一、The protection effectiveness of the expression of heat shock protein on ischemic brain damage(论文文献综述)
许雯珊,江萍利,刘雨露,丁妍怡,余燕,杨敏光,柳维林,陈立典[1](2022)在《丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析》文中研究表明背景:丹酚酸A对缺血性脑卒中后缺血侧海马区蛋白表达的影响及其作用机制尚未明确。目的:观察丹酚酸A对缺血性脑卒中大鼠海马区蛋白差异表达的影响,探讨其可能的神经保护机制。方法:采用改良Longa方法制备缺血性脑卒中大鼠模型,造模后随机分为生理盐水组与丹酚酸A组(n=6)。丹酚酸A组于线栓拔出后尾静脉注射2 mg/kg丹酚酸A;生理盐水组注射等体积的生理盐水。采用改良神经功能缺损评分标准评价大鼠神经功能;T2加权成像检测脑梗死体积;旷场实验及Morris水迷宫测试观察各组大鼠的自主行为、学习记忆能力;串联质谱标签定量蛋白组学技术分析缺血性脑卒中模型大鼠缺血侧海马区蛋白的差异表达。结果与结论:(1)与生理盐水组相比,丹酚酸A组大鼠改良神经功能缺损评分显着降低;(2)T2加权成像显示,丹酚酸A组较生理盐水组脑梗死体积明显减少;(3)旷场实验结果发现,丹酚酸A组大鼠自主活动及自由探索行为表现更佳;(4)Morris水迷宫测试结果表明,丹酚酸A组大鼠在定向航行实验中逃避潜伏期明显缩短、穿越平台次数相较于生理盐水组显着增加;(5)缺血侧海马区差异蛋白质分析结果发现,丹酚酸A组与生理盐水组之间筛选出50个上调及3个下调差异蛋白;基因本体论分析表明它们主要参与binding,catalytic activity等分子功能;京都基因和基因组百科全书信号通路分析显示,它们主要涉及Complement and coagulation cascades,Staphylococus aureus infection等信号通路;(6)结果显示,丹酚酸A可能通过调控缺血性脑卒中大鼠缺血侧海马区差异蛋白、补体及凝血级联信号通路,对缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用。
蒋怡冰[2](2021)在《血浆外泌体作为药物载体的制备及其对脑缺血再灌注损伤保护机制研究》文中指出目的缺血性卒中是全球范围内引起严重残疾和死亡的主要原因。缺血再灌注(Ischemic Reperfusion,简称I/R)将引发严重的氧化应激,导致线粒体中产生大量的活性氧(ROS)激活线粒体介导的细胞凋亡途径而导致神经元细胞大面积凋亡。ROS的不断积累,使紧密连接蛋白(Tight Junction Protein,简称TJP)降解从而失去原本的保护作用,进一步导致血脑屏障(Blood-brain barrier,简称BBB)丧失完整性,加重脑损伤。在缺血性卒中的治疗研究中,大部分药物很难穿越BBB实现其治疗作用。外泌体因其在粒径、生物相容性、免疫学特性等方面的优势而受到众多研究者的青睐。血浆外泌体(Plasma Exosomes,简称Pla-Exo)易大量提取,且不易诱发机体的免疫反应和癌细胞的异常增殖。因此,本课题将制备Pla-Exo并考察其药物装载能力,研究Pla-Exo对I/R损伤的保护作用及机制,并进一步探讨Pla-Exo与药物的双重治疗效果。方法在本实验中,通过小鼠眼眶取血获得新鲜血浆,经超速离心得到Pla-Exo。采用原子力显微镜、粒径分析和Western Blot实验对Pla-Exo的形态、粒径、蛋白表达进行表征分析;在摄取研究中,应用人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,简称HBMECs)模拟BBB探讨Pla-Exo透过BBB的可能通路及机制;通过激光共聚焦显微镜观察Pla-Exo在脑组织中的摄取情况,检测Pla-Exo的组织分布;通过体外BBB穿透实验探究Pla-Exo的摄取机制。利用细胞内ROS检测实验检测缺血区细胞内ROS的积累以研究其发挥神经保护作用的机制;利用线粒体膜电位检测实验检测缺血区脑组织线粒体膜电位变化判断线粒体损伤情况;通过Western Blot实验检测线粒体膜完整性。在探讨神经保护作用实验中,使用C57BL/6小鼠制作大脑中动脉闭塞缺血/再灌注(MCAO/R)模型和Pla-Exo给药模型,通过Zea-Longa评分和Ludmila Belayev评分原则进行神经功能学评分;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)实验检测脑组织梗死体积;免疫荧光染色实验探究MCAO/R组和Pla-Exo组缺血脑区中抑制神经元细胞(Neu N)死亡效果;伊文思蓝(Evans Blue,简称EB)实验对BBB完整性进行检测;免疫荧光实验检测内皮细胞标志物CD34阳性情况;计算脑水肿比率等测定检测药物的神经保护作用及脑水肿恢复情况;Western Blot实验检测TJP包括Occludin和Clandin-5的断裂情况及表达水平。最后通过Western Blot实验对缺血区与非缺血区组织进行机制验证。使用VER155008(VER)作为热休克蛋白70(Heat Shock Proteins70,简称HSP70)的抑制剂抑制Pla-Exo中HSP70的表达;Western Blot实验检测脑中HSP70含量;再进行细胞内ROS检测实验、TTC染色实验、线粒体膜电位检测实验、Zea-Longa评分和Ludmila Belayev评分验证HSP70在Pla-Exo的神经保护作用中发挥的关键作用。应用孵育法制备装载二甲双胍(Metformin,简称Met)的Pla-Exo-Met;紫外分光光度法考察Pla-Exo-Met的装载效率;体内、外摄取实验探讨Pla-Exo-Met是否能被脑组织摄取;TTC染色法进一步探究Pla-Exo-Met的神经保护作用。结果本文使用超速离心法提取出的Pla-Exo符合纯度要求。Pla-Exo粒径在124.7nm左右、形态较为均匀、结构完整,且每次提取保证了操作相同,均能提取出粒径、形态一致的Pla-Exo。在使用HBMECs模拟BBB的穿透实验中,Pla-Exo有很好的穿透性,且在脂多糖(Lipopolysaccharide,简称LPS)诱导的炎性环境中穿透性有所提高。通过HSP70特异性结合内皮Toll样受体4(Toll like receptor4,简称TLR4)介导的胞吞作用实现了Pla-Exo的BBB渗透性。在摄取研究中,Pla-Exo可被脑组织摄取,进而发挥治疗作用。在免疫荧光实验和Western Blot实验中,Pla-Exo抑制了缺血脑区的ROS积累,使受损的线粒体膜电位升高,维持了线粒体膜的完整性。在神经功能学实验中,通过TTC染色实验、神经功能学评分、免疫荧光试验发现Pla-Exo减少了I/R的小鼠脑梗死体积,改善了神经损伤。EB实验、Western Blot实验和免疫荧光实验均发现Pla-Exo可以减少TJP分解,维持了I/R后BBB的完整性。经统计Pla-Exo使I/R后的小鼠脑水肿率明显下降。Western Blot实验验证了Pla-Exo使I/R后的小鼠缺血性脑区的Bcl-2蛋白水平增高,抑制凋亡因子Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3和Bax的表达。抑制Pla-Exo中的HSP70表达后,Pla-Exo+VER组ROS积累量更多、线粒体膜电位降低、脑梗死体积更大、神经功能学评分更高,Pla-Exo的治疗作用被抑制,验证了HSP70在Pla-Exo的神经保护效果中起到的关键作用。成功制备了Pla-Exo-Met,且包封率在48%左右,Pla-Exo-Met可以透过BBB,使Met在脑中到达治疗部位进而发挥Met与Pla-Exo的协同治疗作用,显着减少小鼠脑梗死体积。结论Pla-Exo具有良好的稳定性。Pla-Exo通过自身携带的HSP70与HBMECs表面的TLR4受体之间特异性结合使Pla-Exo进入脑组织,实现了脑靶向性和BBB渗透。Pla-Exo增加了I/R后的缺血区HSP70的表达,通过抑制ROS异常增多导致的线粒体损伤,逆转了线粒体膜电位异常降低,缓解了线粒体功能障碍,减轻BBB损伤,抑制凋亡蛋白的表达,从而改善脑I/R损伤。Pla-Exo作为一种良好的纳米载体,装载Met协助其进入脑内,进而发挥双重保护治疗作用,恢复神经功能损伤。
