毒HBV,对HCV也表现出易感性。有文献指出,接种HCV的树鼩虽然不像人和黑猩猩那样具有持续高滴度的病毒血症,但大约1/3的树鼩出现了一过性感染,除了用树鼩作为病毒的体内感染动物模型的尝试,还有以树鼩肝细胞为基础的体外感染模型研究。这些证据强烈的说明树鼩具有成为HCV感染动物模型。而采用小树鼩作为HCV感染动物模型还未有人尝试。本文章旨在研究小树鼩感染HCV时动物的部分感染特性。本论文采用5周龄大小的幼龄树鼩,采用肝门静脉注射的方法,向肝脏注射1mL载量为1.3×107copies/mL的J6/JFH-1型HCV病毒上清液,在攻毒后第三天开始抽血,每次抽0.6mL的非抗凝血及50μ1的抗凝血,连续3个月,50μ1的抗凝血用于血常规检测,对实验树鼩的血清提取RNA后运用巢式PCR技术可检测到阳性条带,对阳性条带进行胶回收测序,在NCBI上BLAST比对后与HCVJ6/JFH1-QC69（NS4A）（KF693783.1）相似度99%,所得到的阳性条带的确为HCV病毒片段,第三天阳性率为70.0%,第五周为100%,第六周为88.9%,运用Taqman探针实时荧光定量PCR法对RNA定量发现攻毒后第三天和第五周病毒载量最高,分别为6.07×103copies/mL,2.04×103copies/mL。病理组织检查发现树鼩肝脏汇管区出现可见灶状淋巴细胞浸润,免疫组化染色显示有HCV抗原表达。表明幼龄树鼩具有较高的HCV阳性感染率,部分幼龄树鼩感染HCV后可形成慢性HCV感染。
匡德宣,江勤芳,孙晓梅,仝品芬,高家红,陆彩霞,代解杰[8]（2013）在《树鼩应用于丙型肝炎病毒相关领域的研究进展》文中研究指明丙型肝炎病毒慢性感染已成为世界范围的公共健康问题,由于缺少合适的丙型肝炎病毒研究模型,所以对丙肝病毒感染机制、生活周期和致病机制的研究进展较为缓慢。树鼩属于低等的灵长类动物,许多生物学特性近似于人类。近年来引起医学生物界和相关管理部门的重视和关注,国内外的学者在树鼩是否可作为丙型肝炎病毒感染的动物模型方面作过十分有益的尝试。本文介绍了国内外树鼩应用于丙型肝炎病毒模型研究的进展情况及应用前景。
高禄化,聂青和[9]（2011）在《人滋养层细胞培养上清液及裂解液中丙型肝炎病毒的检测》文中研究指明目的应用改良的分离、纯化方法对孕早期人绒毛滋养细胞进行原代培养,利用HCV阳性血清对滋养细胞进行体外感染,探讨HCV在体外培养条件下对细胞的感染及HCV在细胞中的复制状态。方法采用胰蛋白酶消化法消化正常人妊娠孕早期胎盘组织,以35%、45%2个Percoll密度梯度进行分离纯化、并免疫组化鉴定,获得纯度较高的滋养层细胞,应用HCV阳性且高载量的血清进行体外感染,应用免疫荧光染色检测滋养层细胞中HCV NS5表达,通过细胞裂解液裂解感染后细胞,应用荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测感染后细胞培养上清和细胞内的HCV RNA,以观察HCV的感染及复制情况。结果该法分离纯化的滋养层细胞生长良好,特异性角蛋白-7阳性,纯度高。原代滋养层细胞在与HCV阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变,感染后48 h在滋养层细胞细胞浆中可见HCV NS5表达,感染后分别于24、48、72、96、120 h收集的培养上清和感染后细胞内均可以检测到HCV RNA。排除了培养洗涤液HCV污染,进一步检测其细胞裂解液中HCV,结果检测HCV阳性。结论利用改良后人胎盘滋养层细胞的体外培养系统,HCV阳性血清能在体外感染原代培养的人滋养层细胞,HCV可在滋养层细胞中复制。
白继丽[10]（2009）在《树鼩（Tupaia belangeri）血液生化学指标测定分析及HCV感染树鼩初步研究》文中研究表明树鼩（Tupaia belangeri）在医学生物学领域被广泛应用,但目前仍未实现其大量繁殖,国内外实验用树鼩仍然主要取自野外,树鼩实验前的很多背景都不清楚（如年龄、遗传学、寄生虫学、及自身携带疾病情况等）,这样就无法保证实验数据的可靠性,实现其实验动物标准化是攻克上述问题的关键,建立树鼩的血液生化指标的正常参考值是其标准化建设的重要内容之一,本文建立人工饲养树鼩的血液生化指标的正常值范围,用于筛选合格实验动物和为诊断树鼩疾病提供依据,树鼩是研究人类疾病良好的替代者,本文为建立一种更有效、更稳定的树鼩丙肝模型进行一些有意义也有挑战的尝试。第一部分目的建立树鼩血液学和血液生化指标的正常值参考范围。方法:应用全自动血细胞仪和生化分析仪测定140只健康成年树鼩的血液学及血液生化指标。结果:雌性与雄性比较,LYM%、PLT、RDW%、GLU、CREA的差异具有显着性（P＜0.05）,TP、CHOL、TG的差异具有极显着性（P＜0.01）,其他指标的差异不具显着性。