胡杨[3](2021)在《在慢性缺氧条件下Hsp27对脑血管内皮细胞的保护作用研究》文中提出目的:建立脑血管内皮细胞慢性缺氧模型,观察脑血管内皮细胞在慢性缺氧状态下小热休克蛋白20(heat shock protein 20,Hsp20)、小热休克蛋白22(heat shock protein22,Hsp22)、小热休克蛋白27(heat shock protein 27,Hsp27)以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)的表达情况,以及在慢性缺氧条件下Hsp27与炎症因子之间的相关性,探讨在慢性缺氧时其对脑血管内皮细胞可能的保护作用。方法:将鼠脑血管内皮细胞b End.3于低氧条件下(2%O2、5%CO2和93%N2)培养,模拟慢性脑低灌注体外细胞模型。使用倒置荧光显微镜观察常氧培养及缺氧培养24h、48h、72h的细胞形态,并用CCK-8检测细胞活性。使用western blot及RT-q PCR检测热休克蛋白Hsp20、Hsp22、Hsp27以及炎症因子TNF-α、IL-1β的表达。使用Hsp27抑制剂KRIBB3培养脑血管内皮细胞后检测炎症因子的表达,验证其相关性。结果:1、慢性缺氧培养后显微镜下可见内皮细胞皱缩、变圆,与周围细胞联成网状,细胞间隙明显增宽,存活细胞数减少。2、随着慢性缺氧培养时间延长,与对照组相比,缺氧培养组细胞活力明显下降(P<0.05)。3、慢性缺氧处理细胞后,小热休克蛋白Hsp20、Hsp22及Hsp27的表达均较对照组升高(P<0.001)。4、慢性缺氧处理细胞后,炎症因子TNF-α及IL-1β的表达较对照组升高(P<0.001)。5、使用Hsp27抑制剂KRIBB3处理细胞并进行缺氧培养,炎症因子表达量较未处理组明显增高(P<0.001)。结论:1、慢性缺氧培养脑血管内皮细胞可以作为慢性脑低灌注体外细胞模型,随着缺氧时间延长,细胞活性明显下降。2、慢性缺氧使脑血管内皮细胞上小热休克蛋白的表达增加。3、慢性缺氧使脑血管内皮细胞上炎症因子的表达增加。4、Hsp27通过减轻炎症反应来保护慢性缺氧造成的脑血管内皮细胞损伤。
辛美萤[4](2020)在《基于AMPK/mTOR/ULK1通路探讨自噬在缺血性脑损伤中的作用及丹酚酸B的神经保护机制》文中认为背景:自噬是机体抵抗应激、提高生存能力的重要过程。脑缺血发生后,胞内衰老和受损的成分可经自噬降解产生代谢底物被循环利用,帮助细胞维持能量稳态并提高生存率。作为中枢神经系统中主要的细胞类型,脑缺血后星形胶质细胞可通过激活自噬改变其存活及功能状态,从而对改善卒中后脑损伤及神经功能发挥重要作用。unc-51样激酶1(Unc-51 like kinase 1,ULK1)是启动自噬的关键蛋白,雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)可通过磷酸化ULK1的丝氨酸757位点抑制其活化。既往研究表明,应激条件下激活的AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)可以解除m TOR对ULK1的抑制作用,从而促进自噬发生。然而,目前关于缺血后星形胶质细胞中AMPK/m TOR/ULK1通路对自噬调控的相关研究尚少。此外,选择性自噬是细胞对胞内特定成分的选择性清除,目前有许多研究涉及丝氨酸757位点磷酸化的ULK1(p S757-ULK1)对自噬的调控,却很少有研究探索自噬对p S757-ULK1的反向调控。因此,我们试图通过观察缺血后星形胶质细胞中AMPK/m TOR/ULK1通路的变化、p S757-ULK1的自噬降解及它们对自噬的调控,探索其对缺血性脑损伤的神经保护作用,并为缺血性脑卒中的治疗提供新靶点。丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)是中药丹参中的主要活性成分。已有研究报道Sal B在心肌细胞、肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞中对自噬有促进作用。但Sal B对脑缺血后星形胶质细胞的自噬调控作用及机制尚不明确,需要我们进一步探究。目的:明确自噬对缺血性脑损伤的神经保护作用,验证缺血性脑损伤后星形胶质细胞AMPK/m TOR/ULK1通路对自噬的调控作用,同时探索Sal B的神经保护作用及机制。方法:体内实验中,选用体重为20-23g的成年雄性C57BL/6小鼠,建立左侧大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。实验分为假手术组、MCAO组、Sal B干预组、自噬抑制剂巴弗洛霉素(Bafilomycin A1,Baf A1)干预组、Sal B+Baf A1干预组。通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色评价各组小鼠脑梗死体积情况;通过Longa评分评估各组小鼠神经行为学评分情况。体外实验中,培养新生C57BL/6小鼠皮层星型胶质细胞,以糖氧剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)模型为基础,实验分为对照组、OGD组、Sal B干预组、Baf A1干预组、Sal B+Baf A1干预组、AMPK抑制剂多索吗啡(Dorsomorphin)干预组和Sal B+Dorsomorphin干预组。应用噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测各组细胞存活率;应用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;应用流式微珠阵列(Cytometric bead array,CBA)法检测各组细胞炎性细胞因子的释放情况;应用免疫印迹法检测各组细胞中自噬标志物Beclin 1和LC3B蛋白以及AMPK/m TOR/ULK1通路相关蛋白的表达情况,检测应用si RNA技术分别敲低选择性自噬受体NDP52、OPTN、NBR1和p62的基因后细胞中p S757-ULK1的表达变化;应用免疫共沉淀技术分别评价p S757-ULK1与NDP52和OPTN之间的连接情况;应用免疫荧光染色分别观察p S757-ULK1与NDP52和OPTN的共定位情况。结果:1.组织形态学及神经行为学评分:与MCAO组相比,Sal B干预组的脑梗死体积显着减小(p<0.0001),Longa评分有减小趋势,但无统计学差异;与Sal B干预组相比,Sal B+Baf A1干预组的脑梗死体积明显增加(p<0.001),Longa评分有增加趋势,但无统计学差异。2.细胞存活及功能状态:与对照组相比,OGD组的细胞存活率降低(p<0.001),凋亡比率增加(p<0.001),促炎因子IFN-γ、IL-2和IL-6的水平增高(p<0.01),抗炎因子IL-4和IL-10的水平减低(p<0.05);Sal B干预剂可明显提高细胞存活率(p<0.01),降低细胞凋亡比率(p<0.001),减少细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6(p<0.01)并增加IL-4和IL-10的释放(p<0.05),明显改善细胞的存活及功能状态;而给予自噬抑制剂Baf A1可逆转Sal B对细胞存活及功能方面的保护作用。3.自噬相关蛋白及调控分子的改变:与对照组相比,OGD组细胞内自噬标志物Beclin 1表达、LC3B II/LC3B I比值(p<0.001)和p T172-AMPK的表达明显增加(p<0.01),p S2448-m TOR、p S757-ULK1的表达明显降低(p<0.05);对于OGD组,给予Sal B处理可进一步增加Beclin 1(p<0.05)和p T172-AMPK的表达(p<0.01),增大LC3B II/LCB I比值(p<0.05),并减少p S2448-m TOR和p S757-ULK1的表达(p<0.01),表明Sal B激活AMPK/m TOR/ULK1通路并增强自噬活性;此外,给予Sal B干预组AMPK抑制剂Dorsomorphin处理可逆转上述蛋白改变。4.自噬介导p S757-ULK1降解:给予OGD组和Sal B干预组自噬抑制剂Baf A1处理后,胞内p S757-ULK1出现蓄积(p<0.05),且Sal B干预组中p S757-ULK1蓄积更明显,表明Sal B可促进p S757-ULK1的自噬降解;选择性自噬受体NDP52和OPTN敲低后,p S757-ULK1蓄积明显(p<0.01),表明p S757-ULK1的选择性自噬降解可能由自噬受体NDP52和OPTN介导;此外,免疫共沉淀结果显示Sal B处理可以使p S757-ULK1与星形胶质细胞中内源性的NDP52和OPTN之间的连接增加。免疫荧光结果显示Sal B处理可以使p S757-ULK1与He La细胞中外源性的NDP52和OPTN之间的共定位增加。结论:1.脑缺血损伤后星形胶质细胞中自噬活性的增强可促进其存活,减少其促炎因子并增加其抗炎因子的释放。2.脑缺血损伤后星形胶质细胞中AMPK/m TOR/ULK1信号通路的激活可增强其自噬活性,同时自噬促进由NDP52和OPTN介导的p S757-ULK1的选择性自噬降解,形成正反馈型保护环路。3.Sal B通过激活星形胶质细胞AMPK/m TOR/ULK1信号通路及促进p S757-ULK1的自噬降解,增强星形胶质细胞的自噬活性,进而在脑缺血损伤中发挥神经保护作用。
李远志[5](2020)在《沉默SNHG12后BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中研究说明背景:缺血性脑卒中是由血液供应中断引起的,是世界范围内致死、致残的主要原因。尽管随着新的治疗药物和血管内技术的发展,但全世界每年的缺血性脑卒中发病率和患病率仍在持续上升,缺血性脑卒中后发生的脑组织损伤仍然严重威胁着患者的生存和生活质量。对于缺血性脑卒中后缺血再灌注损伤,目前尚无特效治疗药物,而干细胞移植可能成为最有潜力的治疗方式。既往有研究报道,长链非编码RNA(LncRNA)在调节骨髓间充质干细胞(BMSCs)的功能中起着关键作用,并有研究报道长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因12(LncRNA SNHG12)在大鼠脑缺血模型脑组织中表达明显异常。但鲜有报道SNHG12修饰的BMSCs在治疗脑缺血后受损伤的脑组织中所发挥的作用。本研究主要探索沉默SNHG12后BMSCs是否通过激活PI3K/AKT-mTOR信号通路对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用及其相应机制。方法:本研究利用氧葡萄糖剥夺/再灌注(OGD/R)处理大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs),再用qPCR检测BMECs中不同时间点的SNHG12的表达水平。并利用OGD/R处理的大鼠BMECs与BMSCs或OGD/R预处理的BMSCs或shSNHG12-BMSCs共培养。接下来,通过使用qPCR检测共培养后SNHG12的表达水平,使用CCK-8和EdU法检测BMECs的增殖情况,使用流式细胞术和Hoechst染色法检测细胞凋亡程度,使用免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达,并使用Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白以及PI3K/AKT-mTOR通路蛋白的表达。最后,将BMSCs或shSNHG12-BMSCs移植到大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型中进一步证实细胞实验所获得的发现。同时,对大鼠MCAO模型进行神经行为学评估,TTC染色及HE染色了解脑梗塞体积的变化,Tunel染色检测脑组织凋亡情况。结果:在体外实验中,BMECs经OGD/R处理后显着上调了 BMECs中SNHG12的表达,抑制了BMECs的增殖,促进了凋亡蛋白Caspase-3的表达,促进了自噬蛋白LC3B的表达,并抑制了自噬蛋白P62的表达,同时还抑制了BMECs中PI3K、AKT和mTOR蛋白的磷酸化。但是,经OGD/R处理的BMECs与BMSCs共培养后显着抑制了BMECs中SNHG12表达的上调,显着改善了BMECs增殖的抑制,并显着抑制了BMECs凋亡和自噬的增加,同时还逆转了BMECs中PI3K、AKT和mTOR蛋白磷酸化的抑制作用。并证实了沉默SNHG12显着增强BMSCs的作用。在体内实验进一步证实,移植BMSCs显着减小了MCAO大鼠的脑梗死面积,降低了神经功能缺损评分,抑制了细胞凋亡及自噬的增加,并逆转了PI3K、AKT和mTOR蛋白磷酸化的抑制作用。并证实了沉默SNHG12显着增强BMSCs在MCAO大鼠中的治疗作用。结论:沉默BMSCs中SNHG12可通过激活PI3K/AKT-mTOR信号通路,显着增强了 BMSCs促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和自噬的作用,从而对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。
周颖[6](2019)在《补阳还五汤通过Connexin43介导大鼠脑缺血再灌注后血管新生》文中指出目的:缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)是星形胶质细胞上最主要的缝隙连接(gap junction,GJ)蛋白,能在细胞间传输毒性代谢产物和营养物质,对脑损伤的扩散和修复具有双向调节的作用。补阳还五汤具有补气养血,活血通络之功效,是中医治疗脑卒中后遗症的经典方剂。本实验主要通过行为学实验、高尔基染色与免疫荧光染色等技术,观察神经功能恢复情况、神经形态与血管新生的指标来探索在大鼠脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)后的修复期中,Cx43在补阳还五汤促修复中的作用。血管的形成则是由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素因子 1(angiopoietin-1,Ang-1)调控决定,本实验对与之相关的作用机制进行了初步探索。这为补阳还五汤抗脑损伤机制中新靶点、新途径的研究提供了更多的实验依据。方法:运用线栓法给SD雄性大鼠建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,造模后将神经功能评分合格的大鼠随机分为模型组(MCAO),Cx43激动剂(GAP-134)组,Cx43抑制剂(Gap26)组,补阳还五汤(BYHWD)组和补阳还五汤联合Cx43抑制剂(BYHWD+Gap26)组,另设假手术对照组(Sham),每组12只大鼠。GAP-134药物剂量为3 mg/kg,灌胃,2次/d,Gap26给药剂量为25μg/kg,腹腔注射,1次/d(GAP-134与Gap26的给药时间均在造模后3d),补阳还五汤给药剂量为16g/kg,灌胃,2次/d(于造模后2h给药);模型组与假手术组用同样的给药方式,每次给予同等用量的生理盐水。1.Connexin43在补阳还五汤促进脑缺血再灌注后修复中的作用在术后第1,3,7 d对各组大鼠进行横木行走测试(Beam-walking test,BWT)以观测其运动整合和平衡协调能力,以及自发交替反应测试(Spontaneous alternation behavior test,SAB test)以观测其空间记忆能力。第7 d取各组大鼠脑组织,采用高尔基染色法观察海马CA1、CA3和DG区神经元基、顶树突的长度,节点数,终末分支数以及树突棘密度的改变以反映神经元树突的复杂性和树突棘的可塑性,激光共聚焦下观察并拍摄图片,Image-Pro Plus 6.0图片分析软件进行分析。2.Connexin43在补阳还五汤促进脑缺血再灌注后修复中的血管新生机制探究造模后第7 d,4%多聚甲醛灌注后取各组大鼠脑组织,采用免疫荧光法检测CD31表达量以计算海马CA1、CA3和DG区的微血管密度(microvessel density,MVD)以反映血管新生情况。并检测各分组海马CA1、CA3和DG区VEGFs和Ang-1蛋白阳性表达量。激光共聚焦下观察并拍摄图片,Image-Pro Plus 6.0图片分析软件进行分析。结果:1.与模型组比较,GAP-134组第7 d的评分降低(P<0.05),相对交替率显着提高(P<0.01),神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈增长的趋势,Gap26组第7d评分升高(P<0.05),相对交替率Gap26组有所下降(P<0.05),神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈下降的趋势,而BYHWD组大鼠衡木行走测试评分降低(P<0.05),自发交替反应测试相对交替率升高(P<0.05),神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈增长的趋势。相较于BYHWD组,BYHWD+Gap26组第7 d大鼠横木行走测试评分更高(P<0.05),自发交替反应测试相对交替率更低(P<0.05);神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈下降的趋势;。2.与模型组比较,GAP-134组海马三个区域MVD表达水平显着升高(P<0.01),Gap26组MVD值在CA1区、DG区表达降低(P<0.05),BYHWD组海马CA1、CA3和DG区MVD表达水平均升高(P<0.05)。与BYHWD组比较,BYHWD+Gap26组海马CA1、CA3和DG区MVD表达水平均显着降低(P<0.01)。与模型组比较,GAP-134组海马三个区域VEGF表达升高(P<0.01),CA3区Ang-1表达上调(P<0.05),Gap26组DG区VEGF表达下调(P<0.05),CA1区和DG区Ang-1显着下调(P<0.01),BYHWD组海马CA1、CA3和DG区VEGF表达升高(P<0.05),Ang-1 显着上调(P<0.01)。与 BYHWD 组比较,BYHWD+Gap26 组海马CA1和DG区VEGF显着下调(P<0.01),CA1区和CA3区Ang-1下调(P<0.05)。结论:1.脑缺血再灌注后,补阳还五汤可以通过星形胶质细胞Cx43介导改变树突的复杂性、促进神经功能恢复和血管新生以促进脑损伤的修复。2.补阳还五汤通过星形胶质细胞Cx43诱导血管新生的作用机制与VEGF,Ang-1有关。