结论:本文建立了健康树鼩的血液学及生化指标的正常值参考范围,可为应用该动物进行科学研究时提供参考。第二部分目的探讨树鼩感染重组丙型肝炎病毒的可能性。方法本实验设立重组HCV病毒组（A组）、人阳性血清组（B组）、空白对照组（C组）,通过巢式PCR法检测感染树鼩血浆的HCVRNA,检测树鼩血浆ALT。结果A组树鼩中5只树鼩在接种病毒后,血浆（分别在接种后第8天和第15天）中检测出HCVRNA,A组所有树鼩在接种病毒后均表现出ALT异常地升高,多数在第29天时达到峰值,B组树鼩中多数树鼩ALT出现异常升高,但未检测出HCVRNA。结论树鼩可以感染重组HCV,但只出现过一过性病毒血症,可能原因是HCV毒株的感染率及标准化、树鼩的个体差异及标准化等问题所致,树鼩能否替代黑猩猩成为HCV动物模型有待进一步深入研究。
二、初步探讨丙型肝炎病毒体外感染的致病机理（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、初步探讨丙型肝炎病毒体外感染的致病机理（论文提纲范文）
（1）新城疫病毒感染诱导宿主细胞氨基酸代谢重编程的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 新城疫病毒简介 |
| 1.2 病毒操控宿主代谢网络 |
| 1.2.1 碳水化合物代谢 |
| 1.2.2 脂质代谢 |
| 1.2.3 核苷酸代谢 |
| 1.2.4 氨基酸代谢 |
| 1.3 氨基酸转运体 |
| 1.3.1 AAT家族的功能 |
| 1.3.2 溶质载体超家族(Solute carrier family,SLC) |
| 1.3.3 ATT能量耦合机制的多样性 |
| 1.3.4 高亲和力谷氨酸和中性氨基酸SLC1转运体家族 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 新城疫病毒体内与体外感染的代谢组学研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 细胞和病毒 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器以及缓冲液配制 |
| 2.1.3 Western-blot检测病毒感染情况 |
| 2.1.4 动物试验 |
| 2.1.5 代谢物的提取与检测 |
| 2.1.6 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NDV在DF-1细胞中的复制 |
| 2.2.2 多元变量分析 |
| 2.2.3 差异代谢物筛选 |
| 2.2.4 差异代谢物代谢通路分析 |
| 2.2.5 Herts/33感染鸡肺脏后引起的代谢变化 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 新城疫病毒和宿主细胞氨基酸靶向代谢组学分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞和病毒 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 感染细胞靶向氨基酸代谢组学分析 |
| 3.1.4 细胞氨基酸谱分析检测 |
| 3.1.5 NDV氨基酸谱分析检测 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 NDV感染DF-1细胞氨基酸代谢多维统计分析 |
| 3.2.2 NDV感染DF-1细胞氨基酸代谢差异代谢物筛选 |
| 3.2.3 NDV感染DF-1细胞氨基酸代谢代谢通路分析 |
| 3.2.4 NDV感染A549细胞氨基酸代谢分析 |
| 3.2.5 DF-1细胞和A549细胞氨基酸谱分析 |
| 3.2.6 NDV氨基酸谱分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 SLC1A3在新城疫病毒复制中的作用 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 细胞和病毒 |
| 4.1.2 主要缓冲液配制 |
| 4.1.3 主要试剂与仪器 |
| 4.1.4 NDV感染后细胞总RNA提取和cDNA合成 |
| 4.1.5 实时荧光定量PCR |
| 4.1.6 Western-blot检测 |
| 4.1.7 质粒构建 |
| 4.1.8 质粒和siRNA细胞转染 |
| 4.1.9 SLC1A3 Knock-down稳定细胞系的构建 |
| 4.1.10 细胞增殖活性检测 |
| 4.1.11 NDV在A549细胞上的增殖曲线测定 |