罗云霞[7](2019)在《基于网络药理学探索当归芍药散对缺血性中风的作用机制研究》文中认为目的:中风是中老年人群中的高发病,具有高致残率、致死率的特点,虽然可用组织纤溶酶原激活物(Tissue plasminogen activator,t-PA)治疗,但t-PA只有很短的治疗时间窗(3~4.5h),并有出血转化、神经毒性以及增加死亡率的副作用[1]。因此寻找更加有效的治疗策略与药物具有重要意义。网络药理学是新型发展起来的的现代新药研究范式,强调“网络靶标”在生物网络、生物通路中的动态调节作用,具有整体性、系统性、动态性的特点,与中医的整体观、辨证论治特色不谋而合,是中医复方现代化研究的强有力策略与方法,为深入探索中药复方的“君臣佐使”组方机理、“异病同治”内涵,治病作用机制等研究提供了有力工具。当归芍药散(Danggui-Shaoyao-San,DSS)出自《金匮要略》,由当归、芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻组成,具有补血活血、化瘀逐痰的功效,自20世纪80年代至今,在中风和神经退行性疾病治疗方面,表现出潜在的临床应用价值[2,3]。本论文主要针对当归芍药散治疗缺血性中风的作用机制研究,一方面采用网络药理学方法,从分子层面阐明了 DSS的“君臣佐使”、“异病同治”的生物学基础,从整体观出发,探讨了 DSS治疗缺血性中风的作用机制;另一方面基于大鼠中动脉栓赛(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)缺血性中风模型,观察当归芍药散水提液与乙醇提取液对脑缺血再灌注损伤急性期的整体疗效差异(源于当归芍药散原方原义),在此基础上,以网络药理学方法所探索的当归芍药散治疗疾病所涉及的内涵基础上,进一步深入探索当归芍药散乙醇提取物对脑缺血再灌注损伤的可能作用机制,最后采用高效液相色谱-紫外法(High performance liquid chromatography-ultraviolet,HPLC-UV)探索当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分含量。方法:实验一:基于网络药理学探索当归芍药散治疗缺血性中风的作用机制研究我们通过权威中草药数据库与文本挖掘方法构建DSS的化学成分数据库;以吸收(Absorption,A)、分布(Distribution,D)、代谢(Metabolism,M)、排泄(Excretion,E)为参数,筛选DSS中的活性成分;随后采用随机森林和支持向量机两种算法对筛选的活性成分进行靶点预测;采用InteractiVenn网站与GluGO插件分别对作用靶点进行了协同机制、分子功能与生物过程分析;构建活性成份、靶点、通路、疾病之间的相互作用网络;应用Cytoscape软件对以上构建的各种网络做可视化处理;最后对复杂网络做相关的网络分析,尽可能全面的挖掘其中蕴含的生物学意义。实验二:基于MCAO模型大鼠探索当归芍药散对缺血性中风的保护作用机制研究当归芍药散中的当归、芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻以3:16:4:8:4:8的比例混合,一部分用于制作水煎剂:适量药材8倍体积的蒸馏水浸泡1小时,煎煮1小时,收集滤液,滤渣再以6倍体积蒸馏水煎煮1小时,收集滤液并充分混合两次滤液,最后冷冻干燥保存备用;一部分用于DSS乙醇提取物制备:70%乙醇以10倍量比浸泡过夜,超声提取3次(1小时/次),合并三次提取液冷冻干燥备用。选择270~290g的雄性SD大鼠,参考Longa,et.法建立大鼠MCAO模型。本实验共涉及有5组实验动物,即假手术组(SHAM)、模型组(MCAO)、DSS水提液组(DSS/W)、DSS乙醇提取物组(DSS/E或者DSS),以及SIRT1 特异性抑制剂EX527处理组(MCAO+EX527+DSS),其中 DSS/W 与 MCAO+EX527+DSS 组各 6 只,SHAM 组 1 4只,其他组各21只大鼠。各组大鼠在再灌注前30min给与相应处理:SHAM与MCAO组给与等体积的双蒸水灌胃处理,DSS/W、DSS/E(DSS)以及MCAO+EX527+DSS实验组分别给与12g/kg(生药量/体重)的当归芍药散水提液或乙醇提取物治疗(而MCAO+EX527+DSS在造模前已给予EX527处理)。大鼠处死前参考modifin ed Neurological Severity Score(mNSS)法给与神经功能缺损评估。术后24h取脑组织,一部分脑组织应用TTC染色法观察脑组织梗死面积大小,并进一步充分利用此脑组织进行相关蛋白的检测:同时参考Garcia的方法评估大鼠脑组织的脑水肿情况(只有在进行DSS不同提取物对MCAO模型大鼠脑水肿影响差异试验时使用)。另一部分进行冰冻组织切片,采用TUNEL染色法检测脑组织皮质与纹状体细胞凋亡情况,免疫荧光法观察3NT,采用HET、HKSOX-1探针观察脑组织中活性氧情况;采用Western Blot(WB)法检测脑组织蛋白 Caspase3、Ceaved-caspase3、Bcl2、Bax 蛋白的表达,观察神经元死亡情况;WB法检测P47phox、P67phox、iNOS、以及SIRT1蛋白的表达情况,观察脑组织氧化应激情况。实验三:采用HPLC-UV检测当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分含量以当归芍药散乙醇提取物中的主要活性成分为研究对象,采用HPLC-UV技术,应用安捷伦色谱柱(Eclipse Plus C18,4.6×250mm.5μm),乙腈(A)与 0.05%磷酸水(B)作为流动相,进行梯度洗脱。流动相A:B=95%-88%:5%-12%(0-15min):15-25min时的流动相A 88%等度洗脱;25-60min流动相A从88%变为75%;60-80min流动相A从75%变为45%;80-100min流动相A从45%变为30%;100-120min流动相A从30%变为5%;120-130min流动性A5%等度洗脱;130-138min流动相A从5%变为95%;138-145min流动相A95%等度洗脱。流速为1ml/min,柱温为25℃,进样量5ul,检测波长为230nm。进行系统适用性检测后,根据线性关系检测得到当归芍药散中芍药苷、芍药内脂苷、阿魏酸含量。结果:实验一:基于网络药理学探索当归芍药散治疗缺血性中风的作用机制研究本实验采用网络药理学探索当归芍药散对缺血性中风疾病的作用机制,结果表明,DSS作为中药复方所具有的“多成分-多靶点-多途径”的内涵有:DSS中有52活性成分,可作用于248个蛋白靶点,在这些靶点中,川芎与白芍各有特异性靶标58(24.07%)、40(16.60%)个,当归虽然只有2个特异性靶点,但是其他靶点主要与川芎以及白芍重合(分别有56、25个),由此可知当归可通过这些相同的作用靶点协同增强白芍与川芎的治疗作用,同时白芍与川芎也有相互协同作用,说明它们在治疗疾病起其主要作用,其他中药在DSS中起次要治疗作用。当归芍药散的“异病同治”基础是DSS同时对中风、神经退行性疾病、呼吸系统疾病、泌尿生殖系统疾病、免疫系统疾病等有治疗作用,是因为这些疾病间有相同的治病蛋白以及分子机制。具体而言,而DSS通过多种途径参与缺血性中风的治疗,主要包括调节谷氨酸兴奋性毒性,线粒体与内质网功能紊乱、以及神经炎证等相关病理通路而对缺血性中风具有治疗作用。实验二:基于MCAO模型大鼠探索当归芍药散对缺血性中风的保护作用机制研究本实验采用MCAO模型大鼠探索当归芍药散提取物对脑缺血再灌注损伤急性期的的保护作用机制。结果表明,在神经功能缺损评估方面,与MCAO模型大鼠相比,DSS水提液(DSS/W,12g/kg)组大鼠灌胃治疗后,大鼠的mNSS评分并没有减少,而给与DSS乙醇提取物(DSS/E,12g/kg)灌胃干预后,大鼠的mNSS评分明显减少(P<0.05);在脑梗死范围大小的影响方面,与MCAO模型大鼠相比,DSS/W组大鼠的梗死面积没有减少,而DSS/E组大鼠的脑梗死面积显着减少(P<0.05):在脑水肿影响方面,与MCAO模型大鼠相比,DSS的水提物与乙醇提取物干预均未对脑水肿有治疗作用。由此可知,DSS乙醇提取物比水提物对MCAO模型大鼠的整体疗效更为明显,因此在深入机制研究方面,我们只采用了 DSS乙醇提取物继续探索对MCAO的作用机制研究。结果表明,与SHAM组相比,DSS乙醇提取物(DSS,12g/kg)灌胃治疗后,DSS可显着减少大脑皮层与纹状体区域的凋亡神经元数目,明显减少Bax蛋白表达(P<0.05),上调Bc12蛋白表达,下调Cleaved-caspase3/caspase3蛋白表达;在分子机制层面,与MCAO模型大鼠相比,DSS在再灌输前30min干预后,大鼠脑组织中的活性氧O2-、3NT含量可显着减少,对脑组织中的P46phox、P67phox、iNOS蛋白表达呈下调趋势,而可显着上调SIRT1蛋白表达;当采用SIRT1特异性抑制剂时,DSS对MCAO模型大鼠的缺血再灌注损伤保护作用消失。