| 4.1.12 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 NDV感染A549 细胞后氨基酸转运体mRNA水平显着上调 |
| 4.2.2 NDV感染A549 细胞后SLC1A3 mRNA水平显着上调 |
| 4.2.3 NDV感染不同细胞系后SLC1A3 mRNA水平显着上调 |
| 4.2.4 NDV感染细胞后SLC1A3 蛋白表达水平显着上调 |
| 4.2.5 SLC1A3 参与NDV的复制 |
| 4.2.6 敲低SLC1A3 后阻碍NDV的复制 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 新城疫病毒感染对谷氨酰胺代谢的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 细胞和病毒 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.1.3 实时荧光定量PCR |
| 5.1.4 GOT1/GPT酶活性检测 |
| 5.1.5 Western-blot检测 |
| 5.1.6 siRNA细胞转染 |
| 5.1.7 不同成分培养基的配制 |
| 5.1.8 Puromycin标记检测蛋白翻译效率 |
| 5.1.9 稳定同位素标记 |
| 5.1.10 数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 不同培养基条件下NDV的复制水平检测 |
| 5.2.2 不同培养基条件下对蛋白翻译效率的影响 |
| 5.2.3 NDV复制对谷氨酰胺具有剂量依赖性 |
| 5.2.4 NDV感染对谷氨酰胺转运体mRNA水平的影响 |
| 5.2.5 NDV感染对谷氨酰胺代谢相关酶mRNA水平的影响 |
| 5.2.6 氨基转移酶GOT1和GPT参与NDV的复制 |
| 5.2.7 NDV感染导致谷氨酰胺分解代谢增强 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 SLC1A3在新城疫病毒复制中的功能研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 细胞和病毒 |
| 6.1.2 主要试剂与仪器 |
| 6.1.3 间接免疫荧光试验 |
| 6.1.4 膜蛋白的提取 |
| 6.1.5 线粒体的分离 |
| 6.1.6 溶酶体的提取 |
| 6.1.7 药物抑制试验 |
| 6.1.8 稳定同位素标记 |
| 6.1.9 Western-blot检测 |
| 6.1.10 q-PCR检测 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 SLC1A3的亚细胞定位分析 |
| 6.2.2 NDV可通过激活p53和NF-κB通路上调SLC1A3的表达 |
| 6.2.3 SLC1A3有助于谷氨酸的生成和维持TCA循环 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 丙型肝炎病毒的流行病学 |
| 1.2 丙型肝炎病毒的基因型分布 |
| 1.3 丙型肝炎病毒的分子病毒学 |
| 1.3.1 丙型肝炎病毒的基因组结构 |
| 1.3.2 丙型肝炎病毒的生活周期 |
| 1.4 丙型肝炎病毒的研究模型 |
| 1.4.1 丙型肝炎病毒的假病毒模型 |
| 1.4.2 丙型肝炎病毒的亚基因组复制子模型 |
| 1.4.3 丙型肝炎病毒的细胞感染模型 |
| 1.4.4 丙型肝炎病毒的动物模型 |
| 1.5 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的发展 |
| 1.5.1 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的分类 |
| 1.5.2 直接抗病毒药物相关的耐药突变的总结 |
| 1.6 本课题研究背景 |
| 1.7 本课题研究目标 |
| 第二章 实验材料与试验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 蛋白抗体 |
| 2.3 HCV直接抗病毒药物 |
| 2.4 病人血清的来源及RNA的抽提 |
| 2.5 多规格孔板的细胞实验 |
| 2.6 复制子单克隆的分离 |
| 2.7 PCR体系 |
| 2.8 质粒回收与琼脂糖电泳产物回收 |
| 2.9 大肠杆菌感受态DH5α的制备与转化 |
| 2.10 酿酒酵母感受态W303 的制备与转化 |
| 2.11 质粒构建 |
| 2.12 TA平末端克隆与限制性内切酶 |
| 2.13 RNA抽提与反转录 |
| 2.14 HCV RNA的体外转录与转染 |
| 2.15 直接抗病毒药物敏感性的测试 |
| 2.16 免疫荧光 |
| 2.17 免疫印迹 |
| 2.18 HCV序列的生物信息学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 丙型肝炎病毒亚基因组复制子新型构建方法的建立 |
| 3.1.1 丙型肝炎病毒复制子cDNA文库的构建 |
| 3.1.2 丙型肝炎病毒复制子细胞的建立 |
| 3.1.3 基因1b型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.1.4 基因3a型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.1.5 基因6a型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.2 基因3a型丙型肝炎病毒亚基因组复制子耐药相关的研究 |
| 3.2.1 基因3a型复制子对直接抗病毒药物的敏感性研究 |
| 3.2.2 基因3a型复制子对NS3 抑制剂耐药机制的研究 |
| 3.2.3 基因3a型复制子NS3 抑制剂耐药位点D168Q稳定存在的机制研究 |
| 3.3 基因6a型丙型肝炎病毒对索磷布韦耐药机制的研究 |
| 3.3.1 基因6a型复制子索磷布韦耐药性的诱导 |
| 3.3.2 基因6a型复制子耐药型细胞克隆的特点分析 |
| 3.3.3 基因6a型丙型肝炎病毒索磷布韦耐药位点的鉴定研究 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 作者简历 |
| 专业综述 |
| 参考文献 |
（3）新现H3N2亚型SIV跨种属感染特征及特殊miRNA-mRNA-蛋白质整合研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 主要英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 新现H3N2亚型SIV跨种属感染特征研究 |
| 研究背景 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 新现H3N2亚型SIV跨种属感染miRNA-mRNA的交联分析研究 |
| 研究背景 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 新现H3N2亚型SIV跨种属感染miRNA蛋白质交联分析研究 |
| 研究背景 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 新现H3N2亚型SIV跨种属感染miRNA的功能验证研究 |
| 研究背景 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 全文总结 |
| 不足与展望 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 资助项目 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（4）寨卡病毒在云南的发生风险及树鼩动物模型的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 寨卡病毒(ZIKV)流行与危害 |
| 1.2 ZIKV的病原学 |
| 1.2.1 传染源 |
| 1.2.2 传播媒介 |
| 1.2.3 传播途径 |
| 1.2.4 易感人群 |
| 1.2.5 临床症状 |
| 1.2.6 ZIKV的诊断与治疗 |
| 1.2.7 ZIKV的预防 |
| 1.3 ZIKV传播的环境影响因素 |
| 1.3.1 自然因素 |
| 1.3.2 地理分布 |
| 1.3.3 社会因素 |
| 1.4 ZIKV的流行病学 |
| 1.4.1 ZIKV的基因组结构 |
| 1.4.2 ZIKV的复制周期 |
| 1.4.3 ZIKV的主要病毒株 |
| 1.5 ZIKV感染动物模型的研究现状 |
| 1.5.1 免疫健全小鼠模型 |
| 1.5.2 免疫缺陷小鼠模型 |
| 1.5.3 孕胎鼠模型 |
| 1.5.4 性传播小鼠模型 |
| 1.5.5 非人灵长类模型 |
| 1.6 树鼩动物模型的应用现状 |
| 1.6.1 树鼩在人类疾病模型上的应用 |
| 1.6.2 树鼩在病毒感染模型上的应用 |
| 1.7 本研究的目的意义和技术路线 |