实验三:采用HPLC-UV检测当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分含量本实验采用HPLC-UV法探索当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分含量测定。结果表明,系统适用性良好,对照品线性关系良好。经HPLC测定并计算得出芍药苷、芍药内脂苷、阿魏酸的含量分别为39.7412ug/mg,5.3411ug/mg,0.8221ug/mg。结论:(一)基于网络药理学的研究结论1.DSS中医复方“多成分-多靶点-多途径”的具体内涵主要涉及:DSS有52个活性成分,可作用于248个蛋白靶点;分子水平的“君臣佐使”内涵与中医理论相符;“异病同治”的生物学基础是DSS同时作用于多种疾病的共同致病靶标与分子机制。2.DSS主要通过调节谷氨酸兴奋性毒性、线粒体与内质网稳态、钙离子稳态以及神经炎证等病理过程对缺血性中风具有治理作用。由此可知,网络药理学应用于中医复方研究的优点在于它既可以宏观把握复方的复杂性,又可以从微观角度探秘复方复杂性的内在机理,一大一小,一动一静,可以使中医复方以及所蕴含的中医理论从模糊性走向具体化,可以为治疗疾病提供更多的智慧。(二)基于MCAO模型大鼠以及HPLC-UV法的研究结论1.DSS乙醇提取物比DSS水提物对脑缺血再灌注损伤MCAO模型大鼠的整体疗效更好。2.DSS乙醇提取物对脑缺血再灌注损伤急性期的保护作用主要通过抗氧化应激作用,其机制具有SIRT1依赖性。3.HPLC-UV方法操作简单、快捷,准确、重复性好,可用于检测DSS复方中的主要活性成分芍药苷、芍药内脂苷、阿魏酸的含量。综上所述,当归芍药散乙醇提取物对脑缺血再灌注损伤急性期的保护作用比水提液更好,可通过抗氧化剂应激(具有SIRT1依赖性)、抑制神经元凋亡,减少脑梗死灶大小,缓减MCAO模型大鼠神经功能缺损情况;当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分芍药苷、芍药内脂苷、阿魏酸的含量分别为39.7412ug/mg,5.3411ug/mg,0.8221ug/mg。
罗龙龙[8](2019)在《L-谷氨酰胺促进小鼠脑缺血损伤后修复的作用研究》文中研究说明背景:氧化应激在卒中病理学中起着重要作用,L-谷氨酰胺被证明具有抗氧化活性,并于2017年7月由美国食品药品监督管理局批准用于治疗镰刀形细胞贫血病。在本课题中,我研究了L-谷氨酰胺对缺血性脑损伤的作用。方法:用90分钟短暂性大脑中动脉栓塞法诱导小鼠局灶性脑缺血损伤。将成年雄性ICR小鼠(n=135)分成四组:(1)假手术组,(2)生理盐水组,(3)L-谷氨酰胺组和(4)L-谷氨酰胺加热休克蛋白70 ATP酶活性抑制剂(Apoptozole)组。在手术后的前三天,每天进行一次腹腔给药处理。在手术前和手术后的第1,3,7和14天,根据双盲实验的原则,使用改良神经功能缺损评分(mNSS),抬高身体摇摆实验(EBST)和疲劳转棒实验等进行小鼠的神经行为学评估。通过对脑切片进行焦油紫染色成像来计算梗死体积。通过实时聚合酶链反应和蛋白质印迹法评估热休克蛋白及其信号传导途径相关因子RNA与蛋白的表达水平。通过测定丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)来评估组织氧化应激水平。体外进行星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞和神经元细胞培养实验,通过糖氧剥夺(OGD)再复氧模型模拟缺血再灌注损伤,进一步探究L-谷氨酰胺保护脑内细胞的作用机制。结果:我们发现L-谷氨酰胺治疗可减少缺血性损伤后小鼠的脑梗死体积并促进神经行为的恢复,而L-谷氨酰胺与热休克蛋白70抑制剂的联用很大程度上阻止了该效果的产生。L-谷氨酰胺诱导缺血小鼠脑中热休克蛋白70与红系衍生核因子相关因子2(NRF2)的上调,降低氧化应激水平以及促炎因子如白细胞介素-1β和白细胞介素-6的表达。与生理盐水组相比,L-谷氨酰胺组中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平显着增加。此外,体外实验进一步揭示,添加含有L-谷氨酰胺的星形胶质细胞的条件培液(CM)能够减少糖氧剥夺再复氧后神经元的凋亡。结论:L-谷氨酰胺可以减轻小鼠缺血性脑损伤与促进其神经功能的恢复,并且在此过程中热休克蛋白70起到了关键作用。本研究表明L-谷氨酰胺及其诱导上调的热休克蛋白70可能成为治疗缺血性卒中的新型药物与靶点。
尹美美[9](2018)在《肾脑复元汤联合NSCs移植对MCAO大鼠HSP70、AIF表达的影响》文中研究说明目的:本实验通过观察MCAO大鼠的神经功能缺失症状、脑梗死面积及HSP70、AIF蛋白表达水平,从HSP70以及AIF介导的非casepase依赖细胞凋亡途径,探讨肾脑复元汤联合NSCs移植的抗脑缺血损伤作用及其机制。方法:将实验大鼠行MCAO术复制缺血性中风模型,造模成功后随机分为假手术组、模型组、肾脑复元汤组以及肾脑复元汤联合NSCs移植组,分别给予相应处理。分别在治疗前和治疗后1d、3d、7d进行神经功能缺损评分,并在相应时间点处死动物,采用TTC染色检测脑梗死体积,免疫组化和Western blot法检测HSP70、AIF蛋白表达。结果:1.神经功能缺损评分:治疗1d、3d、7d后,中药组、联合组两组m-NSS评分分别与同时间点模型组相比均下降,组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。其中,联合组下降更明显,组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。2.脑梗死体积计算:治疗1d、3d、7d后,中药组、联合组两组脑梗死面积与同时间点模型组比较均减小,组间比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。其中,联合组减小程度更多,差异有统计学意义(P<0.05)。3.免疫组化检测HSP70蛋白表达:模型组、中药组和联合组HSP70蛋白表达均在术后3d左右达高峰,随后逐渐下降。中药组、联合组治疗1d、3d、7d后分别与同时间点模型组比较,HSP70蛋白表达均升高,组间比较差异有显着统计学意义(P<0.01)。其中,联合组上升更明显,组间比较差异有显着统计学意义(P<0.01)。4.免疫组化检测AIF蛋白表达:模型组、中药组和联合组AIF蛋白表达均在术后3d左右达高峰,随后逐渐下降。中药组、联合组治疗1d、3d、7d后分别与同时间点模型组比较,AIF蛋白表达均有所下降,组间比较差异有显着统计学意义(P<0.01)。其中,联合组下降更明显,组间比较差异有显着统计学意义(P<0.01)。5.Western blot法检测HSP70蛋白表达:模型组、中药组和联合组HSP70蛋白表达均在术后3d左右达高峰,随后逐渐下降。治疗1d、3d、7d后,中药组、联合组分别与同时间点模型组比较,HSP70蛋白表达均升高,组间比较差异有统显着计学意义(P<0.01)。其中,联合组升高更明显,组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。6.Western blot法检测AIF蛋白表达:模型组、中药组和联合组AIF蛋白表达均在术后3d左右达高峰,随后逐渐下降。治疗1d、3d、7d后,中药组、联合组分别与同时间点模型组相比,AIF蛋白表达均有下降,组间比较差异有显着统计学意义(P<0.01)。其中,联合组下降更明显,组间比较差异有显着统计学意义(P<0.01)。结论:1.肾脑复元汤和肾脑复元汤联合神经干细胞移植均能通过调控HSP70以及AIF介导的非casepase依赖细胞凋亡途径,减少缺血区域神经细胞的凋亡,进而起到保护缺血脑细胞、促进神经功能恢复的作用。2.肾脑复元汤联合神经干细胞移植对缺血脑细胞的神经保护作用优于肾脑复元汤。