| 1.7.1 研究的目的和意义 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 云南省寨卡疫情回顾性分析及流行的环境影响因素 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 样本和资料来源 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 不明原因发热样本ZIKV回顾性分析结果 |
| 2.3.2 ZIKV感染者人口学特征 |
| 2.3.3 ZIKV阳性样本全长扩增及病毒分离 |
| 2.3.4 ZK-YN001 同源关系及起源进化分析 |
| 2.3.5 云南ZIKV传播的影响因素 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 ZIKV在云南的流行病学调查 |
| 2.4.2 ZIKV在云南地区传播的影响因素 |
| 2.4.3 ZIKV在云南的防控 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ZIKV感染树鼩动物模型的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.5 ZIKV感染树鼩实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 GZ01 病毒株的培养及检测 |
| 3.3.2 ZIKV感染树鼩的结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 ZIKV感染树鼩的症状表现 |
| 3.4.2 ZIKV感染树鼩的体液排毒 |
| 3.4.3 ZIKV感染树鼩的组织分布 |
| 3.4.4 ZIKV对乳树鼩的神经毒力 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ZIKV对树鼩原代细胞感染特性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验主要试剂和配方 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 数据处理 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ZIKV对树鼩不同组织原代细胞的易感性 |
| 4.4.2 ZIKV感染树鼩的原代皮肤和血管细胞的荧光检测 |
| 4.4.3 ZIKV感染树鼩的原代皮肤和血管细胞的WB检测 |
| 4.4.4 ZIKV感染树鼩的原代皮肤和血管细胞的增殖动力学检测 |
| 4.4.5 ZIKV感染树鼩的原代皮肤和血管细胞的子代病毒的活性检测 |
| 4.4.6 ZIKV感染树鼩的原代皮肤和血管细胞的细胞病变 |
| 4.4.7 树鼩原代皮肤和血管细胞的鉴定 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 ZIKV感染树鼩的免疫反应 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 ZIKV感染树鼩后机体的先天抗病毒免疫反应 |
| 5.3.2 ZIKV感染树鼩原代细胞后细胞因子的变化 |
| 5.3.3 ZIKV感染树鼩后的体液免疫反应 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 ZIKV感染树鼩的天然免疫反应 |
| 5.4.2 ZIKV感染树鼩的体液免疫反应 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 其他需要说明的内容 |
（5）基于Huh7.5细胞模型研究中草药成分A对丙型肝炎病毒（HCV）的抗病毒活性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 丙型肝炎病毒 |
| 1.1 丙型肝炎病毒简介 |
| 1.2 丙型肝炎病毒的复制周期 |
| 1.3 丙型肝炎 |
| 2 丙型肝炎治疗现状及治疗难点 |
| 2.1 丙型肝炎治疗现状 |
| 2.2 丙型肝炎治疗的难点 |
| 2.3 丙型肝炎的小分子化药治疗 |
| 2.4 丙型肝炎的中药、天然药物治疗 |
| 第二章 抗HCV化合物筛选方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 本章小结 |
| 4 本章讨论 |
| 第三章 抗HCV化合物的高通量筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 确认Z-FACTOR |
| 2.2 抗HCV化合物高通量筛选 |
| 3 本章小结 |