倪勇[10](2018)在《抑制RIP1激酶增强缺血性星形胶质细胞溶酶体膜稳定性的作用及其依赖Hsp70.1B调节的机制》文中提出目的:本实验室前期研究表明,药理或者基因敲低抑制RIP1激酶(Receptor interacting protein kinase,RIP1K)的表达对缺血性脑中风诱导的星形胶质细胞缺血性损伤可发挥保护作用,其发挥的保护作用的机制与其抑制溶酶体内cathepsins的激活和释放有关,由此提示抑制RIP1K的表达其作用机制可能与稳定缺血性星形胶质细胞溶酶体膜有关。因此,本课题旨在进一步深入研究抑制RIP1K的表达后稳定缺血性星形胶质细胞溶酶体膜的作用及其分子信号机制。方法:在体内实验中,在大鼠上通过阻塞大脑中动脉建立永久性阻塞(Permanent cerebral artery occlusion,pMCAO)模型;在体外实验中,培养原代星形胶质细胞,传代后通过糖氧剥夺(Oxygen-glucose deprivation,OGD)建立缺血性星形胶质细胞损伤模型,并通过药理(Nec-1)或者基因敲低(Knockdown of RIP1K)在体内、外抑制RIP1K表达。利用透射电镜观察缺血损伤中星形胶质细胞以及溶酶体形态变化以及利用Annexin-V-FITC和PI染色检测RIP1K基因敲低对缺血诱导的星形胶质细胞坏死和凋亡的影响,同时采用Acridine Orange(AO)染色方法检测溶酶体膜的稳定性。利用基因芯片法、Western Blotting法、免疫组织化学和细胞免疫荧光法检测RIP1K基因敲低后Hsp70.1B(Heat shock protein 70.1B,Hsp70.1B)表达和分布的变化。采用基因(shRNA Hsp70.1B)抑制Hsp70.1B表达,观察Hsp70.1B基因敲低后对pMCAO诱导的脑梗死体积、行为学症状以及星形胶质细胞溶酶体膜稳定性的影响,由此了解Hsp70.1B在缺血性损伤过程发挥的作用。利用Western Blotting法、免疫组织化学和细胞免疫荧光法观察RIP1K基因敲低后对缺血性星形胶质细胞Hsp70.1B的表达具有调控作用的蛋白,比如Hsp90(heat shock protein 90,Hsp90)和Hsf1(heat shock factor1,Hsf1)以及μ-Calpain(μ-钙蛋白酶)蛋白的表达以及分布的变化情况,由此进一步探讨RIP1K基因敲低对Hsp70.1B表达的调控机制。结果:(1)Western Blotting结果显示:在体内和体外实验中发现RIP1K、Hsf1和Hsp70.1B在非缺血状态下表达水平低,缺血后蛋白表达开始上调,缺血6 h后达到峰值,缺血12h后表达降低但仍保持在较高水平。而Hsp90与RIP1K、Hsf1和Hsp70.1B的表达时间点变化存在较大区别,在非缺血状态下Hsp90已经在较高水平,缺血后Hsp90表达下调,缺血6 h后明显降低,12 h后进一步降低。(2)透射电镜结果显示RIP1K敲低后星形胶质细胞的细胞结构以及细胞器溶酶体膜结构较pMCAO组更加完整;Annexin-V-FITC和PI染色结果显示RIP1K敲低后缺血性星形胶质细胞凋亡和坏死较OGD组明显减少;AO染色结果亦表明RIP1K敲低后星形胶质细胞溶酶体膜完整性增加。以上结果提示:基因抑制RIP1K对缺血性星形胶质细胞溶酶体膜具有保护作用。(3)基因芯片结果显示:RIP1K敲低引起缺血性星形胶质细胞表达Hsp70.1B蛋白的Hspa1b基因显着上调;同时Western Blotting、免疫组织化学以及细胞免疫荧光结果显示:RIP1K基因敲低导致缺血性星形胶质细胞Hsp70.1B的表达进一步增加,且主要分布在溶酶体上。进一步的研究发现:Hsp70.1B敲低增加pMCAO诱导的大鼠的脑梗死体积及加重行为学症状;AO染色结果表明Hsp70.1B基因敲低后,缺血性星形胶质细胞溶酶体膜完整性进一步破坏。以上结果提示:基因抑制RIP1K通过上调溶酶体膜Hsp70.1B水平,发挥保护缺血性星形胶质细胞溶酶体膜的作用,即抑制RIP1K保护缺血性星形胶质细胞溶酶体膜的作用是Hsp70.1B依赖性的。(4)进一步利用Western Blotting、免疫共沉淀法,免疫组织化学以及细胞免疫荧光法检测对Hsp70.1B具有调控作用的相关蛋白(Hsp90,Hsf1及μ-Calpain)的表达和分布。结果发现:RIP1K敲低进一步减少缺血性星形胶质细胞细胞浆内Hsp90水平及其与Hsf1的结合,进一步促进Hsf1入核增加。但是对μ-Calpain的表达和分布未见明显影响。以上结果提示:基因抑制RIP1K通过减少缺血性星形胶质细胞细胞浆内Hsp90水平及其与Hsf1的结合,促进Hsf1入核增加,从而增加Hsf1靶基因Hsp70.1B水平,而保护缺血性星形胶质细胞溶酶体膜。结论:RIP1K基因敲低具有提高缺血性星形胶质细胞溶酶体膜稳定性的作用;RIP1K基因敲低促进溶酶体膜稳定性的机制可能与进一步促进缺血性星形胶质细胞溶酶体上Hsp70.1B的表达有关;RIP1K基因敲低对Hsp70.1B的调控可能与进一步抑制缺血性星形胶质细胞细胞浆内Hsp90的表达及其与Hsf1的结合,促进Hsf1入核增多有关。
二、The protection effectiveness of the expression of heat shock protein on ischemic brain damage(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、The protection effectiveness of the expression of heat shock protein on ischemic brain damage(论文提纲范文)
(2)血浆外泌体作为药物载体的制备及其对脑缺血再灌注损伤保护机制研究(论文提纲范文)
中文论着摘要 |
英文论着摘要 |
英文缩略语表 |
第一章 前言 |
一、课题研究背景 |
二、研究内容 |
三、研究意义 |
第二章 血浆外泌体的制备与表征 |
一、实验仪器与材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
五、小结 |
第三章 血浆外泌体的细胞摄取及脑靶向的机制研究 |
一、实验仪器与材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
五、小结 |
第四章 血浆外泌体对缺血再灌注模型小鼠药效学研究 |
一、实验仪器与材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
五、小结 |
第五章 HSP70 在血浆外泌体中关键治疗作用的研究 |
一、实验仪器与材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
五、小结 |
第六章 负载二甲双胍的血浆外泌体的制备及其对缺血性卒中治疗作用的研究 |
一、实验仪器与材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
五、小结 |
第七章 结论 |
参考文献 |
附录 |
一、在学期间科研成绩 |
二、致谢 |
三、个人简介 |
(3)在慢性缺氧条件下Hsp27对脑血管内皮细胞的保护作用研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
材料和方法 |
1.实验材料 |
1.1 主要试剂及耗材 |
1.2 主要仪器设备 |
2.实验方法 |
2.1 细胞培养 |
2.2 慢性脑低灌注体外细胞模型创建 |
2.3 CCK-8检测细胞活性 |
2.4 蛋白印迹法检测蛋白表达 |
2.5 实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测基因表达 |
2.6 统计学方法 |
结果 |
1.慢性缺氧对脑血管内皮细胞活性的影响 |
2.慢性缺氧使脑血管内皮细胞上小热休克蛋白表达增加 |
3.慢性缺氧后脑血管内皮细胞炎症因子表达增加 |
4.慢性缺氧条件下Hsp27与TNF-α之间的相关性 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 热休克蛋白与神经炎症的研究进展 |
参考文献 |
附录 中英文名词缩略词对照 |
攻读学位期间发表文章情况 |
致谢 |
(4)基于AMPK/mTOR/ULK1通路探讨自噬在缺血性脑损伤中的作用及丹酚酸B的神经保护机制(论文提纲范文)
前言 |
中文摘要 |
Abstract |
中英文缩略词对照表 |
第1章 文献综述 |
1.1 缺血性脑卒中概述 |
1.2 自噬概述 |
1.2.1 自噬的生理功能 |
1.2.2 自噬的分子机制 |
1.2.3 选择性自噬 |
1.3 自噬在缺血性脑卒中中的作用 |
1.3.1 神经元自噬与缺血性脑卒中 |
1.3.2 神经胶质细胞自噬与缺血性脑卒中 |
1.3.3 脑内皮细胞自噬与缺血性脑卒中 |
1.4 丹酚酸B对自噬的促进作用 |
1.5 丹酚酸B在缺血性脑损伤中的作用 |
1.6 展望 |
第2章 脑缺血损伤体内、体外模型的建立 |
2.1 前言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 实验方法 |
2.2.3 统计学分析 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 小鼠大脑皮层星形胶质细胞培养体系的建立 |
2.3.2 小鼠大脑皮层星形胶质细胞纯度鉴定 |
2.3.3 小鼠大脑皮层星形胶质细胞OGD模型的建立 |
2.3.4 小鼠星形胶质细胞OGD模型中SalB工作浓度的选择 |
2.3.5 小鼠MCAO模型的建立及MCAO模型中SalB给药浓度的选择 |
2.4 讨论 |
2.5 结论 |
第3章 自噬在小鼠缺血性脑损伤模型中的神经保护作用及SalB对其促进作用 |
3.1 前言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 实验方法 |