| 4 本章讨论 |
| 第四章 化合物A对抗HCV作用机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 COMPOUND A对 HCV病毒抑制作用的验证 |
| 2.2 COMPOUND A对抗HCV机制研究 |
| 2.3 COMPOUND A初步细胞安全性评价 |
| 3 本章小结 |
| 4 本章讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）田七总皂苷对猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）感染免疫细胞诱发氧化应激的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 部分缩写的中英文对照 |
| 第一部分 综述 |
| 1 田七总皂苷生物活性研究概述 |
| 2 猪圆环病毒的研究概述 |
| 2.1 PCV的病原学及理化特征 |
| 2.2 发现历史及发病情况 |
| 2.3 传播途径及PCV2相关疾病 |
| 2.4 PCV2感染与免疫抑制 |
| 2.5 PCV2实验感染小鼠模型 |
| 3 氧化应激 |
| 3.1 自由基种类 |
| 3.2 氧化应激模型 |
| 3.3 病毒感染与氧化应激 |
| 3.4 病毒感染、氧化应激与组蛋白乙酰化修饰 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 田七总皂苷的分离提取及含量测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 试剂的配制 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 田七总皂苷的分离提取 |
| 2 结果 |
| 2.1 标准曲线 |
| 2.2 样品中总皂苷含量 |
| 3 讨论 |
| 第二章 PCV2体外诱导三种免疫细胞氧化胁迫模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2感染细胞及增殖测定结果 |
| 3.2 PCV2体外感染RAW264.7细胞氧化胁迫模型的建立 |
| 3.3 PCV2体外感染3D4/2细胞氧化胁迫模型的建立 |
| 3.4 PCV2体外感染猪原代脾淋巴细胞氧化胁迫模型的建立 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCV2感染能诱发RAW264.7细胞氧化应激 |
| 4.2 PCV2感染能诱发3D4/2细胞氧化应激 |
| 4.3 PCV2感染能诱发猪脾淋巴细胞氧化应激 |
| 第三章 田七总皂苷对PCV2体外诱导三种免疫细胞氧化应激的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 田七总皂苷对PCV2体外诱导RAW264.7细胞氧化应激的影响 |
| 3.2 田七总皂苷对PCV2体外诱导3D4/2细胞氧化应激的影响 |
| 3.3 田七总皂苷对PCV2体外诱导猪脾淋巴细胞氧化应激的影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 田七总皂苷对PCV2体外诱导三种免疫细胞组蛋白乙酰化修饰的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 田七总皂苷对PCV2感染RAW264.7细胞抗氧化能力的影响 |
| 3.2 田七总皂苷对PCV2感染RAW264.7细胞组蛋白乙酰化相关酶的影响 |
| 3.3 田七总皂苷对PCV2感染RAW264.7细胞组蛋白乙酰化水平的影响 |
| 3.4 田七总皂苷对PCV2感染3D4/2细胞抗氧化能力的影响 |
| 3.5 田七总皂苷对PCV2感染3D4/2细胞乙酰化相关酶水平的影响 |
| 3.6 田七总皂苷对PCV2感染3D4/2细胞组蛋白乙酰化水平的影响 |
| 3.7 田七总皂苷对PCV2感染猪脾淋巴细胞抗氧化能力的影响 |
| 3.8 田七总皂苷对PCV2感染猪脾淋巴细胞乙酰化相关酶水平的影响 |
| 3.9 田七总皂苷对PCV2感染猪脾淋巴细胞组蛋白乙酰化水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 第五章 PCV2诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2实验感染小鼠模型的感染方案确定 |
| 3.2 PCV2感染对小鼠脾淋巴细胞ROS产生的影响 |
| 3.3 PCV2感染对小鼠脾脏氧化还原状态的影响 |