3.2.3 统计学分析 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 OGD后星形胶质细胞中自噬标志物水平的上调及SalB对其促进作用 |
3.3.2 OGD后星形胶质细胞自噬流的增强及SalB对其促进作用 |
3.3.3 自噬提高OGD后星形胶质细胞的存活率及SalB对其促进作用 |
3.3.4 自噬降低OGD后星形胶质细胞的凋亡比率及SalB对其促进作用 |
3.3.5 自噬调节OGD后星形胶质细胞炎性细胞因子的释放及SalB对其调控作用 |
3.3.6 自噬对MCAO小鼠脑梗死体积的影响及SalB的神经保护作用 |
3.3.7 自噬对MCAO小鼠神经功能学评分的影响及SalB的神经保护作用 |
3.4 讨论 |
3.5 结论 |
第4章 AMPK/mTOR/ULK1通路对OGD后小鼠星形胶质细胞中自噬的调控及SalB对其促进作用 |
4.1 前言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 实验方法 |
4.2.3 统计学分析 |
4.3 实验结果 |
4.3.1 OGD后星形胶质细胞自噬的增强与AMPK/mTOR/ULK信号通路的激活有关 |
4.3.2 SalB通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强OGD后星形胶质细胞自噬 |
4.4 讨论 |
4.5 结论 |
第5章 小鼠星形胶质细胞糖氧剥夺后pS757-ULK1的降解机制及SalB对pS757-ULK1的调控作用 |
5.1 前言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 实验材料 |
5.2.2 实验方法 |
5.2.3 统计学分析 |
5.3 实验结果 |
5.3.1 OGD后星形胶质细胞中pS757-ULK1通过自噬降解及SalB对其降解的促进作用 |
5.3.2 OGD后星形胶质细胞中pS757-ULK1降解与选择性自噬的关系及SalB对其调控作用 |
5.3.3 免疫共沉淀法探究SalB对OGD后小鼠星形胶质细胞中pS757-ULK1与选择性自噬受体连接的影响 |
5.3.4 免疫荧光法探究SalB对OGD后HeLa细胞中pS757-ULK1与选择性自噬受体连接的影响 |
5.4 讨论 |
5.5 结论 |
第6章 结论 |
参考文献 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(5)沉默SNHG12后BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
参考文献 |
第一章 BMSCs原代培养及鉴定 |
1.1 引言 |
1.2 材料与方法 |
1.3 结果 |
1.4 讨论 |
1.5 结论 |
参考文献 |
第二章 LncRNA SNHG12对大鼠BMECs的影响 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.3 结果 |
2.4 讨论 |
2.5 结论 |
参考文献 |
第三章 BMSCs对大鼠BMECs的作用 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.3 结果 |
3.4 讨论 |
3.5 结论 |
参考文献 |
第四章 沉默SNHG 12后BMSCs对大鼠BMECs的作用 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.3 结果 |
4.4 讨论 |
4.5 讨论 |
参考文献 |
第五章 沉默SNHG12后BMSCs对大鼠I/R损伤的作用 |
5.1 引言 |
5.2 材料与方法 |
5.3 结果 |
5.4 讨论 |
5.5 结论 |
参考文献 |
全文总结 |
综述 |
参考文献 |
英文缩略词对照表 |
学习期间发表论文 |
致谢 |
(6)补阳还五汤通过Connexin43介导大鼠脑缺血再灌注后血管新生(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 研究背景 |
第一节 现代医学对缺血性脑卒中的认识 |
一、脑卒中的流行病学 |
二、缺血性脑卒中机制 |
三、缺血性脑卒中治疗手段 |
第二节 补阳还五汤治疗缺血性脑卒中 |
一、中医对补阳还五汤治疗脑卒中的认识 |
二、补阳还五汤治疗缺血性脑卒中的现代研究 |
三、补阳还五汤对神经再生的影响 |
四、补阳还五汤对血管新生的影响 |
第三节 星形胶质细胞Connexin43的研究现状 |
一、星形胶质细胞与脑卒中的研究现状 |
二、缝隙连接与Connexin43的研究现状 |
三、Connexin43在脑卒中的作用 |
四、补阳还五汤与Connexin43的研究 |
五、GAP-134与Gap26 |
第二章 实验研究 |
第一节 Connexin43在补阳还五汤促进脑缺血再灌注后修复中的作用 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、统计方法 |
四、实验结果 |
五、讨论 |
第二节 Connexin43在补阳还五汤促进脑缺血再灌注后血管新生的机制探究 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、统计方法 |
四、实验结果 |
五、讨论 |
结语 |
参考文献 |
附录 |
在校期间发表论文情况 |
致谢 |
统计学审核证明 |
(7)基于网络药理学探索当归芍药散对缺血性中风的作用机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 文献综述 |
第一节 网络药理学及其在中医药研究领域中的应用 |
一、网络构建 |
二、网络可视化 |
三、网络分析 |
四、中医药与网络药理学 |
第二节 中医对中风病因病机的认识 |
第三节 缺血性中风病理机制研究进展 |
一、缺血性中风与“缺血级联反应”及其神经细胞死亡 |
二、缺血性中风与氧化、硝化应激(Oxidative and nitrosative stress) |
三、缺血性中风与炎症反应 |
四、缺血性中风与脑水肿、血脑屏障损伤 |
第四节 当归芍药散的研究现状 |
一、当归芍药散的活性成分研究现状 |
二、当归芍药散治疗缺血性中风的研究现状 |
第五节 全文研究思路 |
第二章 基于网络药理学探索当归芍药散对缺血性中风的作用机制研究 |
一、实验方法 |
二、实验结果 |
三、讨论 |
四、小结 |
第三章 当归芍药散治疗缺血性中风的药理药效机制研究 |
第一节 当归芍药散提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用及其相关机制研究 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
五、小结 |
第二节 采用HPLC-UV法检测当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分含量 |
一、实验材料 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
五、小结 |
结语 |
一、研究结论 |
二、讨论 |
三、创新性 |
四、课题展望 |
参考文献 |
附录 |
研究生在学期间发表论文情况 |
致谢 |
附件 |
(8)L-谷氨酰胺促进小鼠脑缺血损伤后修复的作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
中英文缩略语表 |
第一章 绪论 |
1.1 研究背景和意义 |
1.1.1 缺血性卒中的研究现状 |
1.1.2 L-谷氨酰胺的研究现状 |
1.1.3 热休克蛋白70的研究现状 |
1.1.4 本课题的研究意义 |
1.2 研究的主要内容与章节安排 |
第二章 L-谷氨酰胺对缺血性卒中的作用研究 |
2.1 引言 |
2.2 实验仪器和材料 |
2.2.1 实验仪器和耗材 |
2.2.2 主要试剂 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 实验设计与L-谷氨酰胺给药方法 |
2.3.2 短暂性大脑中动脉栓塞模型(tMCAO)制作 |
2.3.3 行为学评估 |
2.3.4 灌注取脑及冰冻切片 |
2.3.5 焦油紫染色及梗死统计 |
2.3.6 免疫荧光染色(冰冻切片) |
2.3.7 眼球取血 |
2.3.8 RNA的提取 |
2.3.9 反转录及Real-time PCR检测mRNA的表达情况 |
2.3.10 动物组织蛋白的提取及浓度的测定 |
2.3.11 蛋白印迹法测定脑组织中的蛋白表达情况 |
2.3.12 血清内SOD,GSH以及MDA等氧化指标检测 |
2.3.13 统计方法及数据分析 |
2.4 结果与讨论 |
2.4.1 L-谷氨酰胺改善小鼠脑缺血后的行为学并减少脑梗死体积 |
2.4.2 L-谷氨酰胺增加热休克蛋白家族的mRNA表达 |