| 3.4 PCV2感染对小鼠脾脏XOD、MPO、iNOS活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 第六章 田七总皂苷对PCV2诱导小鼠体内免疫细胞氧化应激的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 田七总皂苷对PCV2感染小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响 |
| 3.2 田七总皂苷对PCV2感染小鼠体内脾淋巴细胞产生ROS的影响 |
| 3.3 田七总皂苷对PCV2感染小鼠脾脏GSH、GSSG、T-GSH水平的影响 |
| 3.4 田七总皂苷对PCV2感染小鼠脾脏XOD、MPO、iNOS活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 第七章 田七总皂苷对PCV2诱导小鼠体内免疫细胞组蛋白乙酰化修饰的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 田七总皂苷对PCV2感染小鼠脾脏抗抗氧化能力的影响 |
| 3.2 田七总皂苷对PCV2感染小鼠脾脏乙酰化相关酶水平的影响 |
| 3.3 田七总皂苷对PCV2感染小鼠脾脏组蛋白乙酰化水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）HCV对幼龄树鼩感染实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 插图和附表清单 |
| 英文缩写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙型肝炎与丙型肝炎病毒 |
| 1.1.1 丙型肝炎 |
| 1.1.2 丙型肝炎病毒 |
| 1.2 丙型肝炎病毒基因组序列变异 |
| 1.2.1 HCV基因组变异的高度异质性 |
| 1.2.2 HCV基因组变异的非均一性 |
| 1.3 丙型肝炎病毒的感染与复制机制 |
| 1.3.1 CD81受体 |
| 1.3.2 SR-BⅠ受体 |
| 1.3.3 Claudin-1受体 |
| 1.3.4 Occludin受体 |
| 1.3.5 LDLR受体 |
| 1.4 丙型肝炎发病机制及免疫应答 |
| 1.4.1 丙型肝炎病毒的直接致病作用 |
| 1.4.2 丙型肝炎病毒的免疫损伤机制 |
| 1.4.3 丙型肝炎病毒感染慢性化机制 |
| 1.5 慢性丙型肝炎的抗病毒治疗 |
| 1.5.1 干扰素(IFN) |
| 1.5.2 利巴韦林(Ribavirin) |
| 1.5.3 聚乙二醇化干扰素(PEG-IFN) |
| 1.6 丙型肝炎病毒细胞模型 |
| 1.6.1 原代细胞系 |
| 1.6.2 非原代细胞系 |
| 1.6.3 转染细胞系 |
| 1.7 丙型肝炎动物模型 |
| 1.7.1 黑猩猩(Chimpanzee) |
| 1.7.2 猴(Monkey) |
| 1.7.3 小鼠(Rat) |
| 1.7.4 树鼩(Tree shrew,Tupaia belangeri) |
| 1.8 树鼩模型在人类病毒性疾病研究中的应用 |
| 1.8.1 肝炎病毒 |
| 1.8.2 肠道病毒EV71(Human enterovirus 71,EV71) |
| 1.8.3 单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV) |
| 1.8.4 流感病毒(Influenza virus) |
| 1.8.5 轮状病毒(Rotavirus) |
| 1.8.6 基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV) |
| 1.8.7 腺病毒(Adenovirus,ADV) |
| 1.9 本研究的意义 |
| 第二章 H C V对幼龄树鼩的感染研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验药品与试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1. 攻毒 |
| 2.3.2 血液及样本采集 |
| 2.3.3. 血常规的检测 |
| 2.3.4 ALT的检测 |
| 2.3.5 HCV的定性 |
| 2.3.7 病理切片检查 |
| 2.3.8 免疫组化检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 血常规检查结果 |
| 2.4.2 ALT检测结果 |
| 2.4.3 HCV定性结果 |
| 2.4.4 HCV定量结果 |
| 2.4.5 病理切片的检查 |
| 2.4.6 免疫组化检测结果 |
| 第三章 讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
| 附录B 其他要说明的内容 |
| 附件 |
（8）树鼩应用于丙型肝炎病毒相关领域的研究进展（论文提纲范文）
| 1 丙肝病毒体内感染树鼩的研究 |
| 2 丙肝病毒体外感染树鼩原肝细胞的研究 |
| 3 树鼩HCV受体分子的研究 |
| 3.1 树鼩HCV的CD81受体 |
| 3.2 树鼩HCV的SR-BI受体 |
| 3.3 树鼩HCV的Claudin-1受体 |
| 3.4 树鼩HCV的Occludin受体 |
| 3.5 树鼩HCV的LDL受体 |
| 4 影响HCV感染树鼩的因素 |
| 5 树鼩应用于HCV研究的前景 |
（9）人滋养层细胞培养上清液及裂解液中丙型肝炎病毒的检测（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂 |
| 1.1.2 HCV阳性血清 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 人胎盘滋养层细胞的分离、纯化、鉴定与培养[10] |
| 1.2.2 倒置显微镜下观察 |
| 1.2.3 人绒毛膜滋养细胞的HE染色 |
| 1.2.4 人绒毛滋养层细胞的免疫组化染色 |
| 1.2.5 原代培养的滋养层细胞的HCV体外感染 |
| 1.2.6 滋养层细胞体外HCV感染后检测[11] |
| 1.2.7 荧光定量PCR检测感染细胞裂解液及培养上清中HCV RNA |
| 1.2.8 HCV感染细胞排除血清污染实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞形态学 |
| 2.2 HCV体外感染对滋养层细胞形态学和细胞生长的影响 |
| 2.3 HCV感染细胞排除污染检测结果 |
| 2.4 HCV感染滋养层细胞48 h后HCV NS5的表达情况 |
| 2.5 |
| 3 讨论 |
（10）树鼩（Tupaia belangeri）血液生化学指标测定分析及HCV感染树鼩初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一、树韵 |
| 二、丙型肝炎病毒 |
| 三、研究目的 |
| 实验研究 |
| 第一部分 树韵血液学及生化指标正常值测定及分析 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HCV感染树韵体内研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 二、结果与分析 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 附录 主要溶液的配制 |
| 致谢 |
| 研究生简历 |
四、初步探讨丙型肝炎病毒体外感染的致病机理（论文参考文献）
- [1]新城疫病毒感染诱导宿主细胞氨基酸代谢重编程的研究[D]. 刘盼娆. 中国农业科学院, 2020
- [2]丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究[D]. 郭明哲. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [3]新现H3N2亚型SIV跨种属感染特征及特殊miRNA-mRNA-蛋白质整合研究[D]. 高灵茜. 广西医科大学, 2019(08)
- [4]寨卡病毒在云南的发生风险及树鼩动物模型的建立[D]. 张莉. 昆明理工大学, 2019(06)
- [5]基于Huh7.5细胞模型研究中草药成分A对丙型肝炎病毒（HCV）的抗病毒活性[D]. 朱方冰. 上海交通大学, 2016(01)
- [6]田七总皂苷对猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）感染免疫细胞诱发氧化应激的影响[D]. 尹丹. 广西大学, 2015(05)
- [7]HCV对幼龄树鼩感染实验研究[D]. 殷安国. 昆明理工大学, 2014(01)
- [8]树鼩应用于丙型肝炎病毒相关领域的研究进展[J]. 匡德宣,江勤芳,孙晓梅,仝品芬,高家红,陆彩霞,代解杰. 实验动物科学, 2013(01)
- [9]人滋养层细胞培养上清液及裂解液中丙型肝炎病毒的检测[J]. 高禄化,聂青和. 临床肝胆病杂志, 2011(12)
- [10]树鼩（Tupaia belangeri）血液生化学指标测定分析及HCV感染树鼩初步研究[D]. 白继丽. 中国协和医科大学, 2009(S1)