2.4.3 L-谷氨酰胺增加热休克蛋白70的蛋白表达 |
2.4.4 L-谷氨酰胺影响血清中氧化应激指标变化 |
2.4.5 L-谷氨酰胺处理影响促、抑炎症因子等表达 |
2.4.6 L-谷氨酰胺减少NF-κB以及增加NRF2的蛋白表达 |
2.5 本章小结 |
第三章 L-谷氨酰胺对梗死边缘区不同细胞内热休克蛋白70表达的作用研究 |
3.1 引言 |
3.2 实验仪器和材料 |
3.2.1 实验仪器和耗材 |
3.2.2 主要试剂 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 短暂性大脑中动脉栓塞模型制作 |
3.3.2 灌注取脑,冰冻切片及漂片的制备 |
3.3.3 免疫荧光染色(冰冻切片与漂片) |
3.3.4 动物组织蛋白的提取及浓度的测定 |
3.3.5 TUNEL染色检测神经元凋亡情况 |
3.3.6 蛋白印迹法测定脑组织中的蛋白表达情况 |
3.4 结果与讨论 |
3.4.1 L-谷氨酰胺增加星形胶质细胞与内皮细胞中热休克蛋白70的表达 |
3.4.2 L-谷氨酰胺与Apoptozole联用对细胞中热休克蛋白70表达的影响 |
3.4.3 L-谷氨酰胺减少tMCAO后梗死边缘区的神经元凋亡 |
3.4.4 L-谷氨酰胺促进星形胶质细胞增殖 |
3.4.5 L-谷氨酰胺激活体内STAT3通路并上调BDNF的蛋白表达 |
3.5 本章小结 |
第四章 L-谷氨酰胺对体外OGD后细胞保护机制研究 |
4.1 引言 |
4.2 实验仪器和材料 |
4.2.1 实验仪器和耗材 |
4.2.2 主要试剂 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 细胞实验分组与设计 |
4.3.2 星形胶质细胞的分离与培养 |
4.3.3 体外糖氧剥夺(OGD)模型 |
4.3.4 星形胶质细胞与内皮细胞增殖能力检测 |
4.3.5 OGD条件下星形胶质细胞中ROS的表达检测 |
4.3.6 流式细胞仪检测星形胶质细胞中DCFH-DA探针载入的荧光强度 |
4.3.7 免疫荧光检测OGD条件下内皮细胞ZO-1的缺失情况 |
4.3.8 神经元的分离与培养 |
4.3.9 不同组Conditioned medium对OGD条件下神经元的处理 |
4.3.10 LDH释放检测神经元的损伤情况 |
4.3.11 TUNEL染色检测神经元的凋亡情况 |
4.3.12 细胞中蛋白的提取及浓度的测定 |
4.3.13 Western blot检测星形胶质细胞中相关蛋白的表达情况 |
4.4 结果与讨论 |
4.4.1 L-谷氨酰胺提升星形胶质细胞的增殖能力并减少氧化损伤 |
4.4.2 L-谷氨酰胺提升了内皮细胞的增殖能力 |
4.4.3 L-GLN-Astrocyte-CM促进神经元的存活 |
4.4.4 L-谷氨酰胺促进星形细胞内HSP70及相关蛋白表达 |
4.5 本章小结 |
第五章 结束语 |
5.1 全文总结 |
5.2 研究展望 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
(9)肾脑复元汤联合NSCs移植对MCAO大鼠HSP70、AIF表达的影响(论文提纲范文)
缩略词 |
中文摘要 |
Abstract |
第一章 前言 |
第二章 材料与方法 |
1.实验动物 |
2.试剂与仪器 |
2.1 实验试剂 |
2.2 主要试剂配置 |
2.3 实验器材 |
3.实验方法 |
3.1 MCAO大鼠模型的制备 |
3.2 中药制备 |
3.3 NSCs的培养 |
3.4 NSCs特异性抗原(Nestin)鉴定 |
3.5 侧脑室移植 |
3.6 实验动物分组及处理 |
3.7 观察指标 |
4.统计学方法 |
第三章 结果 |
1.NSCs特异性抗原(Nestin)鉴定结果 |
2.神经功能缺损评分比较 |
3.脑梗死体积比较 |
4.免疫组化检测脑组织中HSP70、AIF蛋白表达 |
5.Western blot法检测脑组织中HSP70、AIF蛋白表达 |
第四章 讨论 |
1.对脑缺血再灌注损伤的认识 |
2.AIF及非caspase依赖细胞凋亡途经 |
3.HSP70过表达对缺血性中风的保护机制 |
4.NSCs移植治疗缺血性中风 |
5.中风的病因病机及“肾脑同治”理论 |
5.1 中风病因病机 |
5.2 “肾脑同治”理论 |
6.肾脑复元汤组方原理 |
7.关于本实验结果的讨论 |
第五章 结论 |
参考文献 |
致谢 |
文献综述 |
参考文献 |
(10)抑制RIP1激酶增强缺血性星形胶质细胞溶酶体膜稳定性的作用及其依赖Hsp70.1B调节的机制(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
前言 |
一、研究背景 |
二、本课题的研究内容 |
三、本课题的创新点 |
四、本课题的研究意义和价值 |
材料和方法 |
1.实验动物 |
2.主要试剂 |
3.主要仪器 |
4.溶液配制 |
5.动物实验 |
6.细胞实验 |
7.统计分析 |
第一部分 RIP1K在大脑皮层、星形胶质细胞和神经元中的表达和分布 |
结果 |
1.RIP1K在大脑皮层、星形胶质细胞和神经元中的表达和分布 |
小结 |
第二部分 RIP1K基因敲低增加缺血性星形胶质细胞溶酶体膜稳定性 |
结果 |
1.RIP1K基因敲低增加大鼠大脑皮层缺血性星形胶质细胞溶酶体膜的稳定性 |
2.RIP1K基因敲低增加OGD模型中星形胶质细胞溶酶体膜稳定性 |
小结 |
第三部分 RIP1K基因敲低进一步促进缺血性星形胶质细胞溶酶体膜上Hsp70.1B的表达 |
结果 |
1.RIP1K基因敲低促进OGD诱导的缺血性星形胶质细胞溶酶体膜Hsp70.1B的表达 |
2.RIP1K基因敲低促进pMCAO诱导的的缺血性星形胶质细胞溶酶体膜Hsp70.1B的表达 |
小结 |
第四部分 Hsp70.1B具有溶酶体膜稳定性作用,对缺血性脑损伤具有保护作用 |
结果 |
1.Hsp70.1B对pMCAO诱导的缺血性脑损伤具有保护作用 |
2.慢病毒转染后Hsp70.1B基因敲低可进一步增加OGD诱导的星形胶质细胞溶酶体膜的通透性,此外拮抗Nec-1对溶酶体具有保护作用 |
小结 |
第五部分 RIP1K基因敲低后通过Hsp90和Hsf1调控Hsp70.1B的表达 |
结果 |
1.RIP1K基因敲低进一步降低缺血性星形胶质细胞细胞质内Hsp90的表达,同时促进Hsf1入核 |
2.RIP1K基因敲低进一步减少OGD诱导的星形胶质细胞Hsp90的表达,促进Hsf1入核 |
小结 |
第六部分 RIP1K基因敲低对缺血性星形胶质细胞中μ-Calpain的表达无明显影响 |
结果 |
1.RIP1K基因敲低对pMCAO大鼠脑皮层缺血区μ-Calpain的表达无明显影响 |
2.RIP1K基因敲低对OGD诱导的的缺血性星形胶质细胞μ-Calpain表达无显着影响 |
小结 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
英文缩写词表 |
攻读硕士学位期间公开发表的论文 |
攻读学位期间科研情况 |
致谢 |
四、The protection effectiveness of the expression of heat shock protein on ischemic brain damage(论文参考文献)
- [1]丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析[J]. 许雯珊,江萍利,刘雨露,丁妍怡,余燕,杨敏光,柳维林,陈立典. 中国组织工程研究, 2022(23)
- [2]血浆外泌体作为药物载体的制备及其对脑缺血再灌注损伤保护机制研究[D]. 蒋怡冰. 锦州医科大学, 2021(01)
- [3]在慢性缺氧条件下Hsp27对脑血管内皮细胞的保护作用研究[D]. 胡杨. 大连医科大学, 2021(01)
- [4]基于AMPK/mTOR/ULK1通路探讨自噬在缺血性脑损伤中的作用及丹酚酸B的神经保护机制[D]. 辛美萤. 吉林大学, 2020(08)
- [5]沉默SNHG12后BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 李远志. 南方医科大学, 2020(01)
- [6]补阳还五汤通过Connexin43介导大鼠脑缺血再灌注后血管新生[D]. 周颖. 广州中医药大学, 2019(04)
- [7]基于网络药理学探索当归芍药散对缺血性中风的作用机制研究[D]. 罗云霞. 广州中医药大学, 2019(03)
- [8]L-谷氨酰胺促进小鼠脑缺血损伤后修复的作用研究[D]. 罗龙龙. 上海交通大学, 2019(06)
- [9]肾脑复元汤联合NSCs移植对MCAO大鼠HSP70、AIF表达的影响[D]. 尹美美. 湖南中医药大学, 2018(01)
- [10]抑制RIP1激酶增强缺血性星形胶质细胞溶酶体膜稳定性的作用及其依赖Hsp70.1B调节的机制[D]. 倪勇. 苏州大学, 2018